慢性疼痛的表觀遺傳調(diào)節(jié)機制—DNA轉(zhuǎn)甲基酶DNMT3a通過抑制Kcna2在DRG中的表達參與神經(jīng)病理性疼痛

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慢性疼痛的表觀遺傳調(diào)節(jié)機制—DNA轉(zhuǎn)甲基酶DNMT3a通過抑制Kcna2在DRG中的表達參與神經(jīng)病理性疼痛

神經(jīng)損傷誘導(dǎo)了背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion, DRG）中的神經(jīng)元基因轉(zhuǎn)錄發(fā)生變化，這可能會造成神經(jīng)性疼痛的發(fā)生,而DNA的甲基化能夠抑制基因的表達。本研究發(fā)現(xiàn)：外周神經(jīng)損傷通過活化八聚體轉(zhuǎn)錄因子1可以增加DRG神經(jīng)元中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3a的表達。如果阻斷這種改變可以阻止電壓依賴性鉀離子（Kv）通道亞單位Kcna2啟動子區(qū)的DNA甲基化發(fā)生，進而抑制神經(jīng)損傷誘發(fā)的DRG中的Kcna2表達降低，從而抑制神經(jīng)病理性疼痛。相反，即使沒有神經(jīng)損傷，在DRG中上調(diào)DNMT3a的表達，也可以降低Kcna2的表達，減少Kv電流，增加了DRG神經(jīng)元興奮性并導(dǎo)致脊髓中樞敏化，誘發(fā)動物出現(xiàn)神經(jīng)病理性疼痛的癥狀。這些發(fā)現(xiàn)表明在DRG神經(jīng)元中甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3a可能通過抑制Kcna2的表達，從而調(diào)控神經(jīng)病理性疼痛。

神經(jīng)病理性疼痛是一種多發(fā)性的慢性疼痛，僅在美國就有超過5 000萬的病人。神經(jīng)病理性疼痛的有效治療是世界性的難題，其中一個重要的原因就是其確切的發(fā)病機制尚不清楚。來自新澤西州立大學(xué)醫(yī)學(xué)院的陶元祥教授課題組的最新一篇文章表明，背根神經(jīng)節(jié)中鉀離子通道的表觀遺傳調(diào)控可能在神經(jīng)病理性疼痛的病理進程中發(fā)揮了重要作用。

控制靜息膜電位和DRG神經(jīng)元興奮性的電壓門控制通道被認為是神經(jīng)性疼痛發(fā)生的關(guān)鍵因素。以往的研究中，大部分疼痛研究者將目光聚焦在痛覺神經(jīng)元興奮性升高的“正向”信號上，例如鈉離子通道Nav1.7和Nav1.8的表達量上調(diào)及興奮性增強等，而關(guān)注痛覺信號中“負向”信號—電壓門控性的鉀離子通道等的研究相對比較少。周圍神經(jīng)損傷可以導(dǎo)致電壓門控制鉀離子通道的表達明顯下降，比如被Kcna2編碼的Kv1.2，在損傷DRG中轉(zhuǎn)錄和翻譯水平中均下降，提示Kv1.2可能參與了神經(jīng)性疼痛的形成。但是Kv1.2的下調(diào)是通過何種機制來實現(xiàn)，目前尚不清楚。

DNA甲基化是表現(xiàn)修飾的一種重要類型，它抑制基因的表達。DNA的甲基化首先是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)家族觸發(fā)的，包括DNMT1，DNMT3a和DNMT3b。一般而言，DNMT1的作用主要是維持已經(jīng)建立的基因組上DNA的甲基化，而DNMT3a和DNMT3b則被稱為從頭合成的甲基轉(zhuǎn)移酶，可以轉(zhuǎn)換已甲基化和未甲基化的DNA。DNA甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄的機制主要包括生理性阻礙轉(zhuǎn)錄因子之間的聯(lián)系和/或作為轉(zhuǎn)錄抑制子/輔助抑制子的停泊位點。雖然一些表觀遺傳調(diào)控機制（如組蛋白修飾和非編碼RNAs）近期已在動物模型中被證實與神經(jīng)病理性疼痛密切相關(guān)，甲基轉(zhuǎn)移酶DNMTs如何調(diào)控神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生仍然不清楚。

研究者本研究首先考察了周圍神經(jīng)損傷后DNMT3a在DRG中的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：周圍神經(jīng)損傷后DNMT3a而不是DNMT3b在DRG中表達增加。研究者通過TFSEARCH軟件，研究者在Dnmt3a基因的啟動子區(qū)定義了一段八聚體轉(zhuǎn)錄因子1 (OCT1)識別的結(jié)合序列。通過染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)試驗發(fā)現(xiàn)了在Dnmt3a基因啟動子區(qū)域中包含上述結(jié)合序列的片段(-499AATGACAT-442)。脊神經(jīng)結(jié)扎損傷能顯著增加Dnmt3a與該序列的結(jié)合活性。而在細胞實驗中，過表達OCT1能夠明顯增加Dnmt3a基因轉(zhuǎn)錄子活性。單細胞RT-PCR分析也證實了DRG神經(jīng)元中，Oct1 mRNA和Dnmt3a mRNA存在共表達。綜上以上數(shù)據(jù)，研究者認為OCT1在外周神經(jīng)損傷后促進了DRG Dnmt3a基因活性。

隨后研究者考察了抑制DRG 的DNMT3a能否改善神經(jīng)病理性疼痛。研究者構(gòu)建了包裹Dnmt3a shRNA的特異性AAV5病毒。無論是脊神經(jīng)結(jié)扎還是坐骨神經(jīng)結(jié)扎模型，小鼠注射AAV5-Dnmt3a shRNA后，其疼痛行為學(xué)反應(yīng)均被顯著改善?？紤]到shRNA可能的脫靶效應(yīng)，研究者用了另一個方法，使用Dnmt3a fl/ fl的小鼠，在脊神經(jīng)損傷手術(shù)前，將AAV5-Cre注射入同側(cè)的L4DRG中。注射了AAV5-Cre的Dnmt3a fl/ fl小鼠在造模以后，其疼痛程度明顯減輕。這個結(jié)果令人信服地證明，早期增加的DRG Dnmt3a對神經(jīng)性疼痛的發(fā)展是必需的。

研究者接著提出問題，DRG Dnmt3a的早期增長對神經(jīng)性疼痛的誘導(dǎo)是否是足夠？另一方面，如果在DRG中過表達 Dnmt3a是否會導(dǎo)致痛覺超敏。研究者將表達全長Dnmt3a的AAV5病毒注射入普通成年小鼠L4和L5的一側(cè)DRG中。四周后，Dnmt3a mRNA和蛋白質(zhì)表達量顯著增加，同時注射AAV5-Dnmt3a的小鼠的應(yīng)答機械刺激和冷熱刺激的后足收縮潛伏期均表現(xiàn)出顯著的降低。這種下降在注射后4周開始發(fā)生并持續(xù)至少8周。類似的結(jié)果在給小鼠L3-4單側(cè)DRG注射表達全長Dnmt3a的HSV病毒載體后同樣可觀察到。這些發(fā)現(xiàn)表明DRG中增加的Dnmt3a，在沒有神經(jīng)損傷時，就可以引起機械痛覺和冷熱痛覺過敏，誘發(fā)動物出現(xiàn)神經(jīng)病理性疼痛的臨床癥狀。這些行為學(xué)表現(xiàn)同時伴隨著脊髓背側(cè)角的中樞敏化證據(jù)。在HSV-Dnmt3a注射后6天，注射同側(cè)的脊髓背角中，磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(p-ERK)和膠原細胞原纖維酸性蛋白(GFAP)的水平顯著增加。這些數(shù)據(jù)均證明DRG中Dnmt3a的過度表達足以導(dǎo)致痛覺超敏反應(yīng)的發(fā)生。

在揭示了Dnmt3a與神經(jīng)病理性疼痛的相關(guān)性以后，研究者考察了DRG中Dnmt3a促進神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生的機制。研究者發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)損傷后DRG中Kcna2下調(diào)是疼痛形成的內(nèi)因。脊神經(jīng)結(jié)扎損傷后7天，在L5的DRG中注射AAV5-Dnmt3a shRNA能夠逆轉(zhuǎn)Kcna2 mRNA和蛋白質(zhì)的下降。同樣，Dnmt3a fl/ fl小鼠在外周神經(jīng)損傷后7天在損傷同側(cè)L4DRG注射AAV5-Cre，同樣恢復(fù)了損傷側(cè) DRG中Kcna2 mRNA和蛋白質(zhì)的表達水平。同時AAV5-Dnmt3a shRNA和AAV5-Cre都不影響外周神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的DRG中Kcna1和Kcna4 mRNA的減少。另一方面，L4和L5的DRG注入AAV5-Dnmt3a5周后， Kcna2 mRNA和蛋白質(zhì)的水平明顯下降。而Kcna1和Kcna4 的mRNA和蛋白質(zhì)表達并無明顯改變。考慮到Kcna2陽性的DRG神經(jīng)元中大約62.1%同樣看到DNMT3a陽性，所以很可能在DRG神經(jīng)元中DNMT3a直接調(diào)控了Kcna2的表達。研究者發(fā)現(xiàn)DRG神經(jīng)元中Dnmt3a的過表達，確實可以降低Kcna2 mRNA的水平。同時DRG神經(jīng)元Dnmt3a的下調(diào)也能夠增加Kcna2 mRNA的表達。這些證據(jù)均表明，在損傷側(cè)的DRG中，Dnmt3a參與了神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的Kcna2下調(diào)。同時研究者還利用ChIP試驗發(fā)現(xiàn)Dnmt3a與Kcna2基因啟動子的兩個區(qū)域結(jié)合（-663/-389bp和-491/-199bp）。重亞硫酸氫鈉焦磷酸測序試驗進一步證實在神經(jīng)損傷后，Kcna2基因的-457和-444 CpG區(qū)域DNA甲基化增加。這兩個區(qū)域可能與Kcna2轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)，因為Kcna2啟動子活性在-457和-444 CpG 區(qū)域去除后會顯著增加，Dnmt3a 的過度表達能顯著降低Kcna2啟動子的活性。這些發(fā)現(xiàn)表明DNMT3a誘導(dǎo)Kcna2啟動子區(qū)的-457和-444區(qū)域DNA甲基化與DRG神經(jīng)元中的Kcna2基因沉默有關(guān)系。

最后，研究者考察了了外周神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的DRG 中DNMT3a的增加是否會影響神經(jīng)元的Kv電流。注射AAV5-Dnmt3a病毒溶液后5～8周，DRG細胞被分離出來并且進行全細胞電壓鉗記錄來考察Kv電流。注射AAV5-DNMT3a組的大、中、小DRG神經(jīng)元的總體Kv電流密度場顯著下降。為了證實Kv電流下降是否由于Kcna2的下調(diào)，研究者使用選擇性的Kcna2抑制劑MTX來處理DRG細胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)測試電壓為+50 mV時，對照組用MTX處理后，大或中神經(jīng)元的總體Kv電流與MTX處理前相比，分別下降了28%和32%；但是DNMT3a注射組在用MTX處理后，大和中神經(jīng)元的總Kv電流與處理前相比只下降了13%。對照組和DNMT3a注射組的小型DRG神經(jīng)元的Kv電流不受MTX影響。這一證據(jù)表明，只有在大和中DRG神經(jīng)元中，Kcna2關(guān)聯(lián)的電流表現(xiàn)出明顯的下降。除了Kv電流，研究者還檢測了DRG神經(jīng)元的興奮性。在病毒注射后5～8天，進行了全細胞電壓鉗記錄。與對照組相比，DNMT3a注射組的大、中、小型神經(jīng)元的靜息膜電位分別增加了11.98，12.01和7.63 mV，而電流閾值分別降低了40%，49%和40%。更重要的是，在大型，中等和小型神經(jīng)元中，DNMT3a的注射使得被≥200 pA刺激所激活的電位數(shù)目顯著增加，盡管這種注射并不改變膜輸入電阻或其他動作電位參數(shù)，如振幅，閾值，持續(xù)時間，過沖，后超級化振幅等。這些數(shù)據(jù)表明在DNMT3a過表達會導(dǎo)致DRG神經(jīng)元興奮性顯著增加。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了周圍神經(jīng)損傷會通過激活轉(zhuǎn)錄因子OCT1促進DRG神經(jīng)元中的DNMT3a表達增加。這種增加與Kcna2啟動子區(qū)中部分CpG區(qū)域中DNA離度甲基化密切相關(guān)，也與Kcna2表達下調(diào)密切相關(guān)。考慮到DRG Kcna2下調(diào)促進了神經(jīng)性疼痛的形成，DNMT3a在神經(jīng)病理性疼痛的進程中發(fā)揮了重要作用。不過研究者也指出，周圍神經(jīng)損傷可能通過多種機制來促進DRG中Kcna2的下調(diào)。除了目前研究中已顯示的DNMT3a的作用以及已經(jīng)揭示的內(nèi)源性非編碼Kcna2 反義RNA的作用外，陶教授組的研究還證實，G9a觸發(fā)的組蛋白甲基化在損傷DRG中也參與神經(jīng)損傷誘導(dǎo)性Kcna2沉默。這些表觀機制如何共同協(xié)作來調(diào)節(jié)Kcna2的表達以及它們在神經(jīng)損傷時是否相互聯(lián)系/或影響其它靶點，目前現(xiàn)在還不清楚。同時值得注意的是，DNMT3a在其他組織也有表達，所以除了Kcna2之外，DNMT3a還可能靶向其他基因。因此，DNMT3a抑制劑所造成的潛在副作用需要進一步仔細探究。

(Jian-Yuan Zhao, Ling-li Liang, Xi-yao Gu,et al.DNA methyltransferase DNMT3a contributes to neur-opathic pain by repressing Kcna2 in primaryafferent neurons.nature communication,2017, 8.DOI: 10.1038/ncomms14712.劉文濤 譯 高永靜 校)

10.3969/j.issn.1006-9852.2017.08.003