17β-雌二醇對(duì)巖溶稻田土壤微生物群落的影響

黃雅丹，靳振江，李強(qiáng)，劉暢

1.桂林醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西 桂林 541004；2.中國地質(zhì)科學(xué)院巖溶地質(zhì)研究所，廣西 桂林 541004；

3.聯(lián)合國教科文組織國際巖溶研究中心，廣西 桂林 541004；4.桂林理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，廣西 桂林 541004

17β-雌二醇對(duì)巖溶稻田土壤微生物群落的影響

黃雅丹1，靳振江2,4，李強(qiáng)2,3*，劉暢2

1.桂林醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西 桂林 541004；2.中國地質(zhì)科學(xué)院巖溶地質(zhì)研究所，廣西 桂林 541004；

3.聯(lián)合國教科文組織國際巖溶研究中心，廣西 桂林 541004；4.桂林理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，廣西 桂林 541004

為明確17β-雌二醇對(duì)巖溶區(qū)稻田土壤生態(tài)系統(tǒng)微生物多樣性-穩(wěn)定性關(guān)系的影響，通過17β-雌二醇室內(nèi)添加模擬實(shí)驗(yàn)，采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)和聚合酶鏈反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳法研究有氧和厭氧條件下細(xì)菌和真菌豐度及多樣性變化。結(jié)果表明，（1）0.05 mg?kg-1和0.20 mg?kg-117β-雌二醇對(duì)巖溶稻田土壤微生物豐度具有一定的表觀刺激效應(yīng)，這種表觀刺激效應(yīng)在厭氧條件下尤為顯著。巖溶稻田土壤細(xì)菌和真菌總拷貝數(shù)及歸一化結(jié)果進(jìn)一步顯示，17β-雌二醇的添加量為0.05 mg?kg-1時(shí)，巖溶稻田土壤微生物豐度最高，這可能是巖溶稻田土壤微生物對(duì)17β-雌二醇產(chǎn)生應(yīng)急反應(yīng)的一個(gè)重要應(yīng)答點(diǎn)。（2）在厭氧培養(yǎng)條件下，巖溶稻田土壤細(xì)菌和真菌均勻度指數(shù)與其豐度呈現(xiàn)相反的變化趨勢。盡管17β-雌二醇能夠促進(jìn)少數(shù)厭氧微生物種屬及其數(shù)量的增加，但整體上降低了巖溶稻田土壤微生物系統(tǒng)的多樣性和穩(wěn)定性。（3）培養(yǎng)條件與微生物群落的雙因素方差分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，土壤通氣狀況（有氧和厭氧）是影響巖溶稻田土壤微生物群落穩(wěn)定性的極顯著因素。這說明，定期對(duì)巖溶稻田進(jìn)行翻耕、曬田或水-旱交替耕作能夠促進(jìn)巖溶稻田土壤中17β-雌二醇的降解，降低厭氧微生物活性，緩解17β-雌二醇對(duì)巖溶稻田土壤微生物帶來的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，從而為巖溶區(qū)稻作農(nóng)業(yè)生產(chǎn)管理提供技術(shù)支持。

17β-雌二醇；土壤通氣狀況；微生物豐度；微生物多樣性

具有雌激素效應(yīng)的17β-雌二醇能夠干擾生物體內(nèi)分泌物質(zhì)的合成、釋放、運(yùn)輸、結(jié)合、代謝等過程，以此激活或抑制生物體的內(nèi)分泌系統(tǒng)（Bechi et al.，2013）。加之17β-雌二醇在水中的溶解度很低，極性相對(duì)較低，極易被水體底泥和土壤吸附，且很難再移動(dòng)，因此，即使17β-雌二醇質(zhì)量濃度低至ng?L-1級(jí)時(shí)仍對(duì)生態(tài)環(huán)境具有極大的風(fēng)險(xiǎn)，為此《斯德哥爾摩公約》將其列為禁止使用和限制使用的持久性有機(jī)污染物（聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署，2001）。

17β-雌二醇廣泛存在于市政污水及家畜糞便中，直接或間接排入河流的17β-雌二醇將會(huì)對(duì)環(huán)境造成不同程度的污染。譬如，在湖北、黑龍江等畜禽養(yǎng)殖大省，部分河流中的17β-雌二醇質(zhì)量濃度高達(dá)29 ng?L-1（邵曉玲等，2008），相對(duì)而言，珠江水域沉積物中的17β-雌二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化范圍則在0.9～2.6 ng?g-1之間（Gong et al.，2011；龔劍等，2011）。在國外，17β-雌二醇對(duì)水環(huán)境造成的污染形勢也不可小覷，Kolpin et al.（2002）通過調(diào)查美國30個(gè)州139個(gè)地表水樣，發(fā)現(xiàn)將近40%的地表水受到17β-雌二醇不同程度的污染，而Kuch et al.（2001）在德國南部的一些飲用水中檢測到的17β-雌二醇質(zhì)量濃度為0.2～2.1 ng?L-1。大量毒理實(shí)驗(yàn)表明，環(huán)境中的17β-雌二醇能夠影響某些魚類的內(nèi)分泌系統(tǒng)及其生殖能力，甚至引起雄魚雌性化（陳家長等，2012），并且也能顯著抑制水體微生物的反硝化作用（吳偉恒等，2014）。此外，趙穎等（2014）12-14通過模擬實(shí)驗(yàn)證明當(dāng)17β-雌二醇在環(huán)境中的質(zhì)量濃度不超過0.5 ng?L-1時(shí)，能提高水體產(chǎn)甲烷微生物的活性，導(dǎo)致水體甲烷釋放強(qiáng)度增加；而當(dāng)17β-雌二醇質(zhì)量濃度為1.0～10.0 ng?L-1時(shí)則對(duì)水體產(chǎn)甲烷微生物活性產(chǎn)生抑制效應(yīng)。

稻作農(nóng)業(yè)是保證我國糧食安全的主要支撐，由于水稻整個(gè)生育期都需要維持一定的水位，因此在水資源分配不均勻的巖溶區(qū)不得不對(duì)稻田進(jìn)行污水灌溉（陳曉鋒等，2009），然而含17β-雌二醇污水對(duì)稻田土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)的影響研究目前尚未涉及。為此，本實(shí)驗(yàn)在有氧及厭氧培養(yǎng)條件下，采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction，qPCR）和聚合酶鏈反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳（Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，PCR-DGGE）法研究不同添加量的17β-雌二醇對(duì)巖溶稻田土壤微生物群落的影響，以期為評(píng)價(jià)環(huán)境殘留的17β-雌二醇對(duì)巖溶稻田土壤微生物造成的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)土壤

培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)所需稻田土壤采自桂林會(huì)仙巖溶濕地0～20 cm土層，利用總有機(jī)碳分析儀TOC-V（日本島津）測得土壤有機(jī)碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22.33 mg?kg-1，利用inoLab? pH 7110實(shí)驗(yàn)室臺(tái)式pH測試儀（德國WTW）測得土壤pH為7.91。土樣采集期，該區(qū)晝夜氣溫21～30 ℃。采集的新鮮土樣過10 mm篩，用濕紗布蓋在土表于室溫下放置3 d，待微生物活化后，加入配好的17β-雌二醇溶液，添加到土壤中的17β-雌二醇分別為0（CK）、0.05、0.10、0.20、0.40 mg?kg-1，并用去離子水調(diào)節(jié)土壤濕度至40%，分別模擬稻田水、旱條件進(jìn)行有氧和厭氧（厭氧培養(yǎng)箱）處理，在25 ℃下恒溫培養(yǎng)30 d后進(jìn)行后續(xù)分析。同一處理?xiàng)l件設(shè)有3個(gè)平行樣。

1.2 測定方法

1.2.1 土壤微生物DNA的提取

稱取0.25 g土壤樣品，采用美國MOBIO土壤強(qiáng)力DNA提取試劑盒提取土壤微生物總DNA，利用Quawell 5000微量紫外分光光度計(jì)測定其濃度和純度，保存于-80 ℃冰箱。

1.2.2 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

為獲取16S rRNA基因拷貝數(shù)，將提取的土壤微生物DNA作為qPCR模板，采用對(duì)大多數(shù)細(xì)菌具有特異性的引物對(duì)338F/518R（5′-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3′，5′-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3′）進(jìn)行擴(kuò)增（Muyzer et al.，1993）696-699。25 μL反應(yīng)體系為：5 ng?μL-1土壤微生物DNA模板1 μL，Green-2-Go qPCR Mastermix（上海生工）12.5 μL，去離子無菌水9.5 μL，10 μmol?μL-1的338F/518R引物各1 μL。qPCR反應(yīng)程序設(shè)定如下：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，39個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min，擴(kuò)增效率90%～105%，R2＞0.99。

為獲取18S rRNA基因拷貝數(shù)，將提取的土壤微生物DNA作為qPCR模板，采用對(duì)真菌具有特異性的引物對(duì)Fungi/NSI（5′-ATT CCC CGT TAC CCG TTG-3′，5′-GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3′）進(jìn)行擴(kuò)增（May et al.，2003）。25 μL反應(yīng)體系為：5 ng?μL-1土壤微生物DNA模板1 μL，Green-2-Go qPCR Mastermix（上海生工）12.5 μL，去離子無菌水9.5 μL，10 μmol?μL-1的Fungi/NSI引物各1 μL。qPCR反應(yīng)程序設(shè)定如下：95 ℃預(yù)變性15 min，95 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，39個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min，擴(kuò)增效率90%～105%，R2＞0.99。

每克干土中的16S rRNA和18S rRNA基因拷貝數(shù)即為細(xì)菌和真菌豐度。

1.2.3 土壤微生物群落分析

利用細(xì)菌F968/R1401引物對(duì)（5′-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAA CGC GAA GAA CCT TAC-3′，5′-CGG TGT GTA CAA GAC CC-3′）對(duì)土壤微生物DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增（靳振江等，2014b）4286。25 μL反應(yīng)體系為：5 ng?μL-1土壤微生物DNA模板1 μL，Taq PCR Master Mix（上海生工）12.5 μL，去離子無菌水9.5 μL，10 μmol?μL-1的F968/R1401引物各1 μL；擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

在真菌正向引物Fungi 5′端添加GC夾子（5′-CCG CCG CGC GGC GGG CGG GGC GGG GGC ACG GGG-3′）后，將NSI作為反向引物對(duì)土壤DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增（靳振江等，2014b）4286。25 μL反應(yīng)體系為：5 ng?μL-1土壤微生物DNA模板1 μL，Taq PCR Master Mix（上海生工）12.5 μL，去離子無菌水9.5 μL，10 μmol?μL-1的正向引物和反向引物各1 μL；擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性15 min，91 ℃變性1 min，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)，然后在68 ℃完全延伸10 min。

以上PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，檢測條帶清晰無拖尾表示擴(kuò)增結(jié)果良好，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳分析。細(xì)菌和真菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均采用8%的聚丙烯酰胺凝膠，變性劑濃度自下至上分別為55%～70%和15%～35%，并分別在60 ℃、100 V和60 ℃、90 V恒定電壓下電泳9 h，經(jīng)銀染后利用Gel-Doc-2000凝膠影像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad）拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

細(xì)菌和真菌豐度歸一化參照文獻(xiàn)中的方法（李強(qiáng)等，2014），將不同培養(yǎng)條件下的16S rRNA和18S rRNA基因拷貝數(shù)加和后分別進(jìn)行歸一化處理，計(jì)算公式為：

式中，xi為細(xì)菌和真菌在17β-雌二醇不同添加量下的基因拷貝數(shù)。

16S rRNA、18S rRNA的變性梯度凝膠拍照后，采用美國Bio-Rad公司的Imange lab分析軟件捕獲圖像進(jìn)行多樣性分析。多樣性指數(shù)的計(jì)算方法如下（靳振江等，2014b）4286：

香農(nóng)-維納多樣性指數(shù)：

Margalef豐富度指數(shù)：

均勻度指數(shù)：

式中，S為OTUs總數(shù)，即條帶數(shù)；N為泳道中OTU的總亮度峰值；ni為第i個(gè)OTU在所有克隆中的比值。

圖1 不同培養(yǎng)條件下16S rRNA、18S rRNA基因豐度Fig.1 Abundances of paddy soil bacteria and fungus under different treatment

此外，利用SPSS軟件對(duì)巖溶稻田土壤微生物數(shù)據(jù)進(jìn)行雙因素方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同培養(yǎng)條件對(duì)巖溶稻田土壤細(xì)菌和真菌豐度的影響

在有氧培養(yǎng)條件下，巖溶稻田土壤細(xì)菌豐度為每克土壤1.180～2.240×1011copies，真菌豐度為每克土壤2.672～6.313×107copies；而在厭氧培養(yǎng)條件下，巖溶稻田土壤細(xì)菌豐度為每克土壤4.092～10.396×1011copies，真菌豐度為每克土壤0.204～0.395×107copies（圖1）。具有較高有機(jī)碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值的巖溶水稻土對(duì)17β-雌二醇具有良好的吸附作用（Lai et al.，2000；靳振江等，2014a；李沛辰等，2015），為此吸附在土壤顆粒表面的17β-雌二醇在有氧條件下的降解速率高于厭氧條件（20 ℃時(shí)，有氧條件下為0.120 g?h-1?L-1，厭氧條件下為0.057 g?h-1?L-1）（何芳等，2012），降解速率亦與微生物數(shù)量密切相關(guān)。此外，鑒于一定量的17β-雌二醇對(duì)厭氧微生物的生長具有促進(jìn)作用（趙穎等，2014）12-14，因此，受17β-雌二醇在不同供氧條件下降解速率的影響，在同一質(zhì)量分?jǐn)?shù)的17β-雌二醇暴露條件下，巖溶稻田土壤細(xì)菌豐度在有氧培養(yǎng)條件下普遍低于厭氧培養(yǎng)條件（圖1a）。而巖溶稻田土壤真菌豐度在有氧培養(yǎng)條件下普遍高于厭氧培養(yǎng)條件（圖1b），加之絕大多數(shù)真菌都是專性好氧菌，這一研究結(jié)果與熊鴻焰等（2009）認(rèn)為稻田水作造成真菌質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低的結(jié)果相一致。

此外，通過圖1(a)還可看出，巖溶稻田土壤細(xì)菌豐度在17β-雌二醇的添加量為0.05 mg?kg-1和0.10 mg?kg-1時(shí)均高于對(duì)照組，并在厭氧培養(yǎng)條件下具有顯著性差異；而當(dāng)添加量為0.40（有氧）、0.20（厭氧）、0.40（厭氧）mg?kg-1時(shí)其細(xì)菌豐度則低于對(duì)照組。這是因?yàn)?，厭氧條件下，低量的17β-雌二醇能夠提高厭氧微生物產(chǎn)甲烷活性，而高量的17β-雌二醇則對(duì)厭氧微生物產(chǎn)甲烷活性產(chǎn)生抑制效應(yīng)（趙穎等，2014）12-14。加之17β-雌二醇作為雌激素對(duì)真菌菌絲體定向生長具有一定的促進(jìn)作用（郭堅(jiān)華等，1995），因此巖溶稻田土壤在面臨不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的17β-雌二醇暴露風(fēng)險(xiǎn)時(shí)其真菌豐度均高于對(duì)照組（圖1b）。由此說明，改善巖溶稻田土壤通氣狀況能夠降低17β-雌二醇對(duì)厭氧微生物的影響，并能緩解甲烷釋放速率。

通常土壤細(xì)菌占土壤微生物總數(shù)的70%～90%（陳文新，1996），并對(duì)土壤微生物數(shù)量具有絕對(duì)控制作用。有氧和厭氧培養(yǎng)條件下巖溶稻田土壤細(xì)菌和真菌總拷貝數(shù)及歸一化結(jié)果顯示：17β-雌二醇的添加量為0.05 mg?kg-1時(shí)，巖溶稻田土壤微生物豐度最高（表1），這可能是巖溶稻田土壤微生物對(duì)17β-雌二醇產(chǎn)生應(yīng)急反應(yīng)的一個(gè)重要應(yīng)答點(diǎn)。

2.2 不同培養(yǎng)條件下巖溶稻田土壤細(xì)菌和真菌群落多樣性特征

DGGE技術(shù)能夠直觀反映自然界微生物群落遺傳多樣性，對(duì)評(píng)價(jià)土壤環(huán)境變化具有重要的指導(dǎo)作用（Muyzer et al.，1993）696-699。根據(jù)電泳圖譜中每條條帶的信息，通過綜合分析各實(shí)驗(yàn)組中細(xì)菌和真菌的香農(nóng)-維納指數(shù)、豐富度指數(shù)和均勻度指數(shù)，得知：厭氧培養(yǎng)條件下，細(xì)菌的香農(nóng)-維納指數(shù)和豐富度指數(shù)均高于對(duì)照組，均勻度指數(shù)則低于對(duì)照組，而真菌的香農(nóng)-維納指數(shù)、豐富度指數(shù)和均勻度指數(shù)均低于對(duì)照組；有氧培養(yǎng)條件下，細(xì)菌和真菌的香農(nóng)-維納指數(shù)除在17β-雌二醇的添加量為0.40 mg?kg-1時(shí)高于對(duì)照組外，其它條件下均低于對(duì)照組，并且其豐富度指數(shù)和均勻度指數(shù)均沒有明顯的變化規(guī)律（表2）。由此說明通氣狀況（有氧或厭氧）以及17β-雌二醇的添加量能影響巖溶稻田土壤生態(tài)系統(tǒng)的微生物多樣性。

在厭氧培養(yǎng)條件下，針對(duì)不同量的17β-雌二醇添加實(shí)驗(yàn)，巖溶稻田土壤細(xì)菌豐度與其香農(nóng)-維納指數(shù)和豐富度指數(shù)總體上呈現(xiàn)一致的變化趨勢，但與其均勻度指數(shù)呈現(xiàn)相反的變化趨勢；巖溶稻田土壤真菌豐度與其3種多樣性指數(shù)總體上呈現(xiàn)相反的變化趨勢（圖1，表3）。由于均勻度與物種數(shù)目無關(guān)，只與個(gè)體數(shù)目在各個(gè)物種中分布的均勻程度有關(guān)，故群落中的常見種與稀少種的差距逐漸變小，整個(gè)群落向著物種均勻化方向發(fā)展（賀紀(jì)正等，2013）414-416。盡管17β-雌二醇能夠促進(jìn)少數(shù)微生物（細(xì)菌，特別是產(chǎn)甲烷菌）種屬及其數(shù)量的增加，但厭氧培養(yǎng)條件下巖溶稻田土壤細(xì)菌和真菌均勻度的降低則表明17β-雌二醇對(duì)巖溶稻田土壤微生物產(chǎn)生了抑制作用，這種抑制作用不但降低了巖溶稻田土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性（賀紀(jì)正等，2013）415，而且將加劇巖溶稻田在淹水期間的甲烷排放量（秦曉波等，2012），進(jìn)而影響全球變化。

表1 不同培養(yǎng)條件下巖溶稻田土壤微生物豐度Table 1 Abundances of karst paddy soil microbes under different treatment

表2 不同培養(yǎng)條件下基于巖溶稻田土壤16S rRNA、18S rRNA DGGE圖譜的微生物多樣性指數(shù)Table 2 The karst paddy soil microbial diversity based on the DGGE profile of 16S rRNA and 18S rRNA under different treatment

表3 土壤通氣狀況、17β-雌二醇添加量及其交互作用與16S rRNA、18S rRNA基因豐度雙因素方差分析Table 3 Two-way analysis of variance relating to experimental condition and the abundances of kart paddy soil bacteria and fungus

在有氧條件下，17β-雌二醇通常被微生物脫氫氧化為雌激素酮（何芳等，2008）1962-1964，而雌激素酮具有較長的半衰期并更容易在微生物體內(nèi)積累（何芳等，20081963-1965；王代懿等，2014）。因此，在有氧條件下，17β-雌二醇添加量為0.05、0.10、0.20 mg?kg-1時(shí)的巖溶稻田土壤細(xì)菌和真菌具有較低的香農(nóng)-維納指數(shù)，而細(xì)菌和真菌豐度與其香農(nóng)-維納指數(shù)呈現(xiàn)相反的變化趨勢。由于土壤中高添加量（0.40 mg?kg-1）的17β-雌二醇在有氧條件下降解不完全，因此巖溶稻田土壤細(xì)菌和真菌在17β-雌二醇和雌激素酮的交互作用下具有較高的香農(nóng)-維納指數(shù)。

土壤中絕大多數(shù)真菌都是專性好氧菌（靳振江等，2014b）4289，受氧氣體積分?jǐn)?shù)的限制以及17β-雌二醇的抑制作用，巖溶稻田土壤真菌的3種多樣性指標(biāo)在有氧培養(yǎng)條件下均高于厭氧培養(yǎng)條件（表2）。此外，由于目前已知能夠降解17β-雌二醇的微生物大部分為細(xì)菌（Li et al.，2012；方會(huì)等，2012），加之17β-雌二醇在厭氧條件下能夠提高厭氧微生物的活性，因此，除香農(nóng)-維納指數(shù)外，巖溶稻田土壤細(xì)菌的其它兩種多樣性指標(biāo)總體上表現(xiàn)出有氧條件＞厭氧條件（表2）。

綜上所述，巖溶稻田土壤微生物的均勻度在維持巖溶稻田土壤生態(tài)系統(tǒng)微生物多樣性-穩(wěn)定性關(guān)系上具有重要的指示作用。因此，本研究結(jié)果表明，在17β-雌二醇暴露環(huán)境中，均勻度指數(shù)能夠作為水、旱交替條件下巖溶稻田土壤微生物群落特性變化的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

2.3 不同培養(yǎng)條件與巖溶稻田土壤微生物群落的雙因素方差分析

采用F檢驗(yàn)對(duì)本實(shí)驗(yàn)所涉及的土壤通氣狀況（有氧、厭氧）、17β-雌二醇添加量、細(xì)菌和真菌豐度進(jìn)行雙因素方差分析，結(jié)果如表3所示。巖溶稻田土壤通氣狀況（有氧/厭氧）和17β-雌二醇添加量對(duì)巖溶稻田土壤細(xì)菌豐度有極顯著影響，而其交互作用對(duì)巖溶稻田土壤細(xì)菌豐度有顯著影響；土壤通氣狀況（有氧/厭氧）對(duì)巖溶稻田土壤真菌豐度也產(chǎn)生極顯著影響，但17β-雌二醇添加量及其與土壤通氣狀況的交互作用對(duì)巖溶稻田土壤真菌豐度影響不顯著。

土壤通氣狀況（有氧、厭氧）能夠?qū)r溶稻田土壤細(xì)菌和真菌豐度產(chǎn)生極顯著影響，可能與17β-雌二醇的生物降解特性有關(guān)。在有氧條件下，17β-雌二醇的降解速率高于厭氧條件（何芳等，2008）1963-1965并符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)（反應(yīng)速率常數(shù)0.23～4.79）（Li et al.，2005）。此外，17β-雌二醇在有氧條件下能夠?yàn)橥寥乐械腗n（Ⅳ）或Fe（Ⅲ）提供電子，自身被氧化成雌激素酮（Oscarson et al.， 1981），最終被微生物降解。而Lee et al.（2002）在有氧和厭氧條件下利用活性污泥處理17β-雌二醇，發(fā)現(xiàn)水體中17β-雌二醇質(zhì)量濃度為200 μg?L-1時(shí)幾乎能完全被降解掉。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明改善巖溶區(qū)稻田土壤通氣狀況，定期對(duì)稻田進(jìn)行翻耕、曬田或水-旱輪作能夠降低17β-雌二醇對(duì)土壤微生物及生態(tài)環(huán)境帶來的危害。

3 結(jié)論

（1）17β-雌二醇對(duì)巖溶稻田土壤微生物的生長具有一定的表觀刺激效應(yīng)，這種表觀刺激效應(yīng)在厭氧條件下極顯著。

（2）17β-雌二醇在促進(jìn)巖溶稻田厭氧微生物活性的同時(shí)，降低了巖溶稻田土壤微生物系統(tǒng)的抵抗力和恢復(fù)力，進(jìn)而降低了巖溶稻田土壤生態(tài)系統(tǒng)微生物的多樣性及其穩(wěn)定性。

（3）定期對(duì)巖溶區(qū)的稻田進(jìn)行翻耕、曬田或水-旱輪作能夠促進(jìn)17β-雌二醇的降解性能，進(jìn)而緩解17β-雌二醇對(duì)巖溶稻田土壤微生物造成的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。

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Responses of Karst Paddy Soil Microbial Community Structure to 17β-estradiol in the Simulated Experiments

HUANG Yadan1, JIN Zhenjiang2,4, LI Qiang2,3, LIU Chang2
1.Graduate School of Guilin Medical University, Guilin 541004, China; 2.Institute of Karst Geology, Chinese Academy of Geological Sciences, Guilin 541004, China; 3.International Research Center on Karst under the Auspices of UNESCO, Guilin 541004, China; 4.Environmental Science and Engineering College, Guilin University of Technology, Guilin 541004, China

To understand the risk of 17β-estradiol on the microbial diversity-stability relationship in the karst paddy soil, the exogenous 17β-estradiol with the content of 0, 0.05, 0.10, 0.20, 0.40 mg?kg-1was added to the karst paddy soil.Moreover, the soil was cultured in the aerobic or anaerobic condition.At the end of the culture, Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction and Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis methods were applied to analyze the karst paddy soil microbial abundance and diversity.17β-estradiol (0.05 mg?kg-1and 0.10 mg?kg-1) has the apparent stimulatory effects on the abundances of karst paddy soil bacteria and fungus under different treatment, which is quite significant in the anaerobic condition.Moreover, according to the normalized karst paddy soil bacteria and fungus abundances, it was inferred that one of the critical and emergency response point from 17β-estradiol to karst paddy soil microbes is 0.05 mg?kg-1.In the anaerobic condition, the species evenness of karst paddy soil bacteria and fungus is lower than the control group and also has the opposite change with their abundance.In the aerobic condition, 17β-estradiol can be degraded.The karst paddy soil microbial diversity has no clear variation in the aerobic condition.Though some anaerobic microorganisms were increased, the karst paddy soil microbial abundance and diversity were depressed.Moreover, the two-way analysis of variance relating to experimental condition and the abundances of karst paddy soil bacteria proved that the soil aeration condition is the controlling factor for karst paddy soil microbial community.From the results, it can be inferred that tillage, sunning the fields or waterlog-drought rotation can improve the degradation rate of 17 β-estradiol in the karst paddy soil, which decreased the anaerobic microbe activity and their methanogenic function.Therefore, the eco-environmental risk for karst paddy soil microbe from 17β-estradiol will be reduced.

17β-estradiol; soil aeration condition; microbial abundance; microbial diversity

10.16258/j.cnki.1674-5906.2016.10.018

X172; P593

A

1674-5906（2016）10-1721-06

黃雅丹, 靳振江, 李強(qiáng), 劉暢.2016.17β-雌二醇對(duì)巖溶稻田土壤微生物群落的影響[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào), 25(10): 1721-1726.

HUANG Yadan, JIN Zhenjiang, LI Qiang, LIU Chang.2016.Responses of Karst paddy soil microbial community structure to 17β-estradiol in the simulated experiments [J].Ecology and Environmental Sciences, 25(10): 1721-1726.

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題（2016YFC0502501）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41641026；41361054）；廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2015GXNSFGA139010；2014GXNSFCA118012）；廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（桂科合14123001-13）；中國地質(zhì)科學(xué)院項(xiàng)目（YYWF201505）；桂林市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（20140122-1）

黃雅丹（1980年生），女，助理研究員，碩士，主要從事環(huán)境生物學(xué)研究。*通信作者。李強(qiáng)，E-mail: glqiangli@163.com

2016-08-12