海南紅樹林濕地可培養(yǎng)硫酸鹽還原菌的垂直分布特征研究

丁 海，姚素平，劉桂建，劉常宏

1.安徽省煤田地質(zhì)局勘查研究院，合肥230088；2.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)地球與空間科學(xué)學(xué)院，合肥230026；3.南京大學(xué)地球科學(xué)與工程學(xué)院，南京210023；4.南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京210093

海南紅樹林濕地可培養(yǎng)硫酸鹽還原菌的垂直分布特征研究

丁 海1,2，姚素平3*，劉桂建2，劉常宏4

1.安徽省煤田地質(zhì)局勘查研究院，合肥230088；2.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)地球與空間科學(xué)學(xué)院，合肥230026；3.南京大學(xué)地球科學(xué)與工程學(xué)院，南京210023；4.南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京210093

利用厭氧微生物分離技術(shù)，對深度為1.2m的海南紅樹林濕地沉積物鉆孔樣品進(jìn)行了分離培養(yǎng)，共獲得11株厭氧sulfate-reducing bacteria（SRB）菌株。經(jīng)顯微觀察和16S rDNA序列分析，可歸納為6個(gè)屬，其中已經(jīng)報(bào)道有芽孢桿菌屬（Bacillus）、弧菌屬（Vibrio）和梭狀芽胞桿菌屬（Clostridium），另外3個(gè)屬分別為伯克霍爾德菌屬（Burkholderia）、希瓦氏菌屬（Shewanella）和海桿菌屬（Marinobacterium）。不同屬的細(xì)菌對硫酸鹽還原的速率最低為14.71%，最高可達(dá)56.78%，并且以上6屬11株菌都能將+6價(jià)的硫還原生成-2價(jià)硫，并與培養(yǎng)基中的Fe2+結(jié)合生成黑色FeS沉淀，而這些無定形FeS沉淀是生成黃鐵礦的前體。紅樹林濕地SRB種群數(shù)量隨沉積物深度的增加而降低，結(jié)合沉積物的地球化學(xué)分析測試結(jié)果表明，表層（0 cm）水界面的沉積物由于處于氧化-還原界面，氧氣的周期性輸入在一定程度上抑制了SRB的生長；隨著深度增加（10～40 cm），充足的有機(jī)質(zhì)、偏中性的pH值以及厭氧環(huán)境的增強(qiáng)，使得SRB種類和數(shù)量明顯增加；而60 cm以下沉積物中因TOC含量降低，減少了微生物可利用的碳源，pH值明顯降低，Na+和Ca2+離子濃度明顯增加，這些因素都抑制了SRB的生長，使得深部沉積物中SRB的種類和數(shù)量顯著減少。

紅樹林沼澤；氧化還原環(huán)境；可培養(yǎng)硫酸鹽還原菌；硫酸鹽還原率

紅樹林濕地一般分布于熱帶、亞熱帶低能海岸潮間帶上部，受周期性潮水浸淹，以紅樹植物為主體的常綠灌木或喬木組成的海岸濕地，是中國重要的海岸濕地類型，主要分布在海南、廣東、廣西、福建、臺(tái)灣、香港和澳門等省區(qū)（何斌源等，2007）。紅樹林濕地是地球上生產(chǎn)力最高的生態(tài)系統(tǒng)之一，具有很高的有機(jī)物質(zhì)含量，在全球生態(tài)碳循環(huán)中起著重要作用。陸地生態(tài)系統(tǒng)的中10%的碳由紅樹林濕地輸入海洋，海洋沉積物碳總量的15%來自紅樹林濕地（Jennerjahn and Ittekkot,2002;Dittmar etal.,2006）。紅樹林濕地是典型的厭氧濕地，由于海水的潮汐作用，其最顯著的特征之一是沉積物中硫含量很高，且以循環(huán)快速的無機(jī)硫?yàn)橹?，尤其是硫酸鹽（Alongietal.，1989；Giblin and Wieder，1992）的還原作用。由于其高硫酸鹽特性，硫酸鹽還原菌是有機(jī)物質(zhì)分解代謝的主要參與者（Mackin and Swider,1989），其硫酸鹽還原作用消耗紅樹林濕地中超過50%的有機(jī)物質(zhì)（J?rgensen,1977），同時(shí)硫酸鹽被還原為硫化氫，大部分的硫化氫與環(huán)境中鐵離子發(fā)生反應(yīng)，以FeS和FeS2化合物的形式沉積下來（Moeslund etal.,1994）。硫酸鹽還原菌是紅樹林濕地有機(jī)物質(zhì)主要分解者，在碳、硫循環(huán)過程中扮演重要角色，目前有關(guān)紅樹林濕地微生物的研究主要集中在微生物的種群結(jié)構(gòu)和生物多樣性分析、降解有機(jī)污染物微生物的篩選等方面（J?rgensen,1978;Bharathi et al.,1991;何斌源等，2007;欽佩,2006），而對于SRB的種群結(jié)構(gòu)、分布特征以及在S循環(huán)中的作用等鮮有報(bào)道。開展紅樹林濕地SRB優(yōu)勢種群的分離、鑒定以及在S循環(huán)過程中的作用研究具有重要的生物學(xué)和生態(tài)學(xué)意義，并對深入了解SRB參與地球化學(xué)循環(huán)過程的機(jī)理具有一定參考價(jià)值。

1 樣品和方法

1.1 背景和樣品

紅樹林濕地樣品取自海南島東北部的東寨港（E110°32′-110°37′、N 19°51′-20°01′）的紅樹林自然保護(hù)區(qū)，研究區(qū)年年平均氣溫24.5℃，年均降水約1156.5mm（林鵬，1997）。2010年7月在紅樹林濕地中（圖1）用PVC管（Φ140，長2m）鉆孔取樣1處，獲得鉆孔樣品長度為1.2m，將采集好的樣品密封并冷凍保存在-4℃的冰箱中。在實(shí)驗(yàn)室將鉆孔樣品進(jìn)行分裝，為了研究SRB種群數(shù)量及分布隨垂直深度的變化，采集深度為0、10、20、30、40、60、90、120（cm）的集鉆孔沉積物樣品，每層取約200 g沉積物分別保存于2個(gè)50mL滅菌螺口離心管中，一份用于可培養(yǎng)硫酸鹽還原菌的分離，另一份置于-80℃冰箱中冷凍保存。

1.2 紅樹林濕地沉積物理化性質(zhì)的測試方法

沉積物理化實(shí)驗(yàn)測試主要包括pH、有機(jī)元素和金屬離子等。首先利用梅特勒-托利多pH測量設(shè)備直接測試沉積物的pH值。取約100 g沉積物離心獲得約5～10 mL孔隙水，利用離子色譜儀（Metrohm 790 IC）測定Cl-、SO42-、Na+、K+、Mg2+、Ca2+等離子濃度；稱重約50 g沉積物冷凍干燥，稱取其中的2 g干燥樣品用瑪瑙碾缽碾磨至200目，取100 mg粉末樣品由Elementar?Vario MACROCHNS元素分析儀測試獲得N、S、H等有機(jī)元素含量；另取其中1 g粉未樣加入1N HCl在25℃反應(yīng)24 h去除無機(jī)碳后由Elementar?元素分析儀測試TOC含量。取2 g混合均勻的粉末樣品用環(huán)氧樹脂膠結(jié)固定后拋光制成光片進(jìn)行顯微鏡（Nikon）下觀察和測量；另將約500mg沉積物樣品噴上鉑金后在掃描電子顯微鏡（SEM，JEOL）下觀察樣品中有機(jī)質(zhì)和礦物的微觀形貌特征，同時(shí)利用電子探針完成部分樣品的微區(qū)成分分析。

1.3 沉積物樣品中可培養(yǎng)SRB的種群數(shù)量測定

SRB篩選平板培養(yǎng)基的配方如下(Widdel and Bak,1992;Hines etal.,1999):NaCl，30 g/L;NaSO4，84 g/L;KCl，0.3 g/L;MgCl2·6H2O,2 g/L;MgSO4· 7H2O,1 g/L;CaCl2·2H2O,0.147 g/L;K2HPO4,0.2 g/L; NH4Cl,0.26 g/L;NaHCO3,1.68g/L;乳酸鈉,10mmol/L,酵母膏,0.1g/L;Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O,1.66g/L;瓊脂20 g，定容至1 L，調(diào)節(jié)pH至7.0，選擇5種不同底物的電子供體（A）：乙酸鈉，乙醇，乳酸鈉均20mmol/L，苯甲酸鈉5mmol/L，丙酸鈉10mmol/L。

利用“Forma 1029厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)”進(jìn)行系列稀釋涂布法分離培養(yǎng)沉積物中可培養(yǎng)的SRB菌群。稱取沉積物樣品1 g左右，置于50mL無菌塑料管中，加入無菌水至10mL，振蕩10min，依次稀釋至10-5、10-6、10-7倍；然后分別取稀釋液200μl傾注至培養(yǎng)基平板上進(jìn)行涂布培養(yǎng)，每個(gè)濃度的稀釋液均涂布于5種培養(yǎng)基平板上，并且重復(fù)2個(gè)平板。用于分離SRB菌群的平板置于厭氧培養(yǎng)箱中，加熱至35℃，在混合氣體（10%H2，10% CO2，80%N2）和氮?dú)庖约扳Z催化劑共同的作用下進(jìn)行厭氧培養(yǎng)6d，并記錄各種底物平板上的細(xì)菌菌落形態(tài)及各種形態(tài)菌落的數(shù)目。

圖1 紅樹林濕地沉積物采樣點(diǎn)Fig.1 Map showing the location ofmangrove swamp sedimentsampling sites

1.4 可培養(yǎng)SRB菌種鑒定

厭氧培養(yǎng)至出現(xiàn)黑色菌落，挑取單菌落進(jìn)一步重復(fù)接種操作直至得到純化的菌株，然后進(jìn)行16S rRNA基因序列的分析（Shuang etal.,2006）。首先將已純化的SRB菌種劃線接種至相應(yīng)的固體培養(yǎng)基平板上，35℃培養(yǎng)6 d，提取細(xì)菌DNA，然后進(jìn)行細(xì)菌16SrDNA目標(biāo)片斷的PCR擴(kuò)增。16SrDNA序列擴(kuò)增引物8f（5’→AGA GTT TGA TCC TGG CTCAG→3’）（Chen etal.,2008）和907r（5’→CCG TCA ATTCCT TTR AGT TT→3’）（Brinkhoff et al.,1998）由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)試劑盒和純化試劑盒分別購自北京天為時(shí)代科技有限公司和OMEGA公司。

PCR的反應(yīng)體系（50μl）為10×PCR Buffer（含Mg2+）5μl；引物8f（10μmol/L）1μl，引物907r（10μmol/L）1μl；dNTP混合物（每種2.5mmol/L）4μl；挑取少量菌落作為模板DNA；Taq酶（5U·μl-1）0.5μl；ddH2O補(bǔ)足至50μl。PCR的反應(yīng)條件為95℃5min；94℃30 sec，57℃1min，72℃1min，25個(gè)循環(huán)；72℃10min。4℃結(jié)束。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物后，用OMEGA公司生產(chǎn)的D6492-01 E.Z.N.A.TMCycle-Pure試劑盒純化PCR產(chǎn)物。純化后的PCR產(chǎn)物送至南京大學(xué)醫(yī)藥與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成測序工作。采用序列圖譜軟件Chromas對所得序列進(jìn)行核對，并使用BLASTN（Basic Local Alignment Search Tool,http:// www.ncbi.nlm.nih.Gov）在enBank+EMBL+DDBJ+ PDB基因庫中對每株菌的16SrDNA序列進(jìn)行同源性搜索和比對，以獲得參考序列，然后應(yīng)用MEGA4生物學(xué)軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 SRB硫酸根還原速率及還原產(chǎn)物的測定

將已測序鑒定的SRB純化菌種接種至12mL相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，在33℃的條件下靜置培養(yǎng)。定時(shí)取1mL培養(yǎng)液測定硫酸根含量，30天后計(jì)算各SRB菌株的硫酸鹽還原速率，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。SRB菌培養(yǎng)產(chǎn)物經(jīng)過冷凍干燥，密封保存后真空環(huán)境噴涂鉑金，通過掃描電鏡（JEOL JSM-6490）分析SRB還原產(chǎn)物的形貌特征，設(shè)置工作距離為10mm，電壓20 kV。

圖2 紅樹林濕地沉積物不同深度元素含量、離子濃度及可培養(yǎng)SRB數(shù)量Fig.2 Changes in elementcontent,ion concentration,and thenumberof culturable SRB in the sedimentsof themangrove swampswith depth

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 紅樹林濕地的理化性質(zhì)

不同深度沉積物中的pH檢測結(jié)果顯示，表層（0 cm）pH最高，為7.53，隨后降低到pH6.33（10 cm），并在60～90 cm時(shí)降到最低pH 5.57。

TOC含量在0～10 cm沉積物略有升高，10 cm之后含量呈現(xiàn)下降趨勢，TOC在10 cm沉積物含量最高為3.58%，在120 cm含量最低為1.01%（圖2）。N含量較低，在10 cm處達(dá)到最高值0.28%，并隨著深度增加持續(xù)降低，最低值出現(xiàn)在60 cm深度約為0.12%。C/N比值在30 cm處出現(xiàn)最大值17，隨后持續(xù)降低直至120 cm處的最低值8。S含量除了在60 cm略有降低外，整體呈現(xiàn)上升趨勢，含量在0.67%～1.18%之間，在120 cm含量最高為1.18%。紅樹林濕地的SO42-除在20 cm處濃度最低（約8.91 mmol/L），皆在10mmol/L以上，平均約13.39mmol/L。Na+濃度持續(xù)增加，從0cm處的最低值213.4mmol/L，持續(xù)增高至120 cm達(dá)到最高值為402.6mmol/L。Ca2+濃度除了20 cm沉積物濃度最低為4.61mmol/L，整體呈現(xiàn)升高趨勢，在120 cm深度達(dá)到最高值為7.46mmol/L。Cl-濃度在表層0～10 cm較低，20 cm以下樣品明顯增高，在120 cm達(dá)到最高位475.6mmol/L。SO42-濃度在20 cm以上出現(xiàn)降低趨勢，而30 cm之后顯著升高，60 cm處達(dá)到最大值（圖2）。

紅樹林濕地中所有層位樣品均有黃鐵礦（FeS2）存在，呈星散狀均勻分布在沉積物中，主要晶形有八面體自形晶和草莓狀體（圖3）。自形的黃鐵礦一般較小，直徑在2μm左右（圖3 B），而草莓狀黃鐵礦的粒徑一般達(dá)到10μm，也可見20μm以上的草莓狀球體（圖3C）。

圖3 紅樹林濕地沉積物顯微圖像Fig.3 Microscopic imagesof sediments from themangrove swamps

2.2 可培養(yǎng)SRB的鑒定

通過選擇性培養(yǎng)，形態(tài)學(xué)特征，參照細(xì)菌學(xué)鑒定手冊，將獲得的可培養(yǎng)厭氧菌株歸為11株SRB（表1）。

11個(gè)菌株的16SrDNA-PCR片段大小約900 bp，測序結(jié)果經(jīng)同源性分析，歸為6個(gè)SRB屬，主要屬于變形菌門和厚壁菌門。其中8株歸為變形菌門，3株歸為厚壁菌門。在變形菌門中，有5株屬于β-變形菌綱，3株為γ-變形菌綱，2株為芽孢桿菌綱，1株為梭狀芽胞桿菌綱。

表1 SRB菌株的菌落形態(tài)特征描述Table 1 Themorphology description of SRB strains colony

圖4 株菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 A phylogenetic tree of the bacterial strains isolated in this study

參考系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），菌株S1、S2、S3與伯克氏菌屬（Burkholderia）的Burkholderia fungorum同源性為99%，菌株S7和S8與伯克氏菌屬（Burkholderia）的Burkholderia fungorum同源性為100%（Witzig etal.,2007）；菌株S9與溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的同源性為100%（Eiler and Bertilsson,2006）；菌株S11與海桿菌屬（Marinobacterium）同源性為94%（Kim etal.,2007）；菌株S13與希瓦氏菌屬（Shewanella）的同源性為96%（Nakagawa etal.,2006）；菌株S15與梭狀芽胞桿菌屬（Clostridium）同源性為98%（Carlier et al.,2006）；S4與芽孢桿菌屬（Bacillus）的堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌（Bacillus firmus）同源性為99%，而S6的同源性達(dá)到100%（Gontangetal.,2007）。

2.3 SRB在沉積物中數(shù)量及垂直分布

采用系列稀釋涂布平板法測定了各層沉積物中可培養(yǎng)SRB的種群數(shù)量。結(jié)果顯示SRB的種群數(shù)量隨沉積物深度而呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢（圖2），最高數(shù)量出現(xiàn)在10 cm深度，為7.74×1011CFU/g土壤，在120 cm深度數(shù)量最低，為4.45×108CFU/g土壤。在不同沉積物中每個(gè)屬的SRB分布不同，6個(gè)屬11株SRB分布如表1所示。SRB主要分布60 cm以上。在沉積物最表層（0 cm）只有Shewanella分布；10 cm，20 cm，30 cm深度均有1株B.fungorum SRB分布；在40 cm處獲得的可培養(yǎng)SRB的種類最多，其中2株B.fungorum、2株B. firmus、1株Marinobacterium。在60 cm處有1株Clostridium。在90 cm沉積物無可培養(yǎng)SRB分布。在120 cm有1株V.parahaemolyticus。伯克氏菌屬B.fungorum在10～40 cm都有分布，是優(yōu)勢種群。

表2 紅樹林沉積物中11株可培養(yǎng)SRB的垂直分布Table 2 The verticaldistribution of the 11 strainsof culturable SRB in the sedimentsamples from mangrove swamps

圖5 SRB還原產(chǎn)物SEM圖像Fig.5 SEM imagesof the productsof SRB reduction

2.4 SRB硫酸根的還原速率及還原產(chǎn)物

培養(yǎng)30 d后，V.parahaemolyticus S9還原率速率最高，可達(dá)到56.78%，B.fungorum S1還原率為41.4%，B.firmus S4和Clostridium sp.S15為在30%～40%。Marinobacterium sp.S11和Shewanella sp.S13還原率較低，約15%（表3）。

表3 可培養(yǎng)SRB的硫酸鹽還原率Table 3 Sulfate reduction ratesof culturable SRB

模擬實(shí)驗(yàn)的過程中SRB產(chǎn)生大量有特殊臭味的H2S氣體，在培養(yǎng)基中生成大量黑色沉淀，SEM能譜揭示沉淀產(chǎn)物主要由Fe和S元素組成（圖5），F(xiàn)e/S原子比介于1和2之間，如圖6中#1和#2兩個(gè)能譜點(diǎn)顯示Fe/S原子比分別為0.9和1.5，表明在SRB的作用下，硫酸根離子被還原成S2-，而S2-與培養(yǎng)基中二價(jià)鐵鹽反應(yīng)可生成不穩(wěn)定無定形FeS黑色沉淀或由無定形FeS向穩(wěn)定的黃鐵礦（FeS2）轉(zhuǎn)化的過渡產(chǎn)物，如馬基諾礦（mackinawite;tetragonal FeS，即四方硫鐵礦）、膠黃鐵礦（greigite,cubic Fe3S4）和磁黃鐵礦（pyrrhotite; e.g.,Fe7S8）等（Sweeney and Kaplan,1973;Wilkin and Barnes,1996）。

3 討論

3.1 SRB的多樣性

SRB是能夠還原硫酸鹽產(chǎn)生硫化氫的一類微生物的總稱，是根據(jù)功能來定義的一類微生物，目前發(fā)現(xiàn)的SRB分布于19屬，包括革蘭氏陽性細(xì)菌，革蘭氏陰性嗜微溫菌和古生菌的嗜熱硫還原細(xì)菌（Klepac-Cerajetal.,2004）。本研究采用傳統(tǒng)的硫酸鹽還原菌分離方法從紅樹林濕地分離到11株SRB，經(jīng)鑒定屬于6個(gè)屬，分別為伯克霍爾德菌屬、芽孢桿菌屬、弧菌屬、希瓦氏菌屬、梭狀芽胞桿菌屬、海桿菌屬。其中芽孢桿菌屬、弧菌屬（陳皓文，1999）和梭狀芽胞桿菌屬中的Clostridium tunisiense（Olfa Ben Dhia Thabetet al.,2004）已有相關(guān)報(bào)道為硫酸鹽還原菌，如本次研究分離獲得的Bacillus firmus S4，Bacillus firmus S6以及Vibrio parahaemolyticus S9等菌株。而伯克霍爾德菌、希瓦氏菌屬和海桿菌屬中至今未見有SRB菌種的報(bào)道。本研究能夠分離獲得新的SRB菌種的主要原因可能與本研究采樣地的生境、采樣沉積物部位以及分離手段有關(guān)。

3.2 可培養(yǎng)SRB在紅樹林濕地的垂直分布規(guī)律

對SRB種群數(shù)量的研究多數(shù)集中在淺層樣品中，一般集中在5～20 cm深度（Niko Finke et al., 2007;Leloup etal.,2005）的沉積物，本研究自1.2m的沉積物鉆孔中間隔一定距離取沉積物分析，用硫酸鹽還原菌選擇培養(yǎng)基在厭氧條件下系統(tǒng)地分離研究了SRB的種群數(shù)量，結(jié)果顯示SRB的種群數(shù)量隨沉積物深度而呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，最高數(shù)量出現(xiàn)在10 cm深度，為7.74×1011CFU/g土壤，是表層（0 cm）的56倍；之后，SRB種群數(shù)量隨深度增加而急劇下降，這與前人研究結(jié)果相類似，例如報(bào)道的北部灣東側(cè)沉積物表層SRB數(shù)量是50～370 cm沉積物數(shù)量的5.1倍（Chen and Xu,1999）。

造成SRB這種分布的可能原因是：表層處于氧化還原界面，與氧氣接觸，并且硫酸鹽含量較低，不利于厭氧還原環(huán)境的產(chǎn)生，使得SRB生長受到抑制，從而導(dǎo)致種群數(shù)量較低；而10 cm以下氧氣含量降低，逐步向還原帶過渡，且含有豐富的有機(jī)物質(zhì)，TOC高達(dá)3.58%，從而為SRB的活動(dòng)提供豐富的有機(jī)質(zhì)來源。

淺鉆樣品其它深度SRB數(shù)量可能受到以下幾方面因素的綜合影響：（1）紅樹林有機(jī)物組成：紅樹林40 cm以上沉積物中高有機(jī)質(zhì)含量促進(jìn)了SRB的繁茂，底部沉積物中由于TOC含量以及C/N值的明顯降低，表明其有機(jī)質(zhì)來源較單一，以藻類體為主，這就可能極大地抑制了SRB的發(fā)育。此外，有研究表明紅樹林根際細(xì)菌數(shù)量變化受紅樹根以及根系分泌有機(jī)物質(zhì)的影響（Moriarty et al.,1986），即植物根系釋放的有機(jī)酸刺激了硫還原菌的活動(dòng)，有助于促進(jìn)硫酸鹽還原過程（Alongi et al.,2001；張薇等，2005；張小李等，2000）；（2）沉積物溫度和pH值：Moosa等（2005）研究曾研究了溫度對SRB還原活性的影響，結(jié)果表明培養(yǎng)溫度在20～35°C之間時(shí)還原活性隨溫度升高而增加，但在40°C還原活性反倒降低，紅樹林沉積物溫度在各沉積物可能是不同的，對SRB的影響也不同；沉積物pH值與SRB生長也密切相關(guān)，通常SRB生活的環(huán)境pH值在6～9之間（Willow and Cohen,2003），Kimura等（2006）報(bào)道SRB不能在pH值低于5.5的條件下生長。海南紅樹林濕地沉積物環(huán)境偏酸性，且隨著沉積物深度增加pH值呈現(xiàn)下降趨勢，10 cm沉積物pH值在6.33，40～120 cm沉積物pH小于6，最低在5.57，下層沉積物可能因酸度偏大對SRB生存造成不良影響；（3）沉積物孔隙水中的離子濃度：Na+濃度與SRB生長呈負(fù)相關(guān)（張小里等，1999），Ca2+對SRB生長及活性也有抑制作用（Maree and Strydom,1987）。海南紅樹林沉積物中Na+濃度隨著沉積物深度增加而升高，在120 cm沉積物達(dá)到402.6mmol/L，Ca2+濃度在20 cm以后也呈逐漸升高趨勢。

4 結(jié)論

（1）對紅樹林1處淺鉆研究表明，該區(qū)域存在豐富的SRB，經(jīng)過分離培養(yǎng)純化共獲得6屬11株SRB菌株，其中已經(jīng)報(bào)道的種屬為芽孢桿菌屬、弧菌屬和梭狀芽胞桿菌屬，新發(fā)現(xiàn)的種屬為伯克霍爾德菌屬、希瓦氏菌屬和海桿菌屬。

（2）該紅樹林鉆孔中，SRB在沉積物中的垂直分布受到沉積物理化特征影響因素導(dǎo)致差異較大，如上部沉積物（40 cm）高TOC值和偏中性的pH值促進(jìn)了SRB的生長，而40 cm以下沉積物中TOC含量明顯降低，偏酸性的pH值（pH＜6）和顯著增加的Ca2+、Na+離子濃度可能抑制了SRB的生長。

（3）SRB菌種模擬培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)顯示V.parahaemo?lyticus S9還原率速率最高，可達(dá)到56.78%，Mari?nobacterium sp.S11和Shewanella sp.S13還原率較低，約15%。6屬11株SRB均能將+6價(jià)的硫還原生成-2價(jià)硫，并與培養(yǎng)基中的Fe2+結(jié)合生成無定形FeS黑色沉淀，而這些FeS沉淀為沉積物中出現(xiàn)大量黃鐵礦提供了可能。

Re ferences)

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Diversity and VerticalDistribution ofCu lturab leSulfate-reducing Bacteria in CoastalMangroveSwamps from Hainan Island,China

DING Hai1,2,YAO Suping3*,LIU Guijian2,Liu Changhong4
1.Exploration Research Institute,AnhuiProvincial Bureau ofCoalGeology,Hefei230088,China; 2.Schoolof Earth and Space Science,University of Scienceand Technology ofChina,Hefei230026,China; 3.SchoolofEarth Sciencesand Engineering,Nanjing University,Nanjing210023,China; 4.Schoolof Life Sciences,Nanjing University,Nanjing210093,China

Utilizing an anaerobic method of isolating microorganisms,we identified and cultured a total of 11 strains of anaerobic sulfate-reducing bacteria(SRB)from sediment samples collected from 1.2 m-deep mangrove swamps in Hainan.These SRB were classified into 6 genera based on theirmorphology thatwas observed under amicroscopy and through sequence analysis of their 16S ribosomal DNA(16S rDNA).These include three reported genera:Bacillus,Vibrio,and Clostridium.They also include three newly discovered genera:Burkholderia,Shewanella,and Marinobacterium.The minimum rate of sulfate reduction of these bacteria was 14.71%,and themaximum ratewas 56.78%.Moreover,all the 11 strainswere able to reduce sulfur S6+to S2-,which was subsequentlybound with iron(Fe2+)to produceblack iron(II)monosulfide(FeS)precipitate.FeSprecipitate is the precursorofpyrite.The population of SRB in themangrove swamps decreased with depth.Geochemical analysis of the sediments reveal that the oxidation and reduction interfacewas located at interface of sedimentand water(0 cm),and the periodic inputof oxygen partially inhibited the growth of SRB. In contrast,as the depth of sediment increased(10-40 cm),an adequate supply oforganicmatter,a near-neutral pH,and an enhanced anaerobic environment led to a significant increase in both the number of SRB strains and the population of SRB.However,at depths greater than 60 cm,the total organic carbon(TOC)content in the sediment decreased,which reduced the carbon source available for microorganisms.In addition,both a significant reduction in pH levels and significant increases in sodium cation(Na+)and calcium cation(Ca2+)concentrations inhibited SRB growth,greatly decreasing the number of SRB strains and the total SRB population in the deep sediments.Thegeochemical characteristicsof the sedimentswere themain factorsaffecting vertical distribution of SRB species in themangrove swamp samples.

mangrove swamps;redox condition;culturable SRB;sulfate reduction rate;sulfur cycle;pyrite.

YAO Suping,Professor;E-mail:spyao@nju.edu.cn

P593

A文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：1006-7493（2016）04-0621-10

10.16108/j.issn1006-7493.2016043

2016-03-25；

2016-08-11

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41372127；40973051）；及安徽省博士后基金項(xiàng)目（2016B121）聯(lián)合資助

丁海，男，1983年生，博士后，研究方向?yàn)橛袡C(jī)地球化學(xué)；E-mail:dna75@163.com

*通訊作者：姚素平，博士，教授，研究方向?yàn)橛袡C(jī)地球化學(xué)；E-mail:spyao@nju.edu.cn