骨架蛋白ENH在心血管系統(tǒng)中作用的研究進(jìn)展

朱政怡 戚彤云 張 雪 柯越海 程洪強(qiáng)

骨架蛋白ENH在心血管系統(tǒng)中作用的研究進(jìn)展

朱政怡 戚彤云 張 雪 柯越海 程洪強(qiáng)

ENH是一個(gè)含有PDZ和LIM結(jié)構(gòu)域的骨架蛋白，存在多種mRNA剪接體，不同的剪接體具有不同的組織表達(dá)方式和功能。ENH在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮骨架蛋白的結(jié)構(gòu)功能，在心臟發(fā)育和維持心臟Z線結(jié)構(gòu)穩(wěn)定中有重要作用。ENH還能與不同的蛋白激酶結(jié)合，作為信號(hào)分子的錨定蛋白，調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)、血管平滑肌細(xì)胞的增殖與遷移。

心血管系統(tǒng)；ENH；骨架蛋白；錨定蛋白

心肌細(xì)胞與骨骼肌細(xì)胞是具有收縮功能的高度分化的肌細(xì)胞。肌小節(jié)是肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的最小單元。連接兩個(gè)相鄰肌小節(jié)的重要結(jié)構(gòu)是Z線，由輔肌動(dòng)蛋白α-Actinin-2以及與之結(jié)合的蛋白組成的蛋白復(fù)合體或蛋白質(zhì)機(jī)器構(gòu)成，在電鏡下為特征性的暗線。編碼Z線蛋白的基因突變是肥厚型和擴(kuò)張型心肌病的主要遺傳因素。研究發(fā)現(xiàn)，Z線不僅維持肌小節(jié)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，還是肌細(xì)胞感受力和傳遞信號(hào)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)[1]。骨架蛋白ENH(Enigma homolog)與輔肌動(dòng)蛋白結(jié)合，在肌細(xì)胞中主要位于肌小節(jié)的Z線[2]，與其他Z線蛋白相互作用維持Z線的穩(wěn)定，同時(shí)參與胞內(nèi)信號(hào)的傳遞，是典型的Z線蛋白，在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。

1 ENH概述

ENH又名PDLIM5，屬于PDLIM蛋白家族[3-5]。PDLIM蛋白家族以含有PDZ和LIM結(jié)構(gòu)域?yàn)樘卣?，在哺乳?dòng)物中有10個(gè)編碼基因，根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)特征可分成4個(gè)亞族。其中Enigma亞族包括Enigma、ENH和Cypher 3個(gè)基因，編碼的蛋白含有N端的PDZ結(jié)構(gòu)域和C端的3個(gè)LIM結(jié)構(gòu)域[5]。PDZ和LIM結(jié)構(gòu)域的主要功能是參與蛋白間相互作用。PDZ結(jié)構(gòu)域由80～100個(gè)氨基酸殘基組成，主要結(jié)合蛋白的疏水C末端。LIM是由大約55個(gè)氨基酸殘基組成的小結(jié)構(gòu)域，含有半胱氨酸豐富的保守序列CX2CX16-23HX2CX2CX2CX16-21CX2(Cys/His/Asp)，與鋅離子(Zn2+)結(jié)合形成特殊雙鋅指結(jié)構(gòu)，不與核酸分子結(jié)合，介導(dǎo)蛋白間相互作用[5]。ENH通過PDZ和LIM結(jié)構(gòu)域與眾多蛋白相互作用，形成蛋白復(fù)合體，分別發(fā)揮細(xì)胞骨架和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。見表1。

表1 與ENH相互作用的蛋白列表

注：ENH 選擇性與PKCβ1、γ和ε結(jié)合，不與PKCα、δ和ξ結(jié)合；N/A為相互作用的結(jié)構(gòu)域未進(jìn)一步分析

2 ENH mRNA剪接

在哺乳動(dòng)物中，大于95%的mRNA存在選擇性剪接，基因通過剪接可以產(chǎn)生多種蛋白[6]。ENH mRNA存在復(fù)雜的剪接，產(chǎn)生的蛋白可以分成兩組，含有3個(gè)LIM結(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)剪接體和不含LIM結(jié)構(gòu)域的短剪接體，長(zhǎng)短剪接體又各自包含4～5種剪接體[7-8]。小鼠的ENH基因包含20個(gè)外顯子，外顯子1～3編碼N端PDZ結(jié)構(gòu)域，外顯子17～20編碼C端的3個(gè)LIM結(jié)構(gòu)域。外顯子5存在長(zhǎng)(5)和短(5’)兩種形式，產(chǎn)生ENH1a(5)和ENH1b(5’)兩種產(chǎn)物，還可以與外顯子12～14組合產(chǎn)生3種不同剪接產(chǎn)物(ENH1c～ENH1e)。同樣，外顯子5和5’與外顯子6～8組合可產(chǎn)生4種ENH短剪接產(chǎn)物(ENH2、ENH3a、ENH3b和ENH4)。

ENH mRNA剪接有組織特異性，長(zhǎng)剪接體在多種組織中表達(dá)，包括心臟、大腦、脾臟、肝臟和腎臟，而短剪接體只在心肌和骨骼肌中高表達(dá)[4, 9]。ENH mRNA剪接還與發(fā)育過程有關(guān)，在心臟和骨骼肌中，長(zhǎng)剪接體是胚胎型，在胚胎中表達(dá)高，出生后逐漸降低；短剪接體是成體型，在胚胎中表達(dá)低，出生后逐漸升高[8, 10]。在骨骼肌細(xì)胞C2C12體外分化過程中，不同的ENH剪接體具有類似的表達(dá)模式[8, 11]。這種與發(fā)育相關(guān)的剪接模式在Enigma亞族的Cypher mRNA上也存在[12]。此外，ENH mRNA剪接還與疾病相關(guān)，在心肌肥厚小鼠心臟中，ENH mRNA剪接轉(zhuǎn)變成胚胎型，即長(zhǎng)剪接體表達(dá)升高，短剪接體表達(dá)降低[10]。因此ENH剪接方式的變化可能參與心肌病的病理發(fā)生過程[13-14]。

3 ENH在心臟發(fā)育中的作用

心臟是胚胎早期發(fā)育并發(fā)揮功能的器官。ENH在小鼠胚胎發(fā)育早期的心臟區(qū)高表達(dá)[15]，可能是心臟發(fā)育早期重要轉(zhuǎn)錄因子Mesp1和Mef2A作用的結(jié)果[16-17]，表明ENH可能在心臟發(fā)育過程中發(fā)揮作用。然而ENH基因敲除小鼠胚胎沒有明顯的心臟發(fā)育缺陷，推測(cè)是由于ENH同亞族的Cypher或Enigma發(fā)揮了替代作用[7]。與ENH相似，Cypher在小鼠心臟發(fā)育早期高表達(dá)，Cypher敲除小鼠也沒有明顯的發(fā)育缺陷[18]。而ENH/Cypher雙敲除小鼠在胚胎發(fā)育早期死亡，有明顯的心臟發(fā)育缺陷，包括心管擴(kuò)張、心包積液、心室壁變薄以及心臟發(fā)育遲緩[15]，提示Enigma亞族的ENH與Cypher在心臟發(fā)育中確實(shí)存在功能上的冗余。在一項(xiàng)對(duì)室間隔缺損胎兒全基因組DNA甲基化修飾的分析中發(fā)現(xiàn)，室間隔缺損的胎兒ENH啟動(dòng)子甲基化水平低，室間隔缺損與ENH的高表達(dá)有關(guān)[19]。

ENH的不同剪接體對(duì)心肌發(fā)育有不同的作用。體外研究發(fā)現(xiàn)ENH長(zhǎng)剪接體(ENH1a)能增加肌細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄因子MyoD和Myogenin的表達(dá)，促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大，而短剪接體(ENH4)具有相反的作用，可抑制苯腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大[11]。

4 ENH在維持心血管系統(tǒng)結(jié)構(gòu)中的作用

免疫熒光染色顯示ENH主要分布在心肌細(xì)胞肌小節(jié)的Z線上，因此ENH可能與肌細(xì)胞的收縮相關(guān)。ENH敲除小鼠可出現(xiàn)擴(kuò)張型心肌病，表現(xiàn)為左心室壁變薄、左心室腔增大、心臟收縮和射血功能減弱[7]。ENH敲除還會(huì)使小鼠心肌細(xì)胞的基因表達(dá)向胚胎型偏轉(zhuǎn)(如心房利鈉肽、B型利鈉肽、β肌球蛋白重鏈、骨骼肌肌動(dòng)蛋白等表達(dá)升高)。ENH的缺失導(dǎo)致與其相互作用的Z線蛋白Calsarcin-1和Cypher短剪接體Cypher2c顯著減少。超顯微結(jié)構(gòu)分析顯示ENH敲除小鼠肌小節(jié)Z線增寬，結(jié)構(gòu)混亂。這些結(jié)果說明ENH參與維持心肌肌小節(jié)Z線結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。

在壓力和損傷作用下，心臟會(huì)發(fā)生重構(gòu)，表現(xiàn)為心肌纖維化和心肌細(xì)胞病理性生長(zhǎng)，導(dǎo)致心力衰竭發(fā)生。心臟重構(gòu)時(shí)，心臟成纖維細(xì)胞通過外泌體包裹的微小RNA-21(miR-21)作用于心肌細(xì)胞，降低miR-21靶標(biāo)基因ENH的表達(dá)，誘導(dǎo)心肌病理性肥厚，提示ENH在維持心肌穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[20]。人類ENH的編碼基因是否存在與心肌病相關(guān)的突變及ENH在人類心血管結(jié)構(gòu)中的作用尚不清楚。

5 ENH在心血管系統(tǒng)中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用

ENH在心血管系統(tǒng)中還發(fā)揮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。ENH是在尋找與蛋白激酶C(PKC)β1相互作用的新蛋白時(shí)被發(fā)現(xiàn)的，ENH的LIM結(jié)構(gòu)域與PKCβ1的N端V1區(qū)結(jié)合，可被PKC磷酸化[4]。敲除ENH不影響心臟中PKC的表達(dá)[7]。在PKC的不同亞型中，ENH與PKCβ1、γ和ε結(jié)合，而不與PKCα、δ和ξ結(jié)合[4]。Enigma亞族的Cypher能與上述6種PKC亞型結(jié)合[21]，而Enigma只與PKCα、β1和ξ結(jié)合，說明Enigma亞族蛋白的LIM結(jié)構(gòu)域都能與PKC結(jié)合，但通過結(jié)合不同的PKC亞型表現(xiàn)功能上的特異性。ENH可招募PKCβ1到細(xì)胞膜并增強(qiáng)其激酶活性，而不需要PKC的活化分子如二?；视突蛘吡字＝z氨酸的參與[22]。Enigma亞族中Cypher和Enigma也具有相同的功能，但PDLIM蛋白家族中其他成員僅能與PKC結(jié)合，不具有活化PKC的功能?；罨腜KC能夠直接磷酸化環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)，或者通過活化蛋白激酶D1(PKD1)，后者再磷酸化CREB[23]，磷酸化的CREB進(jìn)入心肌細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的功能，促進(jìn)心肌細(xì)胞生長(zhǎng)。這一過程是通過ENH的LIM結(jié)構(gòu)域?qū)崿F(xiàn)的，因此不含LIM結(jié)構(gòu)域的ENH短剪接體不具有該功能，相反，ENH短剪接體可抑制PKC活化、CREB磷酸化以及心肌的病理性肥厚。

ENH還可與蛋白激酶A(PKA)和PKD相互作用[24-25]。ENH通過PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合心肌細(xì)胞L-型鈣離子通道(L-type calcium channel, LTCC)，協(xié)助PKD1或PKA磷酸化LTCC胞內(nèi)段(如1928位點(diǎn)的絲氨酸殘基Ser1928)，調(diào)節(jié)細(xì)胞鈣流，參與腎上腺素能受體介導(dǎo)的增強(qiáng)心肌收縮的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。ENH在這方面的作用可能與Cypher存在重疊[24]。在對(duì)急性心肌梗死動(dòng)物心臟的磷酸化蛋白質(zhì)譜分析中發(fā)現(xiàn)，ENH和肌鈣蛋白I(cTnI)磷酸化水平顯著下降，其中，ENH的Ser118和cTnl的Ser22/23位點(diǎn)是PKA的作用位點(diǎn)[26]。ENH等肌纖維蛋白的磷酸化形式可能在維持心臟結(jié)構(gòu)與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面都發(fā)揮了重要作用。

除了心肌，ENH還在血管平滑肌中發(fā)揮重要的作用。AMP活化蛋白激酶(AMPK)是細(xì)胞內(nèi)的能量傳感器，通過調(diào)控微管和微絲的動(dòng)態(tài)組裝過程調(diào)節(jié)細(xì)胞的極性形成和運(yùn)動(dòng)。在血管平滑肌細(xì)胞中，AMPK通過磷酸化ENH(Ser177)抑制Rac1的活性，下游分子Arp2/3蛋白隨之離開細(xì)胞片狀偽足前沿，破壞了應(yīng)力纖維的組裝，抑制了偽足形成和細(xì)胞遷移[27]。ENH在肺動(dòng)脈高壓患者和小鼠模型的肺動(dòng)脈平滑肌中表達(dá)升高，降低ENH的表達(dá)會(huì)活化轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGFβ)的信號(hào)通路，促進(jìn)肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生[28]。ENH可能成為肺動(dòng)脈高壓治療的新靶點(diǎn)[29]。

6 結(jié)語(yǔ)

骨架蛋白ENH通過PDZ和LIM結(jié)構(gòu)域與其它蛋白結(jié)合維持心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)，尤其是心肌細(xì)胞在收縮過程中肌小節(jié)的結(jié)構(gòu)。ENH還具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面的功能，可與蛋白激酶(PKA、PKC、PKD1和AMPK)及其底物直接作用，發(fā)揮錨定蛋白的功能，參與心肌細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化和遷移。深入研究ENH在心血管系統(tǒng)中的作用，有助于設(shè)計(jì)與開發(fā)以骨架蛋白為靶點(diǎn)的新型心血管藥物。

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(收稿：2016-06-01 修回：2016-08-11)

(本文編輯：胡曉靜)

國(guó)家自然科學(xué)基金(81170117，31471258)

310058 杭州，浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理與病理生理學(xué)系

程洪強(qiáng)，Email：hqcheng11@zju.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-6583.2016.06.009