樺剝管孔菌固態(tài)發(fā)酵纖維素酶及發(fā)酵基質(zhì)酶解

李冠華， 邵小涵， 苑 琳*

（內(nèi)蒙古大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021）

樺剝管孔菌固態(tài)發(fā)酵纖維素酶及發(fā)酵基質(zhì)酶解

李冠華， 邵小涵， 苑 琳*

（內(nèi)蒙古大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021）

建立纖維素酶固態(tài)發(fā)酵與生物預(yù)處理相耦合工藝。實驗優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵條件，測定發(fā)酵基質(zhì)結(jié)晶度及酶解糖化得率。結(jié)果表明3 g稻草粉為基質(zhì)，0.5%淀粉為碳源，1%蛋白胨為氮源，0.5%蘆丁，初始pH值為5，發(fā)酵14 d，褐腐真菌Piptoporus betulinus產(chǎn)CMC酶活力達到76.46 U/g，濾紙酶活力達到7.75 U/g；酶解糖化階段減少外源纖維素酶量36.05%；P. betulinus降解固態(tài)基質(zhì)中的無定型纖維素，暴露結(jié)晶纖維素，提高發(fā)酵基質(zhì)的酶解糖化得率184%。

褐腐真菌；樺剝管孔菌；固態(tài)發(fā)酵；纖維素酶；酶解糖化得率

纖維素是地球上分布最廣、最豐富的可再生資源，但大部分未被有效利用，造成資源浪費，以及環(huán)境污染。纖維素降解成單糖，轉(zhuǎn)化制備液體燃料及其化工產(chǎn)品是當(dāng)前科學(xué)研究的熱點，受到各國政府、研究機構(gòu)和企業(yè)的關(guān)注[1]。酶解是纖維素轉(zhuǎn)化的核心環(huán)節(jié)，酶解的高成本是制約纖維素開發(fā)應(yīng)用的重要瓶頸，表現(xiàn)在纖維素酶價格昂貴和纖維素的酶解率低兩個方面[2-3]。

生物預(yù)處理具有反應(yīng)條件溫和、無污染、易于下游操作等優(yōu)點。微生物選擇性去除木質(zhì)素（部分菌種可以同時降解半纖維素），破壞纖維素結(jié)晶區(qū)，提高比表面積，改變生物質(zhì)孔徑分布特征，提高纖維素酶解率[4]。褐腐真菌可以造成木材褐色腐朽，通過復(fù)雜的酶促與非酶促反應(yīng)，改變木質(zhì)纖維素的化學(xué)組成與物理結(jié)構(gòu)，引起纖維素和半纖維素的解聚與分解[5]。相比于白腐真菌，褐腐真菌分泌纖維素酶，形成的胞外水解體系可用于纖維素的酶解糖化，降低外源纖維素酶用量[6]?；诖?，將褐腐真菌預(yù)處理，固態(tài)發(fā)酵纖維素酶，以及酶解糖化三者相耦合對于實現(xiàn)纖維素高值化具有重要意義。但褐腐真菌數(shù)量較少，僅占木材腐朽真菌總數(shù)的10%，纖維素酶產(chǎn)量低，對纖維素的酶解機理不明確，制約了褐腐真菌的應(yīng)用。

筆者篩選到一株褐腐真菌，樺剝管孔菌Piptoporus betulinus (Bull.) P. Karst.，該菌子實體形成于夏季和秋季，多發(fā)生于樺樹活立木和倒木上，可以快速降解木材引起褐色腐朽，是東北地區(qū)的常見種[7]。以稻草為固態(tài)基質(zhì)，培養(yǎng)P. betulinus固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶，優(yōu)化培養(yǎng)條件，在此基礎(chǔ)上，酶解固態(tài)基質(zhì)纖維素獲得還原糖。以期實現(xiàn)將固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶，褐腐真菌預(yù)處理，酶解纖維素三者耦合。

1 實驗

1.1 菌種與試劑

稻草收集于內(nèi)蒙古自治區(qū)通遼市奈曼旗農(nóng)田，洗凈自然風(fēng)干，粉碎后過40目篩。樺剝管孔菌P. betulinus由中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所保藏與提供。纖維素酶購自于上海葉源生物科技有限公司，Trichoderma vride G發(fā)酵所得，酶活力為160 FPU/g。實驗所用其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 麥芽浸粉平板培養(yǎng)基制備

麥芽浸粉20 g，瓊脂粉18 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然，121℃滅菌30 min。

1.3 發(fā)酵種子制備

從P. betulinus甘油保藏管中挑取菌絲接種于麥芽浸粉平板培養(yǎng)基，28℃黑暗培養(yǎng)，待菌落長到平板2/3處，用封口膜封好放入4℃冰箱保藏備用（保藏時間短于1個月）。用7 mm打孔器沿菌落邊緣打孔制備菌片作為種子。

1.4 固態(tài)發(fā)酵及條件優(yōu)化

在250 mL錐形瓶中添加3 g稻草粉作為固態(tài)基質(zhì)，再加入10 mL培養(yǎng)液，使培養(yǎng)基初始含水量約為77%。每瓶接種3個菌片，28℃黑暗靜置培養(yǎng)14 d。每個培養(yǎng)設(shè)2個重復(fù)。

分別配制濃度為1%（w/V）的淀粉、葡萄糖、木糖、乳糖、硫酸銨、硝酸鉀、蛋白胨和麥芽浸粉溶液作為培養(yǎng)液，考察碳源和氮源種類對固態(tài)發(fā)酵纖維素酶活力的影響。分別配制濃度為0.5%、1%、1.5%、2%（w/V）的淀粉或者蛋白胨培養(yǎng)液，考察碳源（氮源）濃度對固態(tài)發(fā)酵纖維素酶活力的影響。以初始pH分別為4、5、6、7的蒸餾水作為培養(yǎng)液，考察初始pH值對固態(tài)發(fā)酵纖維素酶活力的影響。加入1 g麩皮、花生殼粉，或者向培養(yǎng)液中加入終濃度為0.5%（w/V）的蘆丁、FeSO4（過濾除菌）、吐溫-80和愈創(chuàng)木酚，考察外源誘導(dǎo)物對固態(tài)發(fā)酵纖維素酶活力的影響。蒸餾水代替培養(yǎng)液作為對照組。

1.5 纖維素酶提取與測定

纖維素酶粗酶液的制備：發(fā)酵結(jié)束后，取60 mL檸檬酸緩沖溶液（50 mmol，pH＝4.8）加入到錐形瓶，玻璃棒攪拌發(fā)酵基質(zhì)，使其均勻分散，28℃水浴搖床震蕩提取4 h，上述提取液1.5 mL，4 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。

DNS法測定還原糖含量參見Miller建立的方法[8]。

濾紙酶活力及CMC酶活力的測定參見Ghose建立的方法[9]。酶活力定義為一定條件下，每分鐘催化生成1 μmol還原糖所需要的酶量為1個酶活力單位（U）。纖維素酶活力以固態(tài)發(fā)酵時每克基質(zhì)所產(chǎn)生的纖維素酶來表示（U/g），如式（1）所示。

式中m0為固態(tài)基質(zhì)初始質(zhì)量，3 g；m1為生成的葡萄糖總質(zhì)量，mg；1 000是轉(zhuǎn)化因子，1 mg＝1 000 μg；180是葡萄糖分子量；t為反應(yīng)時間，濾紙酶活力的反應(yīng)時間t是60 min，CMC酶活力的反應(yīng)時間t是30 min。

酶解發(fā)酵基質(zhì)纖維素實驗：根據(jù)纖維素酶產(chǎn)量差異，反應(yīng)體系補充纖維素酶和緩沖液，使酶用量達到20 U/g，固液比達到1∶20（w/V）；50℃水浴反應(yīng)48 h[10]，如式（2）所示。

式中，m0為固態(tài)基質(zhì)初始質(zhì)量，3 g；m前為酶解前還原糖總質(zhì)量，mg；m后為反應(yīng)48 h后的還原糖總質(zhì)量，mg。

1.6 X射線衍射表征

樣品61℃烘干，粉碎后過40目篩。衍射分析儀（帕納科Empyrean）測定固態(tài)基質(zhì)晶度，工作電壓為45 kV，工作電流為40 mA，掃描步長0.02o，掃描速度4o/min，掃描范圍5o～40o。根據(jù)公式（3）計算結(jié)晶度。

式中，CrI表示結(jié)晶度，ICr表示固態(tài)基質(zhì)結(jié)晶區(qū)衍射峰高度，即22o到23o之間的衍射峰最大值，Iamor表示固態(tài)基質(zhì)無定型區(qū)衍射峰高度，即為18o到19o之間的衍射峰最小值。

2 結(jié)果與討論

2.1 P. betulinus固態(tài)發(fā)酵纖維素酶條件優(yōu)化

2.1.1 碳源對固態(tài)發(fā)酵纖維素酶活力影響

分別以濃度為1%（w/V）的淀粉、葡萄糖、木糖、乳糖為碳源，考察碳源種類對固態(tài)發(fā)酵纖維素酶活力的影響，結(jié)果如圖1所示。添加碳源可以提高纖維素酶活力，加入葡萄糖時該菌CMC酶活力最高，達到11.48 U/g，而加入淀粉時該菌濾紙酶活力最高，達到3.59 U/g。纖維素水解主要關(guān)注濾紙酶活力，且相對于葡萄糖，淀粉價格更低，因此選擇淀粉作為外源碳源。

在培養(yǎng)基中添加0.5%～2%的淀粉，考察淀粉濃度對固態(tài)發(fā)酵纖維素酶活力的影響，結(jié)果表明不同淀粉濃度對纖維素酶產(chǎn)量影響不顯著（如圖2所示），這里選擇淀粉添加濃度為0.5%。固態(tài)基質(zhì)稻草含有豐富的纖維素和半纖維素，可以為菌體生長提供足夠的營養(yǎng)，且是纖維素酶發(fā)酵的誘導(dǎo)物。發(fā)酵初期，輔以簡單碳源，可以促進菌體生長代謝，分泌更多的胞外水解酶[11]。隨著菌體自身產(chǎn)酶能力增強，菌體以纖維素和半纖維素為營養(yǎng)，因此增加淀粉濃度并不能進一步提高濾紙酶活力。

圖1 添加不同碳源的條件下P. betulinus固態(tài)發(fā)酵纖維素酶活力

圖2 淀粉不同添加濃度的條件下P. betulinus固態(tài)發(fā)酵纖維素酶活力

2.1.2 氮源對固態(tài)發(fā)酵纖維素酶活力影響

分別以濃度為1%（w/V）的硫酸銨、蛋白胨、硝酸鉀、麥芽浸粉作為氮源，考察氮源種類對固態(tài)發(fā)酵纖維素酶活力的影響，結(jié)果如圖3所示。不同氮源對纖維素酶活力影響不同，硫酸銨、蛋白胨、麥芽浸粉表現(xiàn)為促進作用，但硝酸鉀表現(xiàn)為抑制作用，加入蛋白胨時CMC酶活力最高，達到17.43 U/g，濾紙酶活力達到2.65 U/g，是對照組的4.76倍和1.88倍。

在培養(yǎng)基中添加0.5%～2%的蛋白胨，考察蛋白胨濃度對固態(tài)發(fā)酵纖維素酶活力的影響，結(jié)果如圖4所示。當(dāng)?shù)鞍纂藵舛葟?.5%增加到1%時，CMC酶活力和濾紙酶活力為20.96 U/g和3.83 U/g，分別提高20.25%和44.53%，而進一步提高蛋白胨濃度，纖維素酶活力并沒有顯著增加。這是由于固態(tài)基質(zhì)稻草中的氮源含量較少，微生物生長初期和中后期均需要氮源營養(yǎng)，而當(dāng)?shù)春繚M足菌體生長要求時，增加蛋白胨濃度便不再促進纖維素酶活力提高[12]。

圖3 添加不同氮源的條件下P. betulinus固態(tài)發(fā)酵纖維素酶活力

圖4 蛋白胨不同添加濃度的條件下P. betulinus固態(tài)發(fā)酵纖維素酶活力

2.1.3 pH值對固態(tài)發(fā)酵纖維素酶活力影響

分別配制初始pH為4、5、6、7的培養(yǎng)液，考察初始pH值對固態(tài)發(fā)酵纖維素酶活力的影響，結(jié)果如圖5所示。固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值在4～7變化時，纖維素酶活力差異不顯著。這是由固態(tài)發(fā)酵本身特性決定的，固態(tài)發(fā)酵幾乎沒有自由水存在，水吸附在固態(tài)基質(zhì)上，因此pH值變化對固態(tài)發(fā)酵影響較小。纖維素酶解體系的最適pH值在4.8左右，因此發(fā)酵初始pH值定為5。

圖5 不同pH條件下P. betulinus固態(tài)發(fā)酵纖維素酶活力

圖6 添加不同誘導(dǎo)物的條件下P. betulinus固態(tài)發(fā)酵纖維素酶活力

2.1.4 誘導(dǎo)物對固態(tài)發(fā)酵纖維素酶活力影響

在獲得最適碳源、氮源、pH參數(shù)的基礎(chǔ)上，進一步考察了蘆丁、麩皮、花生殼、吐溫、愈創(chuàng)木酚、FeSO4對纖維素酶活力的影響，結(jié)果表明上述物質(zhì)均表現(xiàn)為促進作用（如圖6所示）。Tween-80是一種表面活性劑，可提高微生物細胞膜通透性，促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與酶的分泌，減少胞外酶在細胞膜的附著。愈創(chuàng)木酚是一種價格低廉的木質(zhì)素結(jié)構(gòu)類似物，可以顯著提高漆酶、錳過氧化物酶產(chǎn)量，而對纖維素酶活力的促進作用有限。Deswal研究認為Fe2+可以促進菌絲生長，纖維素酶分泌，可以與酶形成復(fù)合物，提高濾紙酶活力，這和本研究結(jié)果相似[13]。麩皮來源廣，價格低廉，營養(yǎng)物質(zhì)豐富，是生產(chǎn)纖維素酶的理想誘導(dǎo)物和底物。麩皮加入可以顯著提高CMC酶產(chǎn)量，達到76.46 U/g，是對照組的3.83倍。蘆丁顯著提高濾紙酶活力，達到7.75 U/g，是對照組的2.19倍。纖維素底物水解與濾紙酶活力密切相關(guān)，這里選擇蘆丁作為誘導(dǎo)物。一定濃度的蘆丁黃酮類物質(zhì)促進孢子萌發(fā)，菌絲生長及對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[14]，Qiu研究發(fā)現(xiàn)蘆丁黃酮類物質(zhì)促進Funalia trogii生產(chǎn)漆酶[15]，但黃酮對于纖維素酶發(fā)酵的促進作用尚屬首次，機理還有待研究。

2.2 不同階段固態(tài)基質(zhì)纖維素結(jié)晶度分析

結(jié)晶度是影響纖維素性質(zhì)的重要因素。纖維素包含結(jié)晶區(qū)和非結(jié)晶區(qū)，非結(jié)晶區(qū)纖維素含大量游離羥基，呈無定型狀態(tài)，可被微生物分泌的水解酶作用形成單糖。結(jié)晶區(qū)纖維素形成分子內(nèi)和分子間氫鍵，構(gòu)成氫鍵網(wǎng)絡(luò)，難以被酶水解。如表1所示，隨著發(fā)酵時間增加，發(fā)酵基質(zhì)的纖維素結(jié)晶度逐漸增大。研究發(fā)現(xiàn)褐腐真菌在胞外酶的協(xié)助下通過Fenton反應(yīng)參與降解無定型纖維素，為自身提供營養(yǎng)，但缺乏纖維二糖水解酶，而不能降解結(jié)晶區(qū)纖維素[16-17]。上述作用可以暴露纖維素結(jié)晶區(qū)，利于結(jié)晶纖維素被酶解糖化。

表1 不同發(fā)酵階段固態(tài)基質(zhì)結(jié)晶度

2.3 不同階段固態(tài)基質(zhì)酶解還原糖得率分析

最適條件下考察P. betulinus固態(tài)發(fā)酵不同階段纖維素酶產(chǎn)量差異。由圖7可知隨著發(fā)酵時間的增加，纖維素酶活力逐漸提高，發(fā)酵14d時纖維素酶活力達到最大，之后纖維素酶活力開始降低。這是由于隨著營養(yǎng)物質(zhì)的減少，菌體發(fā)生溶解，同時少量纖維素酶失活。

酶解糖化得率是表征生物質(zhì)預(yù)處理效果的重要指標，論文考察了不同階段固態(tài)基質(zhì)酶解糖化得率差異，結(jié)果如圖7所示。隨著發(fā)酵進行，固態(tài)基質(zhì)酶解糖化得率逐漸升高，發(fā)酵28 d固態(tài)基質(zhì)酶解糖化得率最大，達到201.4 mg/g，是未發(fā)酵組的2.84倍。固態(tài)發(fā)酵28 d后，P. betulinus濾紙酶活力為7.21 U/g，補充纖維素酶13.69 U/g。所產(chǎn)纖維素酶可以酶解纖維素，節(jié)省用酶量36.05%。纖維素酶活最高和固態(tài)基質(zhì)酶解糖化得率最高二者時間點并不一致，說明發(fā)酵后期褐腐真菌可以改變固態(tài)基質(zhì)物理化學(xué)結(jié)構(gòu)。Deswal利用Fomitopsis sp固態(tài)發(fā)酵生纖維素酶，將纖維素酶用于H2SO4和NaOH預(yù)處理的稻草和麥草[13]，Maeda利用Penicillium funiculosum固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶，用于酶解甘蔗渣，制備乙醇[18]，Sukumaran利用Trichoderma reesei和Aspergillus niger固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶，并利用粗酶液酶解糖化稻草[19]Singhania建立了纖維素酶固態(tài)發(fā)酵，底物酶解糖化，乙醇發(fā)酵一體化工藝，但忽略了微生物對固態(tài)基質(zhì)的預(yù)處理作用[20]。相對于上述研究，本論文更強調(diào)了預(yù)處理、發(fā)酵產(chǎn)酶、酶解三者間的耦合。

圖7 固態(tài)發(fā)酵不同階段纖維素酶活力及發(fā)酵基質(zhì)酶解糖化得率

3 結(jié)論

最適碳源是淀粉，最適氮源是蛋白胨，蘆丁作為誘導(dǎo)物，可以顯著提高褐腐真菌P.betulinus固態(tài)發(fā)酵纖維素酶活力；所產(chǎn)纖維素酶可用于發(fā)酵基質(zhì)的酶解糖化，節(jié)約纖維素酶用量36.05%；P. betulinus降解無定型纖維素，暴露纖維素結(jié)晶區(qū)，提高發(fā)酵基質(zhì)的酶解糖化得率184%。

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Integrative Process for Enzymatic Hydrolysis Employing SSF Produced Cellulase by Piptoporus Betulinus

Li Guan-hua, Shao Xiao-han, Yuan Lin*

（School of life sciences, Inner Mongolia University, Hohhot 010021, China）

A novel solid state fermentation (SSF) process with Piptoporus betulinus for cellulase production coupled with biological pretreatment was established. In this study, the conditions of SSF were optimized, and then the crystallinity index and the reducing sugar yield of fermented substrate was measured. The results showed that under the prepared optimum conditions of 0.5% starch, 1% peptone, 0.5% rutin and pH 5, using 3 g rice straw as substrate, the CMC enzyme activity and filter paper enzyme activity from SSF by Piptoporus betulinus could reach 76.46 U/g and 7.75 U/g, respectively. The crystalline cellulose of the fermented substrate was exposed due to the degradation of amorphous cellulose by P. betulinus. Moreover, the reducing sugar yield was increased by 184%, yet the cellulase dosage was decreased by 36.05% during the process of enzymatic hydrolysis of the fermented substrate.

brown rotten fungi; Piptoporus betulinus; solid state fermentation; cellulase; reducing sugar yield

Q815

A

1004-8405(2016)04-0019-07

10.16561/j.cnki.xws.2016.04.04

2016-04-20

國家自然科學(xué)基金項目（31560524）；內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金項目（2015BS0201）；內(nèi)蒙古大學(xué)2014年博士引進科研啟動經(jīng)費（21400-5145138）。

李冠華（1984~），男，博士，講師；研究方向：纖維素乙醇。liguanhua1984@126.com

* 通訊作者：苑 琳（1979~），女，副教授；研究方向：生防菌機理探索與應(yīng)用開發(fā)。yuan0079@163.com