原位細(xì)菌合成纖維素/殼聚糖納米纖維凝膠膜

張 鵬， 張青松， 陳 琳， 洪 楓,2*

（1. 東華大學(xué) 化學(xué)化工與生物工程學(xué)院 微生物工程與工業(yè)生物技術(shù)研究組，上海 201620；2. 東華大學(xué) 纖維材料改性國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201620）

原位細(xì)菌合成纖維素/殼聚糖納米纖維凝膠膜

張 鵬1， 張青松1， 陳 琳1， 洪 楓1,2*

（1. 東華大學(xué) 化學(xué)化工與生物工程學(xué)院 微生物工程與工業(yè)生物技術(shù)研究組，上海 201620；2. 東華大學(xué) 纖維材料改性國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201620）

為了改善天然納米細(xì)菌纖維素（BNC）的生物醫(yī)用特性，同時(shí)保留BNC與生俱來(lái)的納米纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，研究采用了原位靜置培養(yǎng)細(xì)菌合成法，在培養(yǎng)基添加溶解殼聚糖（CS），擬在BNC納米纖維合成時(shí)復(fù)合CS，從而獲得CS/BNC納米纖維復(fù)合凝膠膜。研究了對(duì)影響培養(yǎng)基中CS的溶解以及影響木葡糖酸醋桿菌原位合成的主要因素（包括CS濃度、溶解CS的酸種類(lèi)、pH值以及含CS培養(yǎng)基的滅菌工藝等）。結(jié)果表明，共滅菌的乙酸CS培養(yǎng)基的原位合成能夠較好地實(shí)現(xiàn)CS/BNC的原位復(fù)合構(gòu)想，并且該培養(yǎng)基所獲得的CS/BNC復(fù)合凝膠中，CS成功摻雜入納米纖維的內(nèi)部，并能在堿煮純化條件下仍能穩(wěn)定存在，CS含量可達(dá)干重的35%～48%。

納米細(xì)菌纖維素；殼聚糖；原位復(fù)合；靜置培養(yǎng)

納米細(xì)菌纖維素（bacterial nano-cellulose，BNC）由于具有天生類(lèi)似于細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）的納米纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)以及其它諸多優(yōu)秀的理化特性和生物相容性，因此被公認(rèn)為是一種理想生物醫(yī)用材料，在眾多的生物醫(yī)用產(chǎn)品中都有著美好應(yīng)用前景[1]。BNC納米纖維的高親水性，深亞微米級(jí)sub-100 nm）纖維細(xì)度及超高潤(rùn)濕狀態(tài)下的機(jī)械強(qiáng)度，目前均很難在其他人工材料上實(shí)現(xiàn)[2]，因此BNC醫(yī)用材料的來(lái)源依賴(lài)于木葡萄糖酸醋桿菌的生物合成。由于不同的應(yīng)用有不同的要求，因此必須對(duì)天然BNC材料進(jìn)行復(fù)合或者改性以滿足不同的需求。例如，對(duì)于生物醫(yī)用材料來(lái)說(shuō)，賦予材料一定的抗菌特性能夠大幅度降低使用過(guò)程中的細(xì)菌感染風(fēng)險(xiǎn)。由于纖維素本身并不具備抗菌特性，因此需要和其它抗菌材料進(jìn)行復(fù)合以改善其抗菌特性。

殼聚糖（chitosan，CS）是一類(lèi)天然的氨基多糖，能夠體內(nèi)降解，無(wú)毒副作用，生物相容性高，是一類(lèi)已經(jīng)廣泛應(yīng)用的生物材料。由于殼聚糖本身具備天然抗菌特性，且其表面的正電性氨基能夠改善纖維素超親水表面造成的細(xì)胞粘附性弱的問(wèn)題[3]，因此CS被認(rèn)為與BNC是優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，可以復(fù)合形成一種具備理想特性的生物醫(yī)用材料。目前常用的復(fù)合方式有三種：一是通過(guò)浸漬法將CS高分子通過(guò)擴(kuò)散進(jìn)入已獲得的BNC納米纖維網(wǎng)內(nèi)部[4-5]。但是，浸漬法將CS填充于BNC納米纖維網(wǎng)絡(luò)的纖維間隙中，極大地改變了BNC原先的類(lèi)ECM納米纖維微觀形貌；且由于采用浸漬方式，復(fù)合物可能由于擴(kuò)散作用而形成不均勻的梯度分布。第二種是將現(xiàn)成的BNC基材溶解或者勻漿分散后與CS混合，再采用人工再生的方式形成新的CS/BNC復(fù)合材料[6]。由于目前的人工手段尚難以重現(xiàn)BNC納米纖維及其微結(jié)構(gòu)，該方式將完全破壞BNC的納米纖維狀結(jié)構(gòu)。第三種是原位復(fù)合，即將CS分散于培養(yǎng)基中，在BNC基體合成的過(guò)程中與CS復(fù)合。原位復(fù)合中，目標(biāo)高分子可能被摻雜于納米纖維內(nèi)部，也可僅被包裹于納米纖維網(wǎng)內(nèi)，這取決于目標(biāo)復(fù)合物的溶解及分散程度。僅存在于纖維網(wǎng)絡(luò)間隙的高分子復(fù)合穩(wěn)定性較差，可能會(huì)在后續(xù)純化過(guò)程中從BNC基體內(nèi)流失[7]。BNC納米纖維合成是由菌體通過(guò)跨膜蛋白分泌纖維素原纖絲，并在胞外通過(guò)氫鍵、結(jié)晶的裝配形成寬約100 nm的納米纖維。纖維素與CS具有高度相似的β-1,4葡萄糖糖苷鏈結(jié)構(gòu)（如圖1所示），兩種分子間具有良好的親和性，能夠形成大量的氫鍵，因此溶解良好的CS分子可在BNC納米纖維的胞外裝配過(guò)程中摻雜于BNC原纖絲及分子鏈間形成CS/BNC復(fù)合納米纖維。因此，溶解CS原位合成CS/BNC復(fù)合納米纖維及其復(fù)合水凝膠是一種不改變BNC原有納米纖維狀結(jié)構(gòu)的理想復(fù)合方法。

目前國(guó)內(nèi)外原位復(fù)合CS/BNC材料報(bào)道較少，李朋等曾嘗試在培養(yǎng)基中添加CS以獲得CS/BNC原位復(fù)合膜，但是由于CS具有抗菌性，在培養(yǎng)基中添加CS后抑制了木葡萄糖酸醋桿菌生長(zhǎng)，因此未能成功獲得CS/BNC復(fù)合膜[8]。Phisalaphong和Ciechańska添加低濃度CS至培養(yǎng)基中成功獲得CS/BNC原位復(fù)合膜，但這些均是初步嘗試添加CS的培養(yǎng)效果，他們對(duì)CS在培養(yǎng)基中的溶解特征以及CS在CS/BNC原位復(fù)合物中的存在性質(zhì)未進(jìn)一步優(yōu)化研究[9-10]。他們所用培養(yǎng)基中CS含量約為0.25%～1%（w/V），而所獲BNC凝膠中纖維素含量約為1%（w/w），意味著原位培養(yǎng)獲得的復(fù)合凝膠中CS與BNC的質(zhì)量比大約可達(dá)1∶3（25% CS）至1∶1（50% CS）。然而最終獲得CS/BNC復(fù)合膜中實(shí)際CS含量?jī)H占膜干重的7%～10%[10]，表明培養(yǎng)基中的CS僅有少部分能夠成功摻雜入BNC基體內(nèi)，多數(shù)仍游離于凝膠的纖維間隙及培養(yǎng)基溶液中，CS摻雜復(fù)合率與利用率均較低。這可能是由于CS分子未充分分散溶解造成的，因此需要進(jìn)一步優(yōu)化CS的溶解情況，并對(duì)CS在CS/BNC復(fù)合膜中存在狀況做進(jìn)一步研究。CS的溶解對(duì)其在納米纖維中摻雜效果、抑菌性等均具有顯著影響，可決定所獲CS/BNC復(fù)合物中CS的摻雜比例及其存在穩(wěn)定性。為此，本研究采用低濃度水平CS原位復(fù)合，詳細(xì)探討了CS在培養(yǎng)基中的溶解方式和溶解酸種類(lèi)、CS濃度對(duì)原位合成的影響，考察了不同初始pH值及滅菌方式對(duì)原位培養(yǎng)的影響，并對(duì)CS在BNC納米纖維內(nèi)部的存在及組成情況進(jìn)行了分析表征。

圖1 纖維素與殼聚糖分子結(jié)構(gòu)

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

菌種：木葡糖酸醋桿菌ATCC 23770，本實(shí)驗(yàn)室保藏。

殼聚糖（脫乙酰度80.0%～95.0%，粘度50～800）、乙酸、乳酸、磷酸和鹽酸均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 原位復(fù)合培養(yǎng)基的配制

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)木葡糖醋酸桿菌培養(yǎng)基的配制

將葡萄糖25 g、胰蛋白胨5 g、酵母粉3 g溶解于1 L去離子水中，以硫酸調(diào)整pH至5.0±0.3，按裝液量100 mL/個(gè)分裝至10個(gè)250 mL三角瓶中，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2.2共混同步滅菌含CS的無(wú)菌培養(yǎng)基的配制

先配制系列濃度梯度的各類(lèi)酸（乙酸、乳酸、磷酸、鹽酸，如表1所示）溶液，然后分別添加質(zhì)量為0、2.5、5.0、7.5、10、15 g的CS至1 L所配制的酸溶液中充分溶解，獲得系列濃度梯度的CS酸溶液，再在CS酸溶液中添加培養(yǎng)基組分（葡萄糖25 g，胰蛋白胨5 g，酵母粉3 g），充分溶解，以獲得CS濃度為i（i＝0%、0.25%、0.50%、0.75%、1.0%、1.5%，w/V）的共混同步滅菌iCS培養(yǎng)基，按裝液量100 mL分裝至每個(gè)250 mL三角瓶中，最后110℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.2.3分步滅菌混合的含CS的無(wú)菌培養(yǎng)基的配制

配制2倍濃縮的系列濃度梯度的各類(lèi)酸（乙酸、乳酸、磷酸、鹽酸，如表2所示）溶液，然后分別添加質(zhì)量為0、2.5、5.0、7.5、10、15 g的CS至500 mL所配制的酸溶液中，充分溶解獲得2倍濃縮的系列濃度梯度CS酸溶液，按裝液量50 mL分裝至培養(yǎng)瓶，后110℃高壓蒸汽滅菌30 min。另取葡萄糖25 g，胰蛋白胨5 g，酵母粉3 g溶解于500 mL去離子水中，配制成2倍濃縮的培養(yǎng)基，后按裝液量50 mL分裝至培養(yǎng)瓶中，于110℃高壓蒸汽滅菌30 min。使用前，分別取2倍濃縮的系列濃度梯度CS酸溶液與2倍濃縮的培養(yǎng)基按體積比1∶1混合，獲得CS濃度為i（i＝0%、0.25%、0.50%、0.75%、1.0%、1.5%，w/V）的分步滅菌混合iCS培養(yǎng)基。

1.3 原位培養(yǎng)過(guò)程

以標(biāo)準(zhǔn)木葡糖醋酸桿菌培養(yǎng)基為種子液，取2環(huán)活化好的種子瓊脂斜面上的菌落，接種于含200 mL的500 mL三角瓶中，于160 r/min、30℃恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)12 h作為種子液。按照10 %（V/V）接種量，將培養(yǎng)物接種至各組培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)10天。以標(biāo)準(zhǔn)木葡糖醋酸桿菌培養(yǎng)基培養(yǎng)的BNC作為空白對(duì)照。

1.4 BNC和CS/BNC復(fù)合凝膠膜的純化

將原位培養(yǎng)獲得的BNC和CS/BNC復(fù)合凝膠膜從培養(yǎng)基中取出，以去離子水清洗膜的表面以除去其表面殘存培養(yǎng)基，再置于0.5%（w/V）的NaOH水溶液中80℃下堿煮，每2 h更新一次堿液，以除去存在于納米纖維素網(wǎng)絡(luò)中的菌體、細(xì)胞碎片和殘余培養(yǎng)基等，直至洗出堿液變得無(wú)色透明為止。之后用去離子水進(jìn)行反復(fù)置換，至置換液pH值接近中性為止。

1.5 BNC和CS/BNC復(fù)合膜的產(chǎn)量計(jì)算

將純化后BNC和CS/BNC凝膠膜置于聚四氟乙烯托盤(pán)內(nèi)，于105℃鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)烘干至衡重，測(cè)量其質(zhì)量為m1（g），其產(chǎn)量以單位體積培養(yǎng)基生產(chǎn)的干膜質(zhì)量計(jì)（g/L）。

1.6 CS/BNC復(fù)合凝膠膜的表征

1.6.1微觀結(jié)構(gòu)

將純化后的CS/BNC和BNC水凝膠膜用液氮速凍后，于－50℃、0.2 bar條件下凍干24 h。將凍干后的樣品表面低溫噴金后，置于場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（FE-SEM，S-4800，日立，日本）下觀察。

1.6.2 ATR-IR分析

復(fù)合膜的紅外特征采用全反射式反射紅外光譜儀（ART-FTIR-8400, Shimadzu Co. Japan）測(cè)定，測(cè)定波數(shù)范圍為4500 to 600 cm-1。

1.6.3元素組成及CS含量計(jì)算

復(fù)合膜中的CS的含量采用元素分析定量法，即通過(guò)測(cè)定復(fù)合樣品中的N元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最終來(lái)確定復(fù)合材料中的殼聚糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。將CS/BNC凍干膜用剪刀預(yù)先裁剪成均勻粉末狀小顆粒后混合均勻，精確稱(chēng)取50～100 mg樣品于自動(dòng)進(jìn)樣盤(pán)上，采用元素分析儀（Vario ELⅢ，Elementar Analyser Systems，德國(guó)哈瑙有限責(zé)任公司）測(cè)定樣品中的C、N、S、H各元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

根據(jù)CS/BNC復(fù)合膜材料遵循等式（1）的質(zhì)量守恒：CS/BNC樣品的總質(zhì)量（mCS/BNC）等于樣品中純BNC的質(zhì)量（mBNC）與復(fù)合進(jìn)的CS的質(zhì)量（mCS）之和，以及遵循等式（2）的氮元素守恒：CS/BNC樣品中的總氮質(zhì)量（Total N）等于復(fù)合材料中殼聚糖的N所占的質(zhì)量（PCS）和BNC中的N所占的質(zhì)量（PBNC）之和。

而CS/BNC復(fù)合物中的總氮的質(zhì)量（Total N）等于其樣品質(zhì)量（mCS/BNC）乘以CS/BNC復(fù)合材料的N含量（NCS/BNC），這樣N元素質(zhì)量守恒式（2）可以轉(zhuǎn)化為式（3）。

上述公式（3）可以進(jìn)一步重排，獲得CS/BNC樣品中的CS含量（αCS）計(jì)算表達(dá)式（4）。

2 結(jié)果與討論

2.1 溶解條件及方法對(duì)原位合成CS/BNC的影響

2.1.1不同酸對(duì)含CS培養(yǎng)基配制的影響

由于木葡萄糖酸醋桿菌僅在靜態(tài)培養(yǎng)的氣液界面處合成BNC凝膠膜，因此易沉降的未充分溶解的CS將無(wú)法和BNC很好地原位復(fù)合。另外，要使得CS在BNC纖維的細(xì)菌合成裝配過(guò)程中摻雜于復(fù)合納米纖維的內(nèi)部，需要CS充分溶解分散為分子形式，而未完全溶解的CS顆?；蛘邞乙侯w粒，由于尺寸大，僅能被包裹入BNC纖維網(wǎng)內(nèi)，無(wú)法完成BNC纖維的內(nèi)部摻雜。由于CS分子帶有可電離的胺基基團(tuán)（分子式如圖1所示），因此可以在酸液中溶解成溶液。本研究分別嘗試了乙酸、鹽酸、乳酸、磷酸這四種酸溶解CS，并配成相應(yīng)的含CS的培養(yǎng)基。

由于培養(yǎng)基中存在的糖及各種蛋白質(zhì)可以與CS的胺基相互結(jié)合，從而極大降低了CS可溶解能力，因此在前期配制培養(yǎng)基的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，將CS粉末溶解于已配制好加酸的液體培養(yǎng)基非常困難，溶解時(shí)間長(zhǎng)，CS難分散，容易形成團(tuán)聚小顆粒。因此本文的培養(yǎng)基的配制采用先獲得各濃度的酸性CS溶液，后添加培養(yǎng)基組分溶解的方案。另外，由于在配制的過(guò)程中，滴加NaOH回調(diào)pH時(shí)，溶液會(huì)瞬間出現(xiàn)大量不溶顆粒，因此采用了提前控制CS酸溶液濃度，以保證終點(diǎn)pH值，再利用培養(yǎng)基組分溶解過(guò)程中，該酸性CS溶液的pH值會(huì)由于培養(yǎng)基中蛋白等具有電離能力組分的溶解而逐漸上升，從而讓培養(yǎng)基pH值恢復(fù)至菌體最適宜pH范圍，從而避免了終點(diǎn)酸堿調(diào)節(jié)。

配制同步共滅菌含CS培養(yǎng)基時(shí)的酸添加濃度、pH和溶解情況如表1所示。結(jié)果顯示，采用鹽酸配制時(shí)CS溶解性能最高，在維持培養(yǎng)基pH5.0±0.4范圍時(shí)，獲得CS含量為0～1.5%（w/V）的培養(yǎng)基，其次為乙酸，能夠獲得CS濃度為0～1.0%的培養(yǎng)基。但是其中乙酸配制的1.0%CS含量的培養(yǎng)基，在滅菌冷卻后會(huì)立刻形成凝膠。這可能是CS與培養(yǎng)基中的蛋白或者多肽類(lèi)組分發(fā)生了受熱交聯(lián)，冷后逐漸聯(lián)接形成凝膠。類(lèi)似的，乳酸同樣能在pH4.5～5.0范圍下，獲得含0～1.0% CS的培養(yǎng)基，但是其中0.75%與1.0% CS培養(yǎng)基，在靜置培養(yǎng)時(shí)會(huì)逐漸在其底部出現(xiàn)凝膠，該凝膠難以與形成的BNC膜分離，且在后續(xù)堿煮和酸煮中均難以除去。磷酸對(duì)含CS培養(yǎng)基的溶解能力最弱，其在pH 4.5～5.0范圍下僅能制備含0.25% CS的培養(yǎng)基，即使pH低于4.5也難以溶解0.5%與0.75%的CS培養(yǎng)基。另外對(duì)于相同的CS添加量，提高酸濃度有利于CS在培養(yǎng)基中的溶解。譬如，乙酸中同樣采用1%（w/V）的CS添加濃度，當(dāng)乙酸濃度增加到6～7 g/L時(shí)，CS可以在培養(yǎng)基中完全溶解，但是相應(yīng)的pH值也降低至2.11～2.85（如表1所示）。2.1.2滅菌方式對(duì)CS培養(yǎng)基溶解的影響

表1 配制同步共滅菌含CS培養(yǎng)基的加酸、pH及溶解情況

如前所述，由于CS和培養(yǎng)基組分（葡萄糖、酵母粉、胰蛋白）共溶解后滅菌，多組出現(xiàn)了不溶性凝膠現(xiàn)象（表1：＃和△組）。這可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)基的組成（如蛋白或多肽）與CS發(fā)生熱交聯(lián)反應(yīng)，使得在高CS濃度條件下高壓蒸汽處理后容易形成凝膠，不利于進(jìn)一步用于CS/BNC的原位合成。因此，對(duì)于其中的乙酸制備的CS培養(yǎng)基，本研究也嘗試采用讓培養(yǎng)基組分與CS先各自配制成溶液分開(kāi)滅菌后，再于接種前將兩者混合配制的方案（如“1.2.3”中所述），其酸的添加比例以及培養(yǎng)基溶解和pH值得結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，雖然培養(yǎng)基中添加的乙酸、CS和培養(yǎng)基濃度與前面的共滅菌時(shí)相同，但是獲得的培養(yǎng)基最終pH值在4.4～4.6范圍，略低于共滅菌的乙酸溶解的CS培養(yǎng)基，且1.0% CS能夠較好溶解，未形成凝膠，這表明分開(kāi)滅菌方式下CS不會(huì)與培養(yǎng)基組分發(fā)生熱交聯(lián)，因此避免了不可逆凝膠的形成。

表2 配制分步滅菌的含CS培養(yǎng)基的pH值及溶解情況☆

2.1.3不同CS濃度培養(yǎng)基的原位靜置培養(yǎng)結(jié)果

以10%（V/V）接種量接入同步共滅菌含CS培養(yǎng)基（表1）及分步滅菌混合的含CS培養(yǎng)基（表2），分別進(jìn)行原位靜置培養(yǎng)，其產(chǎn)量如圖2所示，其部分培養(yǎng)基外觀如圖3所示。其中，添加大量乙酸以溶解CS的兩組培養(yǎng)基呈低pH水平的乙酸1% CS培養(yǎng)基（乙酸濃度6和7 g/L，pH 2.11～2.85），未生成任何BNC凝膠膜。這可能是由于高濃度的乙酸和極低的pH環(huán)境抑制了木葡糖酸醋桿菌的生長(zhǎng)和纖維素的合成能力，因此低pH條件下雖然有利于CS的溶解，但會(huì)抑制菌體的原位合成。此外，雖然鹽酸具有最好的CS溶解效果，但是所有CS濃度梯度的鹽酸CS培養(yǎng)基中，甚至僅以鹽酸調(diào)節(jié)pH未含CS的0.0%組均未見(jiàn)凝膠膜的生長(zhǎng)。這可能是由于氯離子本身對(duì)木葡糖酸醋桿菌的生長(zhǎng)具有較強(qiáng)的抑制性，有文獻(xiàn)報(bào)道曾指出該菌ATCC 23770對(duì)氯離子的耐受能力不超過(guò)20 mM[11]。磷酸同樣顯示出對(duì)該菌的抑制特性，其未含CS的磷酸組同樣未生成任何BNC膜，但是0.25% CS的磷酸培養(yǎng)基反而出現(xiàn)了少量不完整的膜（0.12 g/L，圖3D），原因尚不清楚。

圖2 不同CS培養(yǎng)基靜態(tài)培養(yǎng)的CS/BNC復(fù)合膜產(chǎn)量

圖3 不同CS濃度培養(yǎng)基的靜態(tài)原位培養(yǎng)

在以上各培養(yǎng)基組中，同步共滅菌的乙酸CS培養(yǎng)基和乳酸CS培養(yǎng)基，以及分步滅菌的乙酸CS培養(yǎng)基均有CS/BNC復(fù)合膜的生成。從培養(yǎng)基顏色上看，同步共滅菌的乙酸CS培養(yǎng)基和乳酸培養(yǎng)基的顏色隨著殼聚糖添加量的增加而加深（如圖3A和3E）。這是由于殼聚糖本身在蒸汽高溫作用下，顏色加深呈現(xiàn)褐色[12]；另外在共滅過(guò)程中，CS與培養(yǎng)基組分也會(huì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，從而顯現(xiàn)棕色。而對(duì)于分步滅菌的乙酸CS培養(yǎng)基，各CS濃度下的培養(yǎng)基顏色均比較接近，顯現(xiàn)淡棕色，即使未添加CS的0%組也呈現(xiàn)出明顯的棕色（如圖3B），這與采用共滅時(shí)0% CS組呈現(xiàn)的透明亮黃色明顯不同。分步滅菌培養(yǎng)基的顏色主要來(lái)自于所配制的2倍濃縮培養(yǎng)基，由于高濃度糖及蛋白胨在高溫滅菌時(shí)發(fā)生美拉德反應(yīng)程度大大高于常規(guī)培養(yǎng)基，因此顯現(xiàn)遠(yuǎn)甚于普通濃度培養(yǎng)基的深棕色（圖3 b-1）。2倍濃縮CS酸溶液在滅菌后均顯無(wú)色至淡黃色，顏色變化?。▓D3 b-2）。分滅過(guò)程避免了共滅過(guò)程中CS與培養(yǎng)基發(fā)生的顯色反應(yīng)。

同步共滅菌的乙酸CS培養(yǎng)基和乳酸CS培養(yǎng)基，以及分步滅菌的乙酸CS培養(yǎng)基在添加0.25%～1.0% CS后，獲得的CS/BNC復(fù)合膜的產(chǎn)量均比其相應(yīng)的0%組低。這主要是由于CS本身具有一定的抗菌性，即使在低濃度水平，還是對(duì)菌體產(chǎn)生了一定抑制。另外由于0.5%和0.75%乳酸CS培養(yǎng)基在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)形成凝膠，且凝膠與BNC膜粘附在一起，即使堿煮也無(wú)法除去（如圖3e1和3e2），所以測(cè)得CS/BNC凝膠膜量高于真實(shí)值，偏高，但是除去凝膠部分的實(shí)際產(chǎn)量無(wú)法測(cè)量。而對(duì)于同步共滅菌的0.25%、0.50%和0.75%乙酸CS培養(yǎng)基的CS/BNC復(fù)合膜產(chǎn)量分別為0.24、0.35和0.51 g/L，呈現(xiàn)出隨著CS添加量的增加而顯著增加的趨勢(shì)（α＝0.01，T-test），但是均低于相應(yīng)的0% CS培養(yǎng)基的BNC產(chǎn)量（1.45 g/L）。這可能是因?yàn)镃S維持在0.25%～0.75%的低濃度梯度水平，組間CS濃度差異較少，因此CS的抗菌性對(duì)菌體的影響差異較小，但是為了溶解CS，原培養(yǎng)基還需添加的大量乙酸，其初始乙酸濃度分別達(dá)到0.5、0.75和1.0 g/L。據(jù)報(bào)道，木葡糖酸醋桿菌不僅能夠利用乙酸作為其碳源用于能量代謝或者用于纖維素的生產(chǎn)，而且適量乙酸的存在能夠顯著增強(qiáng)BNC的生產(chǎn)[13]。本研究證實(shí)同步滅菌0%乙酸CS組的BNC產(chǎn)量（用乙酸調(diào)pH）要高于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基空白對(duì)照組的BNC產(chǎn)量（用硫酸調(diào)節(jié)pH）。而采用分步滅菌的0.25、0.50、0.75和1.0%乙酸CS培養(yǎng)基所獲得的CS/BNC復(fù)合膜產(chǎn)量分別為0.26、0.25、0.29和0.28 g/L，CS梯度間差異不顯著（α＝0.05，ANOVA）。這可能是由于分滅步驟中，濃縮培養(yǎng)基中高濃度的糖和培養(yǎng)基蛋白組分發(fā)生強(qiáng)烈的美拉德反應(yīng)，生成了更多的抑制物，反而不利于BNC的生產(chǎn)。這也使得分步滅菌組中，0%CS乙酸組的BNC產(chǎn)量低于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基空白對(duì)照的BNC產(chǎn)量。

綜上所述，乙酸適用于溶解CS，是CS/BNC原位合成的較好選擇，其中采用同步滅菌法的乙酸CS培養(yǎng)基可以獲得更大的CS/BNC復(fù)合材料產(chǎn)量，并且CS添加濃度梯度間區(qū)分比較明顯。

2.2 CS/BNC復(fù)合膜的表征

通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基的篩選可知，同步滅菌的乙酸CS培養(yǎng)基是最優(yōu)的原位制備培養(yǎng)基，因此采用該方案制備iCS/BNC復(fù)合膜材料（CS濃度i＝0%、0.25%、0.50%、0.75%），并對(duì)CS在材料中的復(fù)合情況進(jìn)行初步表征。

2.2.1微觀結(jié)構(gòu)觀察

圖4為采用0.5%乙酸CS培養(yǎng)基原位培養(yǎng)的0.5% CS/BNC復(fù)合膜、采用浸漬法將BNC凝膠膜浸漬于0.5% CS乙酸溶液中所獲得0.5% CS/BNC復(fù)合膜，以及純BNC的掃描顯微鏡（SEM）照片。從圖中可知，純BNC呈現(xiàn)出其典型的納米纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。雖然原位培養(yǎng)合成的0.5% CS/BNC仍然呈現(xiàn)出BNC典型的納米纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，但由于CS的抑菌性，使得所獲得的0.5% CS/BNC復(fù)合膜中的納米纖維網(wǎng)絡(luò)遠(yuǎn)遠(yuǎn)比純BNC的稀疏。而作為對(duì)照的采用浸漬法獲得的0.5% CS/BNC復(fù)合膜，明顯可見(jiàn)CS沉積于BNC納米纖維網(wǎng)的孔隙間和納米纖維表面，填充了纖維間隙。由此可見(jiàn)，原位培養(yǎng)合成的CS/BNC具有近似于原BNC的更好纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，且纖維間隙無(wú)明顯其它材料填充。

圖4 BNC和0.5% CS/BNC復(fù)合膜的顯微結(jié)構(gòu)圖（×5 000倍）

2.2.2 ATR-IR譜圖分析

純BNC（0.0%CS/BNC）和iCS/BNC復(fù)合膜的ATR-IR譜圖如圖5所示。由圖1可知纖維素與殼聚糖均具有類(lèi)似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，均含有D-葡萄糖環(huán)通過(guò)β-1,4糖苷鍵連接形成的多糖結(jié)構(gòu)。0.0%CS/BNC顯示出在3347.8 cm-1的羥基O-H的尖銳伸縮振動(dòng)峰，以及在2897 cm-1出現(xiàn)的C-H伸縮振動(dòng)峰。另一個(gè)重要的特征峰為葡萄糖環(huán)上的半縮醛的羰基的伸縮振動(dòng)峰，該峰位于1656 cm-1[14]。而在1200 cm-1至1000 cm-1的指紋區(qū)出現(xiàn)的連續(xù)的一系列峰組成了纖維素葡萄糖環(huán)特征峰，其由呋喃糖環(huán)上的半縮醛C-O-C伸縮振動(dòng)，伯羥基（C6）中的C-O伸縮振動(dòng)，仲羥基（C2、C3）上的C-O伸縮振動(dòng)，所組成的呋喃糖環(huán)特有的系列峰指紋譜。iCS/BNC復(fù)合膜顯示了與BNC相似的紅外吸收譜圖，但是不同之處在于，CS/BNC在BNC的2897 cm-1出現(xiàn)的尖銳C-H伸縮振動(dòng)峰附近，還存在著N-H的伸縮振動(dòng)（2875 cm-1），因而疊加形成更寬的峰。另外，iCS/BNC復(fù)合膜在1591 cm-1處具有一個(gè)尖銳的吸收峰，該吸收來(lái)自于N-H的彎曲振動(dòng)。由于纖維素與殼聚糖的主要化學(xué)結(jié)構(gòu)差異僅是后者在β-1,4葡萄糖鏈糖環(huán)的C2上存在一個(gè)氨基或乙酰氨基，因此該N-H彎曲振動(dòng)特征峰的存在，表明CS成功與BNC納米纖維網(wǎng)基體復(fù)合。另外，由于CS上的C2上還存在的乙酰氨基，CS/BNC復(fù)合膜在1654～1660 cm-1的羰基伸縮振動(dòng)峰明顯強(qiáng)于BNC的僅具有葡萄糖環(huán)上的半縮醛的羰基的伸縮振動(dòng)峰。

圖5 iCS/BNC（CS濃度i＝0.0%、0.25%、0.50%、0.75%）復(fù)合膜的ATR-IR圖

圖6 同步滅菌乙酸CS培養(yǎng)基原位培養(yǎng)制備的iCS/BNC的產(chǎn)量及CS組成

2.2.3元素分析及CS含量測(cè)定

通過(guò)元素分析，同步滅菌乙酸CS培養(yǎng)基所制備的iCS/BNC復(fù)合膜的C、N元素以及CS含量見(jiàn)表3，iCS/BNC的產(chǎn)量及組成如圖6所示。表3顯示0%CS/BNC中的N元素僅約0.1%，表明現(xiàn)有的堿煮純化處理方式能比較有效地除去BNC凝膠中殘余培養(yǎng)基組成和細(xì)胞，而iCS/BNC中N元素含量在3%左右（i為培養(yǎng)基中的CS添加濃度），顯著高于0%CS/BNC組（約30倍），顯然該N元素增量應(yīng)主要來(lái)自于摻雜復(fù)合的CS，并且CS能在8 h堿煮后穩(wěn)定地存在于BNC納米纖維內(nèi)。根據(jù)公式（4）計(jì)算同步滅菌乙酸培養(yǎng)基所獲得的iCS/BNC復(fù)合膜（i＝0.25%、0.50%、0.75%時(shí)）中的CS質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別達(dá)到48.26%、39.96%和35.54%（w/w）?？鄢鄳?yīng)的CS質(zhì)量占比后，各個(gè)CS添加濃度下獲得的相應(yīng)BNC實(shí)際產(chǎn)量分別為0.12、0.22和0.33 g/L（如圖6所示）。隨著培養(yǎng)基中CS濃度從0.25%增至0.75%，纖維素的產(chǎn)量并未下降，相反卻呈現(xiàn)出顯著增加的趨勢(shì)，但均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于0%CS/BNC。這可能主要是因?yàn)?，一方面CS的抗菌性對(duì)木葡糖酸醋桿菌具有顯著的抑制性作用，但另一方面CS濃度提高的同時(shí)也增加了乙酸的添加量，乙酸能被木葡糖酸醋桿菌利用并促進(jìn)BNC合成[13]。獲得的iCS/BNC復(fù)合膜中CS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)并未隨著CS添加濃度的增加而上升（本研究中反而隨著濃度的提高而下降），這是因?yàn)閺?fù)合膜中CS含量不僅取決于培養(yǎng)基中CS的濃度，而且也取決于BNC纖維素產(chǎn)量這兩方面因素的綜合影響。

表3 i CS/BNC復(fù)合膜中C、N元素及CS質(zhì)量百分率

3 結(jié)論

本文探索采用原位生物合成法，通過(guò)在培養(yǎng)基中溶解CS分子，使得CS在BNC納米纖維的生物裝配過(guò)程中，摻雜復(fù)合進(jìn)BNC納米纖維內(nèi)部，從而獲得了具有超細(xì)納米纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的CS/BNC復(fù)合凝膠膜。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)共滅菌的乙酸CS培養(yǎng)基的原位培養(yǎng)能夠較好地實(shí)現(xiàn)CS/BNC的原位復(fù)合構(gòu)想，CS能穩(wěn)定存在于精細(xì)的納米纖維內(nèi)部，并且在堿煮純化條件下仍能穩(wěn)定存在，CS組成可達(dá)復(fù)合膜干重的35%～48%，具有較高的復(fù)合效率。該復(fù)合材料兼具了BNC的類(lèi)細(xì)胞外基質(zhì)的納米纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)及CS材料特性，在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。但是由于受到CS抗菌特性的影響且在靜態(tài)發(fā)酵工藝中菌體受到溶氧及營(yíng)養(yǎng)物傳質(zhì)限制，菌體活性較低，CS/BNC原位復(fù)合膜的產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于無(wú)CS添加條件下BNC產(chǎn)量，且發(fā)酵生產(chǎn)周期漫長(zhǎng)，需要通過(guò)后期進(jìn)一步改進(jìn)培養(yǎng)工藝，通過(guò)提高菌體密度、菌體活性及抗逆特性并改善發(fā)酵過(guò)程中的傳質(zhì)來(lái)進(jìn)一步增強(qiáng)CS/BNC復(fù)合材料的生產(chǎn)。

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In Situ Biosynthesis of CS/BNC Nano-fibrillar Composite Hydrogels by Static Cultivations

ZHANG Peng1, ZHANG Qing-song1, CHEN Lin1, HONG Feng1,2*

（1. Group of Microbiological Engineering and Industrial Biotechnology, College of Chemistry, Chemical Engineering and Biotechnology, Donghua University, Shanghai 201620, China; 2. State Key Laboratory for Modification of Chemical Fibers and Polymer Materials，Donghua University, Shanghai 201620, China）

In order to improve the properties of bacterial nano-cellulose (BNC) for medical applications, chitosan (CS) was composited with BNC using In Situ biosynthesis of static cultivations, by which CS could be incorporated into BNC nanofiber during its assembly and formed CS/BNC nanofiber composite hydrogels. In this study, the effects of acid type, CS concentration, pH value and autoclaving procedure on dissolution of CS in culture media, as well as on CS/BNC biosynthesis of Gluconacetobacter xylinus, were investigated in detail. The CS-contained culture media, where CS and culture medium components were dissolved in acetic acid aqueous solutions and then autoclaved synchronously with the culture components, was the optimal media for CS/BNC composites biosynthesis. With the optimal media, CS was incorporated into BNC nanofiber successfully and existed stably in nanofibers with CS content of 35%～48%.

bacterial nano-cellulose; chitosan; In Situ biosynthesis; static cultivation

Q815；TB332

A

1004-8405(2016)04-0001-11

10.16561/j.cnki.xws.2016.04.09

2016-06-27

國(guó)家自然科學(xué)基金（51373031）；上海市科委項(xiàng)目（15520720800）；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金資助項(xiàng)目（2232014A3-04）；東華大學(xué)博士創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目（CUSF-DH-D-2013041）。

張 鵬（1988～），男，浙江淳安人，博士研究生；研究方向：新型細(xì)菌納米纖維素復(fù)合膜的制備及表征。

* 通訊作者：洪 楓（1970～），教授，博士生導(dǎo)師；研究方向：細(xì)菌纖維素的低成本高效制備及其應(yīng)用。fhong@dhu.edu.cn