惡性黑色素瘤靶向治療的研究進(jìn)展

趙莉娟 鄧辰亮 楊松林

惡性黑色素瘤靶向治療的研究進(jìn)展

趙莉娟 鄧辰亮 楊松林

惡性黑色素瘤是皮膚黑色素細(xì)胞來源的高度惡性腫瘤，發(fā)病機(jī)制尚未清楚，黑色素細(xì)胞痣惡變、紫外線照射、病毒感染等多種因素均與其發(fā)生有密切關(guān)系。由于其具有轉(zhuǎn)移早、病情隱匿的特點(diǎn)，早診斷、早治療是惡性黑色素瘤治愈的關(guān)鍵。當(dāng)前各種靶向治療在抗腫瘤領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用，如嵌合抗原抗體及攜帶藥物的重組外泌體與惡性黑色素瘤細(xì)胞的靶向結(jié)合，已在體外實(shí)驗(yàn)中取得了顯著效果?，F(xiàn)綜合國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，就嵌合抗原受體修飾T細(xì)胞（CAR-T）和外泌體用于治療惡性黑色素瘤的進(jìn)展綜述如下。

惡性黑色素瘤；靶向治療；嵌合抗原受體修飾T細(xì)胞（CAR-T）；人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒K包膜蛋白（HERV-K）；外泌體

惡性黑色素瘤（malignant melanoma）是起源于胚胎期神經(jīng)嵴的惡性腫瘤，其惡性度極高，預(yù)后較差?？砂l(fā)生于皮膚、眼球、消化道、生殖系統(tǒng)等部位，但其中以皮膚惡性黑色素瘤最常見[1]。由于惡性黑色素瘤惡性度高，易于早期轉(zhuǎn)移，即使早期進(jìn)行根治手術(shù)，患者5年生存率也低于70%[2]。免疫靶向治療與傳統(tǒng)化學(xué)療法相比優(yōu)勢(shì)明顯，因而日益成為治療惡性腫瘤的新方向。嵌合抗原受體修飾T細(xì)胞（chimeric antigen receptors T cell,CAR-T）是免疫靶向治療藥的代表之一，也是當(dāng)前過繼性細(xì)胞治療技術(shù)中的一項(xiàng)新成果，因其能表達(dá)人工合成受體并能特異性識(shí)別靶細(xì)胞，正成為振奮人心的腫瘤治療技術(shù)[3]。據(jù)報(bào)道，CD19特異性CAR-T已在B細(xì)胞白血病及淋巴瘤的臨床試驗(yàn)中取得了明顯療效[4-5]，其治療其他腫瘤的效果正進(jìn)行臨床預(yù)試驗(yàn)。國(guó)外實(shí)驗(yàn)報(bào)道，經(jīng)人工改造的外泌體及惡性黑色素瘤表面發(fā)現(xiàn)的人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒K（human endogenous retrovirus,HERV-K）包膜蛋白可為惡性黑色素瘤的免疫治療提供新的臨床思路[6]。

1 CAR-T在惡性黑色素瘤中的應(yīng)用

1.1 CAR-T 嵌合抗原受體（chimeric antigen receptors,CAR）是一種重組抗原受體，具有結(jié)合抗原并激活T細(xì)胞的功能。至目前為止，CAR已有3代設(shè)計(jì)模型。1991年有3個(gè)實(shí)驗(yàn)室首次報(bào)道了CAR的設(shè)計(jì)[7]，第1代CAR不含共刺激分子，只能引起T細(xì)胞的短暫增殖和低水平的細(xì)胞因子分泌，雖不能提供T細(xì)胞持續(xù)的抗腫瘤作用，但可使T細(xì)胞不依賴于主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibilitycomplex,MHC）-I類分子識(shí)別靶細(xì)胞。隨后Smith-Garvin等[8]構(gòu)造了含有CD28或4-1BB共刺激分子的2代CAR，在臨床前模型中發(fā)現(xiàn)4-1BB對(duì)CAR的功效更有益[9]。最近Long等[10]發(fā)現(xiàn)CD28信號(hào)是產(chǎn)生有效的臨床T細(xì)胞制品的關(guān)鍵，而4-1BB可提高CAR的細(xì)胞持久性，于是結(jié)合2個(gè)共刺激分子設(shè)計(jì)出了第3代CAR。CAR-T是將抗體的抗原結(jié)合部與CD3-δ鏈在體外偶聯(lián)成一個(gè)嵌合蛋白，通過基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)染患者的T細(xì)胞，T細(xì)胞經(jīng)“重編碼”后，可生成大量的腫瘤特異性CAR-T。CAR-T的大體治療過程分為4步：⑴抽取患者外周血，并分離提取出免疫T細(xì)胞；⑵通過基因工程給T細(xì)胞加入一個(gè)能識(shí)別腫瘤細(xì)胞并能同時(shí)激活T細(xì)胞的嵌合抗體，生成CAR-T；⑶體外培養(yǎng)，大量擴(kuò)增CAR-T細(xì)胞；⑷將擴(kuò)增好的CAR-T回輸?shù)交颊唧w內(nèi)。整個(gè)“提取——修飾——擴(kuò)增”過程大約需要2周。與傳統(tǒng)的T細(xì)胞識(shí)別抗原相比，經(jīng)CAR識(shí)別抗原不受MHC的限制，同時(shí)第2、3代CAR可通過共刺激分子信號(hào)加強(qiáng)T細(xì)胞的抗腫瘤效果。

1.2 CAR-T靶向治療惡性黑色素瘤 為了早期診斷惡性黑色素瘤，學(xué)者們?cè)趯で竺庖邩?biāo)志物方面做出了許多努力。有學(xué)者采用免疫組化檢測(cè)S-100、HMB-45、Tyrosinasa等多種標(biāo)志物在惡性黑色素瘤及良性痣中的表達(dá)[11]，發(fā)現(xiàn)這些標(biāo)志物在敏感性及特異性上都存在不足之處，更難以成為免疫治療的靶向。人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒K（human endogenous retroviruses-K,HERV-K）包膜蛋白是多種腫瘤細(xì)胞表面的相關(guān)性抗原[6,12-17]，包括乳腺癌、卵巢癌、惡性黑色素瘤等，其在正常細(xì)胞表面均不表達(dá)。HERV-K與惡性黑色素瘤的早期轉(zhuǎn)移潛能呈正相關(guān)性，Krishnamurthy等[6]利用HERV-K的腫瘤特異性，于T細(xì)胞表面設(shè)計(jì)相關(guān)CAR，發(fā)現(xiàn)CAR-T可特異性識(shí)別HERV-K并與其結(jié)合，發(fā)揮抗腫瘤作用。惡性黑色素瘤早期即可通過血液轉(zhuǎn)移，傳統(tǒng)的手術(shù)切除、化學(xué)療法、放射療法的效果不佳，預(yù)臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，嵌合HERV-K受體的T細(xì)胞（CAR-T）可準(zhǔn)確作用于表達(dá)HERV-K的腫瘤細(xì)胞表面，并殺傷腫瘤細(xì)胞。由于HERV-K在正常細(xì)胞表面無表達(dá)，其特異性表達(dá)于HIV、白血病及多種腫瘤細(xì)胞表面，因此，嵌合HERV-K受體的T細(xì)胞可用于多種腫瘤的治療。

此外，黑色素瘤細(xì)胞分化的抗原糖蛋白（glycoprotein,gp）100有較強(qiáng)的免疫原性，并在惡性黑色素瘤中過度表達(dá)，可作為惡性黑色素瘤靶向治療的靶點(diǎn)之一[18]。Johnson等[19]將對(duì)gp100有特異性反應(yīng)的T細(xì)胞分離后，將T細(xì)胞抗原受體轉(zhuǎn)染給惡性黑色素瘤患者的淋巴細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)19%患者的腫瘤體積發(fā)生減小。有學(xué)者將GPA7作為胞外區(qū)，結(jié)合T細(xì)胞的胞內(nèi)區(qū)設(shè)計(jì)出CAR-T細(xì)胞，經(jīng)轉(zhuǎn)染后的T細(xì)胞能特異性識(shí)別惡性黑色素瘤表面的gp100[20]。隨后將等量的CAR-T細(xì)胞與普通T細(xì)胞分別注射到惡性黑色素瘤小鼠模型中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射CAR-T細(xì)胞小鼠的腫瘤體積比注射普通T細(xì)胞小鼠的腫瘤體積明顯縮小。黏附分子L1-CAM在多種實(shí)體瘤，如惡性黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌中均有過度表達(dá)，有學(xué)者依據(jù)這類細(xì)胞表面標(biāo)志物特性設(shè)計(jì)相應(yīng)的CAR-T，在試驗(yàn)中取得了明顯的抗腫瘤效果[21]。

理論上靶向抗原應(yīng)該是特異性表達(dá)于惡性黑色素瘤細(xì)胞表面，在正常細(xì)胞和組織表面不表達(dá)，但實(shí)際上這種特異性靶向抗原非常少。例如Gp100、S-100、HMB-45、Tyrosinasa等在良性痣及白癜風(fēng)組織中均有表達(dá)，如果基于類似抗原設(shè)計(jì)CAR-T，很可能對(duì)正常組織產(chǎn)生攻擊作用，即脫靶效應(yīng)。HERV-K雖在多種實(shí)體瘤表面均有表達(dá)，但在正常細(xì)胞組織無表達(dá)，是目前治療惡性黑色素瘤最為理想的靶點(diǎn)。

2 外泌體在惡性黑色素瘤中的應(yīng)用

外泌體作為一種可以包裹藥物的載體，近年來也被用于腫瘤的靶向治療。外泌體是經(jīng)細(xì)胞分泌產(chǎn)生的一種自然產(chǎn)物[22]，它具有低免疫原性、無毒副作用[23]；且來源廣，具有磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，易于與靶細(xì)胞的細(xì)胞膜融合[24]；分子結(jié)構(gòu)小，分子量為納米級(jí)（10～100 nm），可避免單核細(xì)胞的吐噬作用，且易于穿透腫瘤組織毛細(xì)血管向深層組織浸潤(rùn)[25]?，F(xiàn)有試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，由內(nèi)皮細(xì)胞及干細(xì)胞分泌的外泌體作為抗腫瘤藥物的載體，其優(yōu)勢(shì)明顯、不良反應(yīng)小[26]。經(jīng)未成熟樹突狀細(xì)胞（imDCs） 分泌的外泌體因缺乏 CD40、CD86、MHC-I、MHC-II等表面標(biāo)志物[26]，免疫原性低，且imDCs-外泌體表面表達(dá)糖蛋白（Lamp2b），這種表面蛋白融合了iRGD靶向蛋白，可特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面的αⅤ整合素。目前，臨床上許多抗腫瘤藥物因劑量依賴性而應(yīng)用受限，如阿霉素對(duì)多種腫瘤均有抑制作用，但因其對(duì)心血管具有劑量依賴性而限制其應(yīng)用[27]。劑量依賴性產(chǎn)生的原因主要是藥物缺乏特異性作用于腫瘤細(xì)胞的載體，而廣泛作用于正常細(xì)胞引起。利用外泌體的靶向結(jié)合作用，可以將阿霉素等藥物直接作用于腫瘤細(xì)胞，從而減少對(duì)正常細(xì)胞造成的損傷。通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)過表達(dá)iRGD就可以得到大量攜帶iRGD的外泌體?；谶@一原理，Tian等[26]設(shè)計(jì)小鼠模型，將阿霉素整合到imDCs-外泌體中，發(fā)現(xiàn)融合iRGD靶向蛋白的外泌體能特異性作用于表達(dá)αⅤ整合素的乳腺腫瘤細(xì)胞，使外泌體通過胞吐釋放阿霉素，在體內(nèi)充分發(fā)揮抗腫瘤作用，并且通過切片觀察發(fā)現(xiàn)，并未損傷小鼠正常組織。還有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，融合iRGD靶向蛋白的外泌體對(duì)αⅤ整合素具有高度的特異性識(shí)別與親和力，在小鼠的乳腺癌模型中發(fā)揮顯著的靶向治療作用[27]。iRGD靶向蛋白不僅可以直接結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面的αⅤ整合素，還可以促使抗腫瘤藥物向腫瘤組織血管內(nèi)滲透[28]。αⅤ整合素在多種腫瘤細(xì)胞表面均有表達(dá)，其中惡性黑色素瘤細(xì)胞表面也特異性表達(dá)這類整合素，雖然目前無實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證外泌體作為藥物載體治療惡性黑色素瘤的有效性，但是，小鼠的乳腺癌模型為外泌體治療惡性黑色素瘤提供了臨床思路。

3 展望

惡性黑色素瘤是一種惡性程度較高的皮膚腫瘤，發(fā)生轉(zhuǎn)移后很難通過傳統(tǒng)治療得到有效的治療效果，繼手術(shù)、化學(xué)治療、放射治療手段后，免疫治療日益成為研究熱點(diǎn)。目前惡性黑色素瘤靶向治療的瓶頸在于尚未發(fā)現(xiàn)理想的靶向標(biāo)志物， HERV-K這類細(xì)胞表面標(biāo)志物存在于多種實(shí)體瘤表面，特異性相對(duì)較差，現(xiàn)國(guó)內(nèi)外學(xué)者正積極尋找惡性黑色素瘤的特異性抗原，相信這一新突破將為惡性黑色素瘤患者帶來福祉。

［1］Miller KD,Siegel RL,Lin CC,et al.Cancer treatment and survivorship statistics,2016[J].CA Cancer J Clin,2016,66(4):271-289.

［2］Mar VJ,Liu W,Devitt B,et al.The role of BRAF mutations in primarymelanomagrowth rateand survival[J].Br JDermatol,2015,173(1):76-82.

［3］Voena C,Chiarle R.Advances in cancer immunology and cancer immunotherapy[J].DiscovMed,2016,21(114):125-133.

［4］Jakel CE,Schmidt-Wolf IG.An update on new adoptive immunotherapy strategies for solid tumors with cytokine-induced killer cells[J].Expert Opin Biol Ther,2014,14(7):905-916.

［5］Schmeel FC,Schmeel LC,Gast SM,et al.Adoptive immunotherapy strategies with cytokine-induced killer(CIK)cells in the treatment of hematological malignancies[J].Int J Mol Sci,2014,15(8):14632-14648.

［6］Krishnamurthy J,Rabinovich BA,Mi T,et al.Genetic engineering of T Cells to target HERV-K,an ancient retrovirus on melanoma[J].Clin Cancer Res,2015,21(14):3241-3251.

［7］Curran KJ,Pegram HJ,Brentjens RJ.Chimeric antigen receptors for T cell immunotherapy:current understanding and future directions[J].J Gene Med,2012,14(6):405-415.

［8］Smith-Garvin JE,Koretzky GA,Jordan MS.T cell activation[J].Annu RevImmunol,2009,27:591-619.

［9］Song DG,Ye Q,Carpenito C,et al.In vivo persistence,tumor localization,and antitumor activity of CAR-engineered T cells is enhanced bycostimulatorysignalingthrough CD137(4-1BB)[J].Cancer Res,2011,71(13):4617-4627.

［10］Long AH,Haso WM,Shern JF,et al.4-1BB costimulation ameliorates T cell exhaustion induced by tonic signaling of chimeric antigen receptors[J].Nat Med,2015,21(6):581-590.

［11］陸愛權(quán),吳海清,覃宗升,等.S-100、HMB-45和Tyrosinase在惡性黑色素瘤中的表達(dá)及其意義[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2012,9(12):27-28.

［12］Jones RB,Garrison KE,Mujib S,et al.HERV-K-specific T cells eliminate diverse HIV-1/2 and SIV primary isolates[J].J Clin Invest,2012,122(12):4473-4489.

［13］KimHJ,Moon BI,Lee JW,et al.Age-related reduction ofantibody response against the human endogenous retrovirus K envelope in women[J].Oncotarget,2016,7(14):17327-17337.

［14］De Flora S,La Maestra S.Epidemiology of cancers of infectious origin and prevention strategies[J].J Prev Med Hyg,2015,56(1):E15-E20.

［15］Zhou F,Krishnamurthy J,Wei Y,et al.Chimeric antigen receptor T cells targeting HERV-K inhibit breast cancer and its metastasis through downregulation of Ras[J].Oncoimmunology,2015,4(11):e1047582.

［16］Li Z,Sheng T,Wan X,et al.Expression of HERV-K correlates with status of MEK-ERK and p16INK4A-CDK4 pathways in melanoma cells[J].Cancer Invest,2010,28(10):1031-1037.

［17］Reiche J,Pauli G,Ellerbrok H.Differential expression of human endogenous retrovirus K transcripts in primaryhuman melanocytes and melanoma cell lines after UV irradiation[J].Melanoma Res,2010,20(5):435-440.

［18］Barrow C,Browning J,MacGregor D,et al.Tumor antigen expression in melanoma varies according to antigen and stage[J].Clin Cancer Res,2006,12(3 Pt 1):764-771.

［19］Johnson LA,Morgan RA,Dudley ME,et al.Gene therapy with human and mouse T-cell receptors mediates cancer regression and targets normal tissues expressingcognate antigen[J].Blood,2009,114(3):535-546.

［20］Zhang G,Wang L,Cui H,et al.Anti-melanoma activity of T cells redirected with a TCR-like chimeric antigen receptor[J].Sci Rep,2014,4:3571.

［21］HongH,StastnyM,Brown C,et al.Diverse solid tumors expressing a restricted epitope of L1-CAM can be targeted by chimeric antigen receptor redirected T lymphocytes[J].J Immunother,2014,37(2):93-104.

［22］Tan L,Wu H,Liu Y,et al.Recent advances of exosomes in immune modulation and autoimmune diseases[J].Autoimmunity,2016,3:1-9.

［23］Alvarez-Erviti L,Seow Y,Yin H,et al.Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes[J].Nat Biotechnol,2011,29(4):341-345.

［24］Lakhal S,Wood MJ.Exosome nanotechnology:an emerging paradigm shiftin drug delivery:exploitation ofexosome nanovesicles for systemic in vivo delivery of RNAi heralds new horizons for drugdeliveryacross biological barriers[J].BioEssays,2011,33(10):737-741.

［25］van den Boorn JG,Schlee M,Coch C,et al.SiRNA delivery with exosome nanoparticles[J].Nat Biotechnol,2011,29(4):325-326.

［26］Tian Y,Li S,Song J,et al.A doxorubicin delivery platform using engineered natural membrane vesicle exosomes for targeted tumor therapy[J].Biomaterials,2014,35(7):2383-2390.

［27］Li HQ,Wu YB,Yin CS,et al.Obestatin attenuated doxorubicininduced cardiomyopathy via enhancing long noncoding Mhrt RNA expression[J].Biomed Pharmacother,2016,81:474-481.

［28］Kandela I,Chou J,Chow K,et al.Correction:Registered report:Coadministration of a tumor-penetrating peptide enhances the efficacyofcancer drugs[J].Life,2015,4(200):188-200.

2016-07-24）

10.3969/j.issn.1673-7040.2017.01.017.

10.3969/j.issn.1673-7040.2017.01.017

上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院 整形外科，上海 200233

楊松林,Email:yangsonglin1961@vip.qq.com

本文引用格式：趙莉娟，鄧辰亮，楊松林.惡性黑色素瘤靶向治療的研究進(jìn)展[J].中國(guó)美容整形外科雜志,2017,28(1):57-59.