線粒體自噬在缺血性卒中的機(jī)制研究與展望

關(guān)瑞橋，鄒偉，孫曉偉，于學(xué)平，張莑，袁夢飛，戴曉紅，滕偉，于薇薇

卒中是人類致殘和致死的主要病因之一。美國心臟協(xié)會（American Heart Association，AHA）將卒中分為缺血性卒中、出血性卒中以及短暫性腦缺血3個種類[1]。其中缺血性卒中占每年報(bào)道的大多數(shù)，比例為85%，其他非創(chuàng)傷性的腦出血占總比例的15%。目前缺血性卒中主要治療藥物仍然是美國食品和藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）認(rèn)證的阿替普酶，但是阿替普酶由于必須在癥狀發(fā)現(xiàn)開始4.5 h內(nèi)使用，這種嚴(yán)格的使用限制，導(dǎo)致僅有3%～8%的患者得以接受治療[2]。因此，研發(fā)新的治療手段，延長卒中治療的時間窗是目前卒中治療亟待解決的問題。

1 經(jīng)典自噬

自噬是一種通過自噬體—溶酶體途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)化的一種進(jìn)化保守過程，其主要作用是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，迅速適應(yīng)能量饑餓環(huán)境，以維持正常生理機(jī)能，并且能夠在一定程度上保證應(yīng)激條件下生物細(xì)胞的存活[3-4]。經(jīng)典自噬反應(yīng)中最關(guān)鍵的過程是細(xì)胞質(zhì)的一部分分離出來形成一個新的區(qū)間，即為“自噬體”。自噬體的形成依賴于一系列的動態(tài)膜事件：首先在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成一個隔膜小囊（吞噬泡或隔離膜），然后擴(kuò)張成一個杯型結(jié)構(gòu)，隨后又成為一個封閉結(jié)構(gòu)，最后成為一個雙膜結(jié)合結(jié)構(gòu)，成為一個成型的“自噬體”，其內(nèi)部包含一部分細(xì)胞質(zhì)。這個自噬體隨后與溶酶體相融合，其內(nèi)膜與內(nèi)容物被溶酶體水解酶分解。最后自噬體溶酶體成為一個殘余體，被分解的物質(zhì)，例如氨基酸被運(yùn)送回細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，作為物質(zhì)原料或能量來源被重新利用[5]。

2 線粒體自噬與卒中

雖然經(jīng)典自噬通常被認(rèn)為是一種非特異性自噬，但是有證據(jù)表明，一些細(xì)胞器例如線粒體和過氧化物酶體更容易被識別并發(fā)生自噬反應(yīng)，這種過程稱為線粒體自噬和過氧化物酶體吞噬[6]。其中線粒體自噬是一種目前被廣泛研究的選擇性自噬，其主要作用為清除破壞的線粒體以保持線粒體在細(xì)胞中的穩(wěn)態(tài)[7]。其過程與經(jīng)典自噬類似。壞死的線粒體導(dǎo)致的神經(jīng)功能下降與包括卒中在內(nèi)的多種疾病相關(guān)，其機(jī)制包括：①嘌呤受體激發(fā)的三磷腺苷（adenosine triphosphate，ATP）增加；②超氧化物歧化酶導(dǎo)致的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）含量增加；③亞甲藍(lán)引發(fā)的抗氧化防御，在卒中情況下可保護(hù)神經(jīng)元[8]。因此在卒中發(fā)生過程當(dāng)中，調(diào)節(jié)控制線粒體數(shù)量和質(zhì)量的線粒體自噬過程，可能對治療卒中、延緩細(xì)胞死亡、保護(hù)神經(jīng)元有十分關(guān)鍵的意義。

3 缺血性卒中過程中影響線粒體自噬的主要因素

3.1 ROS機(jī)制 ROS是氧化應(yīng)激反應(yīng)中重要信號分子，在卒中病理表現(xiàn)中，例如腦缺血、缺血后再灌注情況下，ROS的相對過量將破壞細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)以及線粒體功能喪失[9]。氧化應(yīng)激反應(yīng)條件下的ROS含量增加，超出細(xì)胞在自然情況下的處理ROS的能力時，導(dǎo)致氧化應(yīng)激以及隨后細(xì)胞死亡通路的激活[10]。線粒體自噬負(fù)責(zé)清除由線粒體產(chǎn)生的ROS，適當(dāng)?shù)那宄€粒體可以減少氧化應(yīng)激反應(yīng)。例如WEI等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，鎘離子（cadmium，Cd）可以誘發(fā)腦組織中的ROS過量，在Cd處理的腦組織，線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）被破壞，線粒體自噬體生成，PINK1水平增高以及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例增高，線粒體質(zhì)量下降，以上指標(biāo)說明了線粒體自噬反應(yīng)增加；相反的清除ROS可以恢復(fù)MMP，提高線粒體的質(zhì)量，抑制PINK1表達(dá)，抑制Parkin向線粒體的聚集，降低LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率，說明ROS與Cd誘發(fā)的腦線粒體自噬相關(guān)，并且證明了ROS通過調(diào)節(jié)PINK1/Parkin通路上游，調(diào)整Cd誘發(fā)的線粒體自噬。

3.2 線粒體通透性改變（mitochondrial permeability transition，MPT）機(jī)制 線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔張開導(dǎo)致一系列破壞性反應(yīng)，伴隨在短時間內(nèi)大量釋放ROS和鈣離子[12]。線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔在病理中的作用被廣泛研究，在卒中缺血再灌注損傷中也較為常見，尤其是在ROS過量或鈣離子超載的情況下。MPT的發(fā)生使線粒體內(nèi)膜滲透性增加可導(dǎo)致電化學(xué)梯度消失引起的線粒體去極化[13]，進(jìn)而導(dǎo)致ATP合酶在逆轉(zhuǎn)過程中消耗ATP。

在卒中發(fā)生后給予迅速地再灌注，與此過程相關(guān)的線粒體滲透性轉(zhuǎn)換，起初由環(huán)孢霉素A通過與親環(huán)蛋白D結(jié)合抑制轉(zhuǎn)換孔打開使組織梗死顯著降低至65%～90%[14]。并且環(huán)孢霉素A還可以通過抑制蛋白質(zhì)磷酸酶、鈣依賴磷酸酶起到保護(hù)作用。MPT在細(xì)胞自噬、凋亡以及壞死過程中起重要作用。在低應(yīng)激條件下，有限程度的MPT僅會增加線粒體自噬作為保護(hù)機(jī)制的發(fā)生，使其清除破壞的線粒體。而在過度應(yīng)激條件下，將導(dǎo)致凋亡的發(fā)生[15]。

4 缺血性卒中相關(guān)的經(jīng)典線粒體自噬通路

目前已知細(xì)胞通過幾種機(jī)制執(zhí)行線粒體自噬，包括調(diào)節(jié)線粒體去極化的PINK1/Parkin途徑，及應(yīng)激誘發(fā)的BNIP3、NIX以及與LC3直接相互作用的分子銜接子FUNDC1，以上機(jī)制均能夠促進(jìn)線粒體自噬的發(fā)生。以下分別介紹各通路或蛋白調(diào)節(jié)線粒體自噬的機(jī)制以及各個機(jī)制與卒中的病理關(guān)系及其研究進(jìn)展。

4.1 PINK Parkin信號通路的機(jī)制與缺血性卒中 Pink1-Parkin通路是線粒體自噬中的典型信號通路之一。帕金森患者大腦中發(fā)現(xiàn)有功能喪失的線粒體聚集表現(xiàn)，說明了PINK1和Parkin與線粒體質(zhì)量控制的關(guān)系[16]。Pink1編碼PTEN誘發(fā)的蛋白激酶是一種包含線粒體定向序列的氨酸-蘇氨酸激酶，Parkin是一種E3泛素連接酶[17]。

PINK1-Parkin通路在在卒中疾病中的研究較少，可能是因?yàn)镻arkin最初在帕金森疾病中被發(fā)現(xiàn)，但近年來關(guān)于該機(jī)制在卒中，尤其是缺血性卒中中的研究有所增加，在一定程度上闡明了PINK1-Parkin通路參與卒中疾病腦損傷的過程。例如ZHANG等[18]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Parkin在大鼠短暫性大腦中動脈阻塞模型再灌注后3 h有明顯下調(diào)，與“自噬潮”高峰的時間相符，說明以Parkin為標(biāo)記的線粒體被自噬反應(yīng)清除。線粒體功能喪失以及氧化應(yīng)激是卒中神經(jīng)病理學(xué)的主要影響因素。PINK1蛋白的基礎(chǔ)研究證明了它在氧化應(yīng)激條件下的促細(xì)胞成活作用，然而其機(jī)制并未明確。SAFARPOUR[19]的實(shí)驗(yàn)探究了PINK1在神經(jīng)元保護(hù)機(jī)制中，尤其是在缺血性卒中條件下的作用。研究發(fā)現(xiàn)，PINK1的缺乏引發(fā)神經(jīng)元中谷氨酸鹽誘發(fā)的神經(jīng)興奮性中毒反應(yīng)；PINK1的激酶結(jié)構(gòu)域是PINK1參與神經(jīng)元保護(hù)作用的必要條件，而不是線粒體靶向序列；另外，PINK1或Parkin的缺乏可明顯加重大鼠大腦中動脈阻塞體積。

4.2 NIX/BNIP3調(diào)節(jié)的線粒體自噬與卒中

BNIP3為一種凋亡前體線粒體蛋白，NIX/Bnip3L是BNIP3同族蛋白，并且有55%的同源氨基酸序列[20]。BNIP3是一種特殊的線粒體死亡誘導(dǎo)蛋白亞種蛋白，與線粒體功能喪失以及包括卒中在內(nèi)的神經(jīng)元死亡有密切關(guān)系[21]。

SHI等[22-23]的研究表明，大鼠發(fā)生卒中的大腦缺血缺氧條件下BNIP3的缺乏可引起線粒體自噬反應(yīng)程度下降，同時細(xì)胞凋亡水平也隨之下降，而非選擇性自噬水平上調(diào)。線粒體的BNIP3與自噬體標(biāo)志蛋白LC3相關(guān)，說明BNIP3與NIX相似，都可作為線粒體上的LC3結(jié)合受體。但是當(dāng)BNIP3基因沉默時，NIX表達(dá)上調(diào)，但上調(diào)的NIX在病理?xiàng)l件下并不能補(bǔ)償BNIP3的功能。實(shí)驗(yàn)還說明了，NIX的作用為在正常生理?xiàng)l件下調(diào)節(jié)基本水平的線粒體自噬，而BNIP3主要引起過度的線粒體自噬，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。

BNIP3與其他蛋白相關(guān)的機(jī)制較為復(fù)雜而多樣，并且在卒中疾病中可能存在一定的特殊性，例如BNIP3與Mieap蛋白（一種P53誘導(dǎo)蛋白）在ROS依賴的反應(yīng)過程下的相結(jié)合，并且Mamie、BNIP3和NIX的共同表達(dá)導(dǎo)致MMP明顯下降，該機(jī)制與溶酶體蛋白從細(xì)胞質(zhì)向線粒體基質(zhì)轉(zhuǎn)移相關(guān)[24]。再例如，EndoG是一個BNIP3激動的自噬性死亡通路的中介蛋白，并且BNIP3在卒中當(dāng)中導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞自噬性死亡的過程是非caspase依賴性的[25]。

4.3 FUNDC 1調(diào)節(jié)的線粒體自噬與卒中

FUNDC1是一種新發(fā)現(xiàn)的在哺乳動物細(xì)胞缺氧條件下誘發(fā)的線粒體銜接子，通過LIR機(jī)制與LC3直接結(jié)合。在缺氧條件下，作為自噬反應(yīng)起始前復(fù)合物的重要組成——ULK1激酶，向FUNDC1發(fā)生磷酸化的線粒體轉(zhuǎn)移，促進(jìn)FUNDC1與LC3相互作用進(jìn)而促進(jìn)線粒體自噬[26]。

另一項(xiàng)最新研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)UNDC1是一種線粒體結(jié)合的膜蛋白，在缺氧條件下，F(xiàn)UNDC1通過與ER上的CANX蛋白相互作用而在膜上富集。在線粒體自噬過程中，F(xiàn)UNDC1與CANX分離，并且招募DNM1L/DRP1導(dǎo)致缺氧應(yīng)激條件下的線粒體分裂[27]。但是目前關(guān)于FUNDC1在卒中病理中的研究仍未見報(bào)道。

5 線粒體自噬在缺血性卒中的兩面性

目前已知，基礎(chǔ)水平的線粒體自噬是在正常生理情況下控制線粒體質(zhì)量的必要反應(yīng)，那么它在缺血性卒中中起到什么樣的作用？是有利的，還是有害的？這個問題在開始就有一定的爭議性，至今這個問題仍然是討論的熱點(diǎn)。例如有研究結(jié)果提出，過度的線粒體自噬可導(dǎo)致加速浦肯野細(xì)胞死亡[28-29]。因此，線粒體自噬是一把雙刃劍，當(dāng)輕度病理應(yīng)激條件下，作為一種保護(hù)機(jī)制；而在嚴(yán)重病理應(yīng)激條件下，例如缺血性卒中，是一種導(dǎo)致細(xì)胞死亡的有害機(jī)制[30]。另外自噬反應(yīng)在腦缺血和缺血后再灌注階段可能有不同作用，例如，ZHANG等[31]的研究發(fā)現(xiàn)與永久性腦缺血相反，在再灌注階段用3-MA抑制自噬，加重了而不是減輕了I-R誘發(fā)的細(xì)胞損傷，并且得出結(jié)論在再灌注階段自噬作用的保護(hù)作用可能通過線粒體自噬以及對凋亡下游的抑制實(shí)現(xiàn)。因此可以推測調(diào)整過度表達(dá)的線粒體自噬途徑，控制線粒體自噬和凋亡過程或許可以成為延緩細(xì)胞死亡過程的一個潛在機(jī)制，可以為今后研制卒中的有效治療手段提供有利依據(jù)。

6 問題與展望

從線粒體自噬方面探究缺血性卒中能更好地理解其病理機(jī)制，近年來對于線粒體自噬的分子調(diào)節(jié)方面的研究有了很大的進(jìn)展，但是仍有很多問題等待在以后的研究中被解決，例如線粒體自噬在缺血性卒中的不同階段各有怎樣的作用，其機(jī)制如何；以及如何利用線粒體自噬達(dá)到臨床治療的目的。以上問題在未來的研究當(dāng)中仍需要進(jìn)一步探究。另外，尋找在線粒體自噬方面的神經(jīng)保護(hù)制劑是減少卒中導(dǎo)致的死亡和殘疾的關(guān)鍵，例如在最近的研究中LIN等[32]發(fā)現(xiàn)，在創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）模型中，褪黑素可通過mtor通路激發(fā)線粒體自噬的發(fā)生，進(jìn)而減輕由TBI引發(fā)的炎癥反應(yīng)。褪黑素治療可明顯減少神經(jīng)元死亡，減輕TBI發(fā)生后的神經(jīng)功能缺損癥狀。在今年最新發(fā)表的研究中，SHEN等[33]發(fā)現(xiàn)在大鼠大腦中動脈阻塞后，酸性處理誘發(fā)的PARK2依賴的線粒體自噬對局灶性腦缺血以及時間窗的延長作用，可將再灌注時間窗從2 h延長至4 h；而PARK2的外源性表達(dá)可將時間窗延長至6 h。

對于上述問題的解答不僅可以明確卒中和線粒體自噬之間的關(guān)系，并且能為人類發(fā)現(xiàn)治療卒中的有效方案提供有力依據(jù)。

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