長鏈非編碼RNA與卒中的關(guān)系研究進(jìn)展

芮陽剛，顏丙春

在人類基因組中，超過90%的基因被轉(zhuǎn)錄成核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），其中具有蛋白編碼功能的基因只有3%左右，大部分被轉(zhuǎn)錄成無蛋白編碼功能的非編碼RNA[1]。根據(jù)非編碼核糖核酸（noncoding RNA，ncRNA）長度，將ncRNA主要分為小非編碼RNA和長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）。lncRNA在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因表達(dá)，從而參與機體生理病理過程[2-3]。卒中是以腦部缺血及出血性損傷癥狀為主要臨床表現(xiàn)的疾病，以缺血性卒中最為常見。有研究發(fā)現(xiàn)，卒中可明顯改變大腦中信使RNA（mRNA）和ncRNA的表達(dá)，尤其在缺血性卒中方面，局部腦缺血后誘導(dǎo)大腦中一系列l(wèi)ncRNA表達(dá)模式的改變[4]，這提示lncRNA與卒中存在密切的關(guān)系，本文就lncRNA與卒中的相關(guān)研究作一綜述。

1 lncRNA概述

1.1 lncRNA定義 lncRNA是非編碼RNA分子中的一類，其轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt，在200 nt～100 kb之間，存在于胞漿內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)，普遍轉(zhuǎn)錄于真核細(xì)胞內(nèi)且缺少蛋白編碼功能，其以RNA的形式在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控及表觀遺傳調(diào)控等層面調(diào)控基因的表達(dá)水平[5]。

1.2 lncRNA分類 根據(jù)目前的文獻(xiàn)，lncRNA有幾種不同的分類。從基因的角度可以將lncRNA分為5類：①同義；②反義；③雙向型，其表達(dá)起始位點與互補鏈上相鄰編碼轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)起始位點在基因位點上距離十分相近；④內(nèi)含子型，從另一個轉(zhuǎn)錄物內(nèi)含子中得到的lncRNA；⑤基因間型，lncRNA作為獨立單元處于兩個基因之間。lncRNA在高等真核生物細(xì)胞中大量轉(zhuǎn)錄，許多已知的lncRNA由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄、可變剪切，并且常被多聚腺苷酸化。另一個分類包括高含量集中和低含量集中l(wèi)ncRNA，一些文獻(xiàn)按功能將其分為順式和反式[6-7]。

1.3 lncRNA作用機制 ①lncRNA可通過細(xì)胞周期調(diào)控、剪接調(diào)控、mRNA降解、基因印記、染色質(zhì)重塑等形式參與轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和表觀遺傳水平調(diào)控生物學(xué)過程。許多l(xiāng)ncRNA參與各種RNA-蛋白質(zhì)以及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的形成，其作為支架分子發(fā)揮作用，依靠自身不同的效應(yīng)分子結(jié)合結(jié)構(gòu)域，為調(diào)控復(fù)合物提供一個平臺。②lncRNA調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性和位點。作為引導(dǎo)分子指導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白定位到特定的調(diào)控位點從而形成特定的空間結(jié)構(gòu)。③lncRNA調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。作為信號分子，傳遞生物發(fā)育的調(diào)控信號，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。④作為誘餌分子招募其他分子共同發(fā)揮生物學(xué)功能[8]。

2 lncRNA與卒中

卒中是由急性腦循環(huán)障礙所致的局部性或全面性腦功能缺損綜合征，是一種突然起病的腦血液循環(huán)障礙性疾病，又叫腦血管意外，是指腦血管疾病的患者，因各種誘發(fā)因素引起腦內(nèi)動脈狹窄、閉塞或破裂，進(jìn)而造成急性腦血液循環(huán)障礙，臨床上表現(xiàn)為一次性或永久性腦功能障礙的癥狀和體征。

2.1 實驗性蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷后lncRNA的表達(dá)特征 蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是卒中的一種類型，全世界范圍內(nèi)，每10萬人中1～12人受到影響。越來越多的證據(jù)顯示，早期腦損傷是導(dǎo)致SAH患者死亡的主要原因之一[9]。ZHENG等[10]通過建立大鼠SAH模型，在其24 h后，用基因芯片檢測顳葉皮質(zhì)中l(wèi)ncRNA及mRNA的表達(dá)譜，結(jié)果顯示，相對于對照組，在SAH模型組患者大腦中，有221個上調(diào)和181個下調(diào)mRNA基因（倍數(shù)變化＞2；P＜0.05），以及64個上調(diào)、144個下調(diào)lncRNA。其中，MRAK038897是變化的lncRNA中最顯著的（21.8倍數(shù)變化；P＜0.01）。MRAK038897與錨蛋白重復(fù)序列和細(xì)胞因子信號箱3的抑制相關(guān)，參與早期腦損傷（early brain injury，EBI）在神經(jīng)元中的炎癥過程。因此，MRAK038897可能在EBI的調(diào)控中扮演一個重要的角色。為了驗證基因芯片的數(shù)據(jù)，兩個上調(diào)（BC092207、MRuc008hvl）和3個下調(diào)（XR_006756、MRAK038897和MRAK017168）的lncRNA被隨意選擇，通過定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）進(jìn)一步測定它們的表達(dá)水平。選定的lncRNA被證實其差異表達(dá)在SAH模型組與對照組比較中與基因芯片結(jié)果一致。BC092207和MRuc008hvl表達(dá)水平明顯上調(diào)，XR_006756、MRAK038897和MRAK017168顯著下調(diào)。以上結(jié)果表明，與對照組相比，SAH模型組患者lncRNA的表達(dá)水平有顯著差異，這表明lncRNA可能在蛛網(wǎng)膜下腔出血的病理生理過程扮演了重要角色。lncRNA以后可能成為蛛網(wǎng)膜下腔出血潛在的生物學(xué)指標(biāo)和預(yù)后指標(biāo)。

2.2 腦缺血后大腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中l(wèi)ncRNA的改變 越來越多的證據(jù)顯示，缺血引起的大腦內(nèi)皮損傷、內(nèi)皮炎癥和隨后內(nèi)皮功能的損害增加腦血管和血腦屏障的滲透，導(dǎo)致缺血性腦損傷[11-12]。在缺血性卒中條件下，對腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護，可以有效抑制或減少腦血管疾病，確立這種機制是很重要的。這種調(diào)節(jié)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)的介質(zhì)有可能為卒中的治療提供新的靶點。ZHANG等[13]用RNA測序技術(shù)評測鼠在建立體外缺血性卒中且細(xì)胞缺氧缺糖（oxygen-glucose deprivation，OGD）后原發(fā)性腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的lncRNA的表達(dá)特征。OGD 16 h后，10 677 lncRNA中有362個表達(dá)有顯著改變，包括147條上調(diào)和70條下調(diào)（倍數(shù)變化＞2）。其中，顯著上調(diào)的有Snhg12、Malat1和lnc-OGD 1006，顯著下調(diào)的有281008D09Rik、Peg13和lnc-OGD 3916。為了驗證RNA測序產(chǎn)生的表達(dá)譜，其又進(jìn)行熒光定量RT-PCR，來確定兩者數(shù)據(jù)之間的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果顯示，顯著上調(diào)或下調(diào)的腦內(nèi)皮lncRNA與RNA測序技術(shù)評測相一致。此結(jié)果暗示在缺血的刺激下，這些lncRNA在調(diào)節(jié)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞方面擔(dān)當(dāng)著功能性角色。

2.3 lncRNA FosDT（Fos downstream transcript）通過與相關(guān)染色質(zhì)修飾蛋白的抑制因子相互作用促進(jìn)缺血性腦損傷 缺血誘導(dǎo)腦內(nèi)轉(zhuǎn)錄組廣泛改變從而影響卒中后神經(jīng)功能的預(yù)后，除了蛋白編碼，許多ncRNA也在發(fā)生變化[4]?？墒菍τ谌毖筮@些變化的意義是未知的，為填補這一空白，SHIMAZU等[14]分析了一個在成年老鼠短暫性大腦中動脈閉塞后出現(xiàn)的Fos下游轉(zhuǎn)錄物，他們將其稱作FosDT。為何選擇FosDT，他們給出了以下理由：①在局部腦缺血后急性階段可以明顯發(fā)現(xiàn)FosDT高度表達(dá)；②它與Fos基因?qū)儆谕愊担以诖竽X損傷后Fos的快速誘導(dǎo)是細(xì)胞應(yīng)激的標(biāo)志物[15]；③它與卒中后誘導(dǎo)的沉默轉(zhuǎn)錄因子——染色質(zhì)修飾蛋白Sin3a和coREST相結(jié)合。沉默轉(zhuǎn)錄因子在胚胎發(fā)育期間對細(xì)胞凋亡和分化起到至關(guān)重要的作用，并且參與成年大腦神經(jīng)元的調(diào)節(jié)[16]。通過免疫印跡和RNA免疫蛋白結(jié)合沉淀技術(shù)等實驗得出相關(guān)分析結(jié)果。芯片顯示在短暫性大腦中動脈阻塞之后在再灌注3 h、6 h和12 h點FosDT表達(dá)明顯增加。再灌注12 h，RT-PCR結(jié)果顯示FosDT表達(dá)也顯著增加。用旋轉(zhuǎn)實驗、逃避試驗、移除黏附物能力測試測定老鼠從再灌注第1～7天內(nèi)的運動功能障礙情況，結(jié)果顯示，與小的干涉RNA對照組相比，敲除FOSDT基因的老鼠運動功能的恢復(fù)較前者有明顯改善。而且，敲除FOSDT基因的老鼠大腦的梗死面積也得到減少。這些結(jié)果顯示，lncRNA可能成為治療卒中新的治療靶點[17]。

2.4 對新生鼠缺氧缺血性腦損傷（hypoxicischemic brain damage，HIBD）后lncRNA的表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析 HIBD仍然是引起新生兒發(fā)病和死亡的重要原因。在產(chǎn)科和新生兒護理中，新生兒缺氧缺血性腦?。╤ypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）患者的生存率已有提高。但HIE依然對新生兒的健康和生活質(zhì)量存在威脅[18]。ZHAO等[19]運用基因芯片、實時熒光定量PCR、RNA測序和捕獲測序等技術(shù)檢測缺血缺氧模型組合對照組老鼠大腦內(nèi)的lncRNA。結(jié)果顯示，對照組與HIBD組的lncRNA有顯著的差異，在兩者之間一共找到322個表達(dá)有差異的lncRNA。其中BC088414是最明顯上調(diào)的lncRNA。另外，也有375個編碼基因存在差異。通路和基因本體論顯示上調(diào)的編碼基因主要涉及創(chuàng)傷、炎癥和防御，而下調(diào)的基因大部分與神經(jīng)再生和修復(fù)相關(guān)。而且，非編碼共同表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析顯示BC088414與細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Casp6和Adrb2有關(guān)。在PC12細(xì)胞中，BC088414的沉默引起Casp6和Adrb2基因mRNA水平的減少，減少細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞增生。這些結(jié)果提示lncRNA可能通過調(diào)節(jié)編碼基因參與HIBD的發(fā)病機制。

3 總結(jié)與展望

繼microRNA之后，ncRNA近年來逐漸成為研究的一大熱點?？墒侨藗儗Σ溉閯游锛?xì)胞內(nèi)非編碼RNA調(diào)控機制的了解還十分有限。但隨著人們對lncRNA的關(guān)注，越來越多的lncRNA進(jìn)入人們的視野，lncRNA的異常表達(dá)涉及更多的疾病，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有許多特異性表達(dá)的lncRNA參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)生理和病理過程，這為人類揭示大腦的復(fù)雜性提供了方向，但研究的難度也隨之增加。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，對異常的lncRNA有待進(jìn)一步探究，有必要對其表達(dá)分布、功能或其他水平上的分類進(jìn)一步探索。lncRNA可能參與各類疾病生理病理的過程，尤其在腫瘤和神經(jīng)疾病方面。未來必將有越來越多的lncRNA被發(fā)現(xiàn)與神經(jīng)疾病尤其是卒中的關(guān)聯(lián)。因此，深入研究lncRNA與卒中的相關(guān)機制，有助于進(jìn)一步闡明卒中的發(fā)生發(fā)展過程，為預(yù)防和治療卒中提供新的思路。

[1] ENCODE PROJECT CONSORTIUM. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome[J]. Nature，2012，489（7414）：57-74.

[2] CARNINCI P，KASUKAWA T，KATAYAMA S，et al. The transcriptional landscape of the mammalian genome[J]. Science，2005，309（5740）：1559-1563.

[3] ERNST C，MORTON C C. Identi fi cation and function of long non-coding RNA[J]. Front Cell Neurosci，2013，7：168.

[4] DHARAP A，NAKKA V P，VEMUGANTI R.Effect of focal ischemia on long noncoding RNAs[J].Stroke，2012，43（10）：2800-2802.

[5] CLARK M B，JOHNSTON R L，INOSTROZAPONTA M，et al. Genome-wide analysis of long noncoding RNA stability[J]. Genome Res，2012，22（5）：885-898.

[6] RINN J L，CHANG H Y. Genome regulation by long noncoding RNAs[J]. Annu Rev Biochem，2012，81（1）：145-166.

[7] WIERZBICKI A T. The role of long non-coding RNA in transcriptional gene silencing[J]. Curr Opin Plant Biol，2012，15（5）：517-522.

[8] WU R，SU Y，WU H，et al. Characters，functions and clinical perspectives of long non-coding RNAs[J]. Mol Genet Genomics，2016，291（3）：1013-1033.

[9] SEHBA F A，HOU J，PLUTA R M，et al. The importance of early brain injury after subarachnoid hemorrhage[J]. Prog Neurobiol，2012，97（1）：14-37.

[10] ZHENG B，LIU H，WANG R，et al. Expression signatures of long non-coding RNAs in early brain injury following experimental subarachnoid hemorrhage[J]. Mol Med Rep，2015，12（1）：967-973.

[11] ISHIKAWA M，ZHANG J H，NANDA A，et al.In fl ammatory responses to ischemia and reperfusion in the cerebral microcirculation[J]. Front Biosci，2004，9（5）：1339-1347.

[12] SANDOVAL K E，WITT K A. Blood-brain barrier tight junction permeability and ischemic stroke[J].Neurobiol Dis，2008，32（2）：200-219.

[13] ZHANG J，YUAN L，ZHANG X，et al. Altered long non-coding RNA transcriptomic profiles in brain microvascular endothelium after cerebral ischemia[J]. Exp Neurol，2016，277：162-170.

[14] SHIMAZU M，MIZUSHIMA H，SASAKI K，et al. Expression of c-fos in the rat cerebral cortex after focal ischemia and reperfusion[J]. Brain Res Bull，1994，33（6）：689-697.

[15] NOH K M，HWANG J Y，F(xiàn)OLLENZI A，et al.Repressor element-1 silencing transcription factor（REST）-dependent epigenetic remodeling is critical to ischemia-induced neuronal death[J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2012，109（16）：E962-E971.

[16] DHARAP A，POKRZYWA C，VEMUGANTI R.Increased binding of stroke-induced long non-coding RNAs to the transcriptional corepressors Sin3A and coREST[J]. ASN Neuro，2013，5（4）：283-289.

[17] MEHTA SL，KIM T，VEMUGANTI R. Long noncoding RNA FosDT promotes ischemic brain injury by interacting with REST-associated chromatin-modifying proteins[J]. J Neurosci，2015，35（50）：16 443-16 449.

[18] WACHTEL E V，HENDRICKS-MU?OZ K D.Current management of the infant who presents with neonatal encephalopathy[J]. Curr Probl Pediatr Adolesc Heath Care，2011，41（5）：132-153.

[19] ZHAO F，QU Y，LIU J，et al. Microarray profiling and co-expression network analysis of lncRNAs and mRNAs in neonatal rats following hypoxic-ischemic brain damage[J]. Sci Rep，2015，5（3）：13 850.