卒中動(dòng)物模型的研究進(jìn)展

尹春雨，朱東亞

卒中是影響全球人類健康的重大疾病之一，它具有較高的發(fā)病率、致殘率和死亡率。卒中的發(fā)病機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，按其機(jī)制的不同可以分為缺血性和出血性，針對卒中，目前尚缺乏有效的預(yù)防和治療手段。顯然，建立并完善與臨床相關(guān)性高的卒中動(dòng)物模型以及對其深入研究，是揭示卒中病理機(jī)制的有效途徑，這對卒中新藥研發(fā)有著十分重要的意義。本文將對傳統(tǒng)的和改良的缺血性和出血性卒中動(dòng)物模型的制備方法及其優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行歸納，并對未來卒中動(dòng)物模型的探究提出相應(yīng)的展望。

1 腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ?/h2>

1.1 常用的腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ?/h3>

1.1.1 線栓法 大腦中動(dòng)脈閉塞是人類缺血性卒中發(fā)生最常見的原因。線栓法局灶性腦缺血模型由于其病理機(jī)制與臨床上卒中患者的腦缺血情況類似，因此是目前國內(nèi)外常用的腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ汀?986年Koizumi等[1]首次提出運(yùn)用非開顱手術(shù)的方法阻塞大腦中動(dòng)脈形成腦缺血模型，而1989年Longa等[2]對此模型進(jìn)行了改良。其實(shí)驗(yàn)方法是先分離并結(jié)扎頸外動(dòng)脈，同時(shí)暫時(shí)性結(jié)扎頸總動(dòng)脈。將頸內(nèi)動(dòng)脈進(jìn)行分離，剪斷頸外動(dòng)脈，從頸外動(dòng)脈靠結(jié)扎線的遠(yuǎn)端做一切口，插入尼龍線使其經(jīng)過頸總動(dòng)脈分叉進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈至有輕微阻力為止，阻斷鄰近的大腦中動(dòng)脈的所有血供。其優(yōu)點(diǎn)在于該模型避免了開顱手術(shù)，可任意地控制再灌的時(shí)間以及是否永久性等，便于實(shí)驗(yàn)的探究。其缺點(diǎn)是：重現(xiàn)性差；要求操作人有專業(yè)的手術(shù)技能以確保精準(zhǔn)地插栓，減少因操作帶來的對其他部位的損傷[3]；會(huì)導(dǎo)致蛛網(wǎng)膜下腔出血，從而引起較高的死亡率[4]。

1.1.2 光栓法 1985年Watson等[5]引進(jìn)光栓法在大鼠腦皮質(zhì)上產(chǎn)生局灶性腦梗死。該方法的主要原理是用全身給藥的方式腹腔注入玫瑰紅染料然后對大鼠的頭顱局部位置進(jìn)行光照從而激活光化學(xué)反應(yīng)，光照激活玫瑰紅染料形成自由激進(jìn)分子形式，導(dǎo)致破壞內(nèi)皮細(xì)胞的功能以及在腦皮質(zhì)的血管中形成局部血栓。光栓法不是阻塞某一動(dòng)脈，而是引起大腦皮層中某一特定區(qū)域中的微血管阻塞[6]，其形成的腦梗死會(huì)產(chǎn)生長期的感覺運(yùn)動(dòng)障礙，因此該方法可用于探究慢性卒中的長期功能恢復(fù)[7]。優(yōu)點(diǎn)：該方法實(shí)驗(yàn)過程簡單，無創(chuàng)性；具有較高的重現(xiàn)性和較低的死亡率；可應(yīng)用在線粒體功能紊亂、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)退行性疾病等相關(guān)方面的研究。缺點(diǎn)：在損傷內(nèi)皮細(xì)胞的同時(shí)會(huì)破壞血腦屏障以及產(chǎn)生血管性水腫[8]，會(huì)產(chǎn)生較小的缺血半暗帶，與人類腦缺血的病理機(jī)制不太相符。

1.1.3 栓塞法 栓塞法腦缺血模型在1982年初次應(yīng)用在大鼠上，Kudo等[9]將較小的凝塊注入頸總動(dòng)脈或頸內(nèi)動(dòng)脈中，替代了線栓法。目前常用的方法是將含有栓塞劑（微球體、自體或異體血凝血塊）的導(dǎo)管植入大腦中動(dòng)脈中，利用激光多普勒血流計(jì)確定栓塞位置，打入栓子后撤回導(dǎo)管。該方法具有臨床相關(guān)性，適用于血栓溶解方面的研究，當(dāng)給予正確位置的栓子時(shí)會(huì)引起較大的損傷，包括皮層以及皮質(zhì)下的區(qū)域，同時(shí)可引起較為顯著的行為學(xué)缺陷。缺點(diǎn)：會(huì)出現(xiàn)腦出血的情況；具有較高的死亡率；引起多灶性缺血，甚至在對側(cè)區(qū)域也會(huì)有相應(yīng)的損傷[10]。

1.1.4 血栓栓塞法 血栓栓塞模型十分接近臨床卒中患者腦缺血的病理情況，該模型適用于臨床前對溶栓劑的評價(jià)。多數(shù)情況下，采用自體取血的方法形成血栓將其注入大腦中動(dòng)脈或頸內(nèi)動(dòng)脈中[11]。該方法的不足之處在于：重現(xiàn)性差，不能保證腦損傷區(qū)域的位置和大小[12]；制備血栓易受多因素的影響；不適用于缺血再灌注的研究。

1.2 改良型腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ?/h3>

1.2.1 微球注入法 微球模型是一種血管內(nèi)的栓塞型卒中模型，類似于心源性和動(dòng)脈-動(dòng)脈的栓塞[12]。將大鼠麻醉后，分離出右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，用5-0縫線結(jié)扎甲狀腺上動(dòng)脈、枕動(dòng)脈和翼腭動(dòng)脈，用3-0縫線結(jié)扎頸外動(dòng)脈末端同時(shí)暫時(shí)性結(jié)扎頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，在頸外動(dòng)脈上剪口，插入含有6個(gè)TiO2微球體（直徑：0.3～0.4 mm）的導(dǎo)管緩慢注入頸內(nèi)動(dòng)脈中，在血流的幫助下使微球體被沖到大腦中動(dòng)脈的位置，注入完成后用肝素鈉稍沖洗頸內(nèi)動(dòng)脈，撤回導(dǎo)管，進(jìn)行縫合。運(yùn)用該方法產(chǎn)生的局灶性腦梗死，包括皮質(zhì)和皮質(zhì)下區(qū)域，避免了對下丘腦產(chǎn)生損傷。通過該方法對腦血流量的時(shí)間與空間的動(dòng)力學(xué)、能量代謝、神經(jīng)炎癥、干細(xì)胞再生等方面進(jìn)行臨床前研究。遺憾的是，此方法不能用于缺血再灌注方面的研究[13]。

1.2.2 改良大鼠血栓法 Zhang等[14]在大鼠上對血栓栓塞模型進(jìn)行了改造。首先是自體血血栓的制備：取Wistar大鼠股動(dòng)脈的血流入PE-50管子中使其在37℃條件下孵育2 h，再轉(zhuǎn)入4℃條件下孵育22 h形成血栓，造模前用0.9%生理鹽水清洗血栓10～15次。其次將大鼠麻醉后，暴露一側(cè)頸總動(dòng)脈，分離頸內(nèi)動(dòng)脈與頸外動(dòng)脈（避免觸碰迷走神經(jīng)），結(jié)扎并剪斷頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端的一側(cè)，用動(dòng)脈夾暫時(shí)性夾閉頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，從頸外動(dòng)脈靠結(jié)扎線的遠(yuǎn)端做一切口，插入含有血栓的PE-50管子使其進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，插至有阻力的位置，打開動(dòng)脈夾，撤回管子1～2 mm，使用微量注射器以10 μl/min的速度緩慢注入血栓，注入完成后停留5 min，確保血栓到達(dá)頸外動(dòng)脈/頸內(nèi)動(dòng)脈的交叉點(diǎn)，再次用動(dòng)脈夾暫時(shí)性夾閉頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，撤回PE-50管子，結(jié)扎頸外動(dòng)脈上的切口，縫合傷口。改良后的大鼠血栓法形成腦缺血可模擬人類缺血性卒中的實(shí)際情況，該方法適用于研究溶栓和溶栓與神經(jīng)保護(hù)劑聯(lián)合用藥。但是其產(chǎn)生的梗死灶的位置和大小變異性大，容易發(fā)生再灌注的現(xiàn)象。

1.2.3 改良小鼠血栓法 Chen等[15]將小鼠氣體麻醉后，在顯微鏡下分離暴露小鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎并剪斷頸外動(dòng)脈，同時(shí)暫時(shí)性結(jié)扎頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，在頸外動(dòng)脈上剪口，將含有2 NIHU α-凝血酶的PE-8導(dǎo)管插入切口中將其緩慢注入頸外動(dòng)脈中，注入完成后從頸外動(dòng)脈中吸取3 μl血流入導(dǎo)管中，然后在空氣中暴露15 min形成血栓。其次暫時(shí)性結(jié)扎頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，將含有血栓的導(dǎo)管再次順著頸外動(dòng)脈的切口進(jìn)入到頸內(nèi)動(dòng)脈中，使導(dǎo)管的尖端位于距大腦中動(dòng)脈1～2 mm處，緩慢注入血栓10 min后，撤回導(dǎo)管，結(jié)扎頸外動(dòng)脈，釋放頸總動(dòng)脈。全過程在激光多普勒血流儀的監(jiān)測下進(jìn)行，可觀察到血栓的位置以及形成情況。該方法所需時(shí)間較短，僅在單次麻醉下，采用自體取血的方法，精確定位血栓的位置，產(chǎn)生重現(xiàn)性較好的局部腦梗死，具有較低的死亡率，同時(shí)避免了開顱手術(shù)和硬腦膜的滲透。為缺血性腦損傷的研究提供了新的思路與方法。

1.3 其他

1.3.1 猴腦缺血模型 Zhang等[16]將受試猴全身麻醉后，暴露顱骨，從左外側(cè)前額葉皮層處打開硬腦膜，在大腦中動(dòng)脈的左側(cè)M1部位，距嗅束2 mm處，用5 mm鈦合金動(dòng)脈夾短暫性夾閉4 h后，移去動(dòng)脈夾形成血流再灌。用激光多普勒血流計(jì)監(jiān)測前額葉皮層中的相對腦血流量（relative cerebral blood flow，rCBF）的變化。

1.3.2 狒狒腦缺血模型 Huang等[17]將狒狒通過左側(cè)經(jīng)眶顱骨切除術(shù)暫時(shí)性夾閉身體同側(cè)的頸內(nèi)動(dòng)脈、脈絡(luò)叢前動(dòng)脈以及雙側(cè)大腦前動(dòng)脈A1近端的前交通動(dòng)脈，夾閉1 h。這種方法不僅可以引起皮質(zhì)以及皮質(zhì)下灰質(zhì)的損傷，還可以引起皮質(zhì)下白質(zhì)的受損。同時(shí)，可減少側(cè)支循環(huán)的可變性，產(chǎn)生較為穩(wěn)定的梗死區(qū)域[18]。

1.3.3 犬腦缺血模型 為了更好地模擬臨床卒中患者發(fā)病情況，實(shí)現(xiàn)向臨床的轉(zhuǎn)化，Christoforidis等[19]在犬的椎動(dòng)脈中置入導(dǎo)引導(dǎo)管，將含有栓塞線圈的微導(dǎo)管插入到該導(dǎo)管內(nèi)，在熒光顯微鏡下使其經(jīng)脊分支動(dòng)脈、基底動(dòng)脈、后交通動(dòng)脈到達(dá)大腦中動(dòng)脈，將微導(dǎo)管內(nèi)的栓塞線圈注入大腦中動(dòng)脈中，通過血管造影儀觀察線圈的位置是否正確，阻塞60 min，結(jié)果導(dǎo)致部分閉塞大腦中動(dòng)脈M1段、頸內(nèi)動(dòng)脈的遠(yuǎn)端和大腦前動(dòng)脈的始端位置，60 min后取出線圈撤回導(dǎo)管。該模型可準(zhǔn)確定位栓塞位置，當(dāng)位置不準(zhǔn)確時(shí)，可進(jìn)行重新定位。

1.3.4 家兔腦缺血模型 目前，家兔微血栓栓塞性卒中模型用于急性腦梗死的相關(guān)研究，然而該模型存在許多限制性因素，English等[20]對其進(jìn)行改造。該模型是在熒光顯微鏡下，利用血管造影技術(shù)將1.5 F微導(dǎo)管通過左側(cè)椎動(dòng)脈至基底動(dòng)脈進(jìn)而插入到右側(cè)大腦后動(dòng)脈中，使微導(dǎo)管的尖端位于右側(cè)大腦后動(dòng)脈的始端，持續(xù)不同的時(shí)間形成不同程度的大血管阻塞。將微導(dǎo)管撤回后形成血流再灌。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于可以精確定位栓塞的位置，產(chǎn)生時(shí)間依賴型的皮質(zhì)及皮質(zhì)下區(qū)域的損傷，重復(fù)性較強(qiáng)，可以準(zhǔn)確控制阻塞和血管再生的時(shí)間，有利于進(jìn)行可逆和不可逆的急性腦缺血的研究。

1.3.5 自發(fā)性腦缺血模型 將易卒中型自發(fā)性高血壓大鼠用2.0%異氟烷麻醉后，在顯微鏡下，沿腹側(cè)中線切開，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈并進(jìn)行結(jié)扎。該方法可產(chǎn)生局灶性腦缺血，破壞血腦屏障以及點(diǎn)狀出血，可引起血管周圍炎癥和認(rèn)知功能障礙[21-22]。

2 腦出血?jiǎng)游锬Ｐ?/h2>

2.1 常用的腦出血?jiǎng)游锬Ｐ?/h3>

2.1.1 自體血注入法 該模型是將不同體積的自體血通過立體定位的方法注入動(dòng)物的紋狀體中形成腦血腫，會(huì)出現(xiàn)腦血腫以及周圍腦區(qū)的CBF減少的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象依賴于自體血的體積量，但不引起腦灌注壓力的改變。通過注入自體血產(chǎn)生的腦出血并不會(huì)破壞脈管系統(tǒng)[23]。有文獻(xiàn)報(bào)道，使用注入半凝結(jié)的自體全血的方法，6 min內(nèi)注入60 μl會(huì)導(dǎo)致組織學(xué)上明顯的變化以及神經(jīng)系統(tǒng)的障礙[24]。優(yōu)點(diǎn)：能夠模擬出血性卒中患者的出血情況。缺點(diǎn)：重復(fù)性差；由于心室破裂以及血液順著針孔的回流，因而無法預(yù)計(jì)血腫的程度和大小。就現(xiàn)階段研究來看，自體血注入法模型是較為理想的有效腦出血模型，與臨床上腦出血的情況十分類似，便于研究其病理生理變化及腦血流的改變情況，為腦出血的臨床治療提供有力的證據(jù)。

2.1.2 膠原酶注入法 膠原酶是蛋白水解酶，在細(xì)胞中以非活性形式存在。該模型的主要原理是利用膠原酶的酶促反應(yīng)破壞血管的基膜引起血液向周圍組織滲漏。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于重復(fù)性強(qiáng)，可形成較一致的出血體積。然而與自體血注入法不同的是注入膠原酶會(huì)破壞脈管系統(tǒng)，同時(shí)使腦血腫膨脹變大[25]，還會(huì)產(chǎn)生其他非出血性的反應(yīng)，破壞其他類型的血管，如毛細(xì)血管[23]，與臨床上腦出血情況有一定的差別。由于膠原酶自身可引起炎癥反應(yīng)，因此該方法不適用于研究腦出血后的炎癥反應(yīng)相關(guān)機(jī)制。

2.2 改良型腦出血?jiǎng)游锬Ｐ?/h3>

2.2.1 蛛網(wǎng)膜下腔出血?jiǎng)游锬Ｐ?蛛網(wǎng)膜下腔出血會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)功能嚴(yán)重紊亂，出現(xiàn)如偏癱、情感障礙、認(rèn)知和記憶功能受損。Li等[26]將C57BL/6J小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（80 mg/kg）進(jìn)行麻醉后，首先將激光多普勒血流儀置于小鼠左側(cè)顳骨處監(jiān)測左側(cè)半球的血流情況。其次分離小鼠左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，在頸外動(dòng)脈處剪開約3 mm小口，將6-0尼龍線從頸外動(dòng)脈切口處插入頸內(nèi)動(dòng)脈至有阻力為止，約距頸總動(dòng)脈分支點(diǎn)1.0 cm，稍刺破血管2 mm處。該方法是首次在小鼠上利用血管穿刺的方法形成蛛網(wǎng)膜下腔出血的動(dòng)物模型。

2.2.2 向小腦延髓池注射血液致蛛網(wǎng)膜下腔出血?jiǎng)游锬Ｐ?Guvenc Tuna等[27]將Wistar大鼠用2%異氟烷麻醉后，進(jìn)行針穿刺寰枕關(guān)節(jié)膜，將0.2 ml動(dòng)脈血注入小腦延髓池內(nèi)，為了防止血液回流，注入完成留針數(shù)分鐘后緩慢撤回。該模型的優(yōu)點(diǎn)在于可根據(jù)注射的血液量及注射的次數(shù)調(diào)節(jié)蛛網(wǎng)膜下腔出血的嚴(yán)重程度，但其缺點(diǎn)在于屬于非生理性血液分布。

2.2.3 自發(fā)性腦出血模型 該方法是將易卒中型自發(fā)性高血壓大鼠用戊巴比妥（45 mg/kg，腹腔注射）麻醉后，在右側(cè)股動(dòng)脈插入導(dǎo)管進(jìn)行取血100 μl，將大鼠腦固定在立體定位儀上，頭部正中切開，暴露前囟點(diǎn)，使前囟點(diǎn)與后囟點(diǎn)在同一水平上（坐標(biāo)：距前囟點(diǎn)前0.2 mm，旁開3.5 mm，深度5.5 mm），用腦立體定位鉆進(jìn)行鉆孔，將針植入右側(cè)基底神經(jīng)節(jié)，使100 μl自體血緩慢注入右側(cè)基底神經(jīng)節(jié)中（速度：10 μl/min），注射完畢留針10 min后緩慢退針，用骨蠟封閉針眼，縫合皮膚。該模型取自體動(dòng)脈血，導(dǎo)致的腦出血與臨床上高血壓腦出血患者的發(fā)病情況十分類似，然而在發(fā)生腦出血時(shí)，由于無法選擇出血區(qū)域，不易控制出血量，死亡率較高[28]。

3 總結(jié)與展望

本文對于各種缺血性和出血性卒中動(dòng)物模型的制作方法及其優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了分析闡述。各種模型具有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，可根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。卒中受多因素影響，其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，因此，選擇重現(xiàn)性高、臨床相關(guān)性高的動(dòng)物模型研究卒中的發(fā)病機(jī)制，對卒中新藥研發(fā)具有十分重要的臨床意義。

當(dāng)前，一味地針對動(dòng)物模型的重現(xiàn)性進(jìn)行的改良已經(jīng)不能滿足人們對于卒中病理機(jī)制探索的要求。如何對卒中動(dòng)物模型進(jìn)行改進(jìn)使其與臨床患者情況更加吻合，仍然是目前醫(yī)學(xué)科研者需要解決的難題。同時(shí)，如何將在動(dòng)物模型上的最適藥物劑量轉(zhuǎn)化到臨床患者上，以及腦組織損傷后嚙齒類動(dòng)物與人類的不同免疫系統(tǒng)反應(yīng)，也是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。因此明確模型動(dòng)物和人類的種屬差異，并選擇合適的行為學(xué)檢測方法對于研究受試藥物的藥理學(xué)效應(yīng)及其臨床轉(zhuǎn)化也是十分重要的。所以，探索出更接近人類卒中發(fā)病過程的動(dòng)物模型迫在眉睫，這可能會(huì)進(jìn)一步加深人們對于卒中病理機(jī)制的認(rèn)識(shí)，進(jìn)而開發(fā)出利于轉(zhuǎn)化的藥物，為卒中的治療開辟新的道路。

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