自噬在骨性關(guān)節(jié)炎中的研究進(jìn)展*

趙 旭 傅志儉

（山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院疼痛科，濟(jì)南250021）

·特約綜述·

自噬在骨性關(guān)節(jié)炎中的研究進(jìn)展*

趙 旭 傅志儉△

（山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院疼痛科，濟(jì)南250021）

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)以關(guān)節(jié)腫脹和疼痛為主要癥狀，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，尋找治療骨性關(guān)節(jié)炎有效藥物成為當(dāng)今研究熱點(diǎn)。目前臨床主要有：口服非甾體類抗炎藥物，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射玻璃酸鈉等，以緩解疼痛，改善關(guān)節(jié)活動(dòng)度的對癥治療，尚未發(fā)現(xiàn)有效治愈骨性關(guān)節(jié)炎的靶向藥物。骨性關(guān)節(jié)炎的病理表現(xiàn)以滑膜炎和軟骨退變?yōu)橹鳌Ｄ壳把芯堪l(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞自噬水平下降是軟骨退變原因之一，可能是治療骨性關(guān)節(jié)炎藥物靶點(diǎn)。該文就自噬定義、相關(guān)信號通路及影響因素，自噬在軟骨細(xì)胞中的作用及骨關(guān)節(jié)炎中自噬等予以綜述，為尋找有效治療骨性關(guān)節(jié)炎藥物提供新的思路。

骨性關(guān)節(jié)炎；軟骨退變；軟骨細(xì)胞；自噬

隨著全球人口老齡化加重，退行性疾病發(fā)病率呈上升趨勢，如骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)。OA以關(guān)節(jié)腫脹和長期慢性疼痛為主要表現(xiàn)，嚴(yán)重影響病人的日常生活。目前研究表明OA主要發(fā)病特點(diǎn)是關(guān)節(jié)軟骨退變和慢性炎癥。慢性炎癥主要有IL-1、IL-6和TNF-α促進(jìn)分解的炎癥因子共同參與[1]。關(guān)節(jié)軟骨退變是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制的中心環(huán)節(jié)， 主要病理表現(xiàn)是軟骨細(xì)胞的衰老凋亡[2]，細(xì)胞外基質(zhì)的降解和增生不良引起軟骨退化，軟骨下的骨硬化導(dǎo)致骨贅形成[3]。因此，維持關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的活性是預(yù)防OA關(guān)鍵因素之一。Cheng NT等[4]研究發(fā)現(xiàn)， 在OA動(dòng)物模型中，維持軟骨細(xì)胞的自噬水平可預(yù)防軟骨退變，是維持軟骨細(xì)胞生存的重要方式。

真核細(xì)胞通過溶酶體途徑對胞質(zhì)蛋白和細(xì)胞器進(jìn)行降解以維持生存的過程稱為細(xì)胞自噬(Autophagy)。1956年比利時(shí)科學(xué)家Christian de Duve在新生小鼠腎組織中觀察到細(xì)胞中存在大量膜性結(jié)構(gòu)致密體，其于1963年在首次提出這種現(xiàn)象為自噬。自噬可清除細(xì)胞受損的細(xì)胞器和長效大分子，是維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)不可或缺的機(jī)制。已有研究發(fā)現(xiàn)OA的發(fā)生與軟骨細(xì)胞自噬水平下降相關(guān)[5]。因此，提高軟骨細(xì)胞自噬水平可能是OA治療靶點(diǎn)。本文就自噬在骨性關(guān)節(jié)炎中作用機(jī)制予以綜述。

1. 自噬相關(guān)信號通路

自噬是細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器和分子更新的過程，當(dāng)應(yīng)激時(shí)，如能量缺乏、ROS、低氧環(huán)境，保護(hù)細(xì)胞，避免細(xì)胞凋亡，是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和生存的重要方式。自噬過程是由ATG基因(autophagy associated gene,ATG)介導(dǎo)的自噬性結(jié)構(gòu)形成過程，細(xì)胞自噬發(fā)生起始時(shí)，胞內(nèi)形成一種稱為自噬泡(phagopore)的囊泡樣結(jié)構(gòu)，與需降解的胞質(zhì)成分集結(jié)一起。然后自噬泡隔離膜延伸、包裹、封閉胞漿成分，最終形成一個(gè)雙層膜的結(jié)構(gòu)，即自噬體 (autophosome)，自噬體與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體(autopholysome)，將包裹的胞質(zhì)成分在溶酶體內(nèi)酶的作用逐步降解，用于細(xì)胞重新利用。

ATG基因首次發(fā)現(xiàn)于酵母菌中，與之相對應(yīng)的真核細(xì)胞基因也隨之確定。目前共發(fā)現(xiàn)ATG基因三十余種，其中ATG1、ATG6、ATG8分別對應(yīng)哺乳動(dòng)物的ULK-1、Beclin-1和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)，是自噬的關(guān)鍵基因。ULK-1是自噬泡形成所必需的，ULK-1激酶的失活會(huì)抑制LC3Ⅱ形成，抑制自噬發(fā)生。其接受自噬中心關(guān)鍵調(diào)控因子哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）的調(diào)節(jié)。能量缺乏時(shí)，mTOR受到抑制，mTOR對ULK-1的抑制作用減弱，使得ULK-1活性增強(qiáng)，啟動(dòng)自噬[6]。LC3廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物組織和培養(yǎng)的細(xì)胞的可溶性蛋白中，稱為胞漿型LC3Ⅰ。當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)，胞漿形式的LC3Ⅰ通過泛素樣酶促反應(yīng)與磷脂酰乙胺醇結(jié)合，轉(zhuǎn)化為磷脂共軛化合物形式的LC3Ⅱ[7]，不斷被募集到自噬泡上，對自噬泡的延伸發(fā)揮關(guān)鍵作用[8]。自噬泡不斷延伸并包裹降解底物，最后形成閉合的自噬小體，它是自噬小體的標(biāo)志分子，發(fā)揮監(jiān)控自噬作用[9]。通常將LC3Ⅱ和LC3Ⅰ的比值來評估細(xì)胞自噬水平。Beclin-1基因又叫BECN1基因，是酵母菌ATG6同源體，Beclin-1表達(dá)與自噬水平呈正相關(guān)，是自噬的正向調(diào)節(jié)因子。饑餓等條件下可激活JNK通路，激活Bcl-2磷酸化，從而Beclin-1釋放增加，進(jìn)而激活自噬[10]。P62蛋白參與自噬小體的降解，也是自噬過程中選擇性自噬底物，因此在自噬下降時(shí)，P62蛋白胞內(nèi)大量堆積。

啟動(dòng)自噬的中心關(guān)鍵分子mTOR可接受上游多個(gè)信號通路變化，調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬水平。mTOR存在mTORC1和mTORC2兩種形式[11]，其中mTORC2對自噬誘導(dǎo)藥物雷帕霉素耐受。mTOR的激活可抑制自噬，使磷酸化的ATG13不能與ATG1（ULK1）結(jié)合形成自噬小體，促進(jìn)核糖體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)黏附，從而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫落形成自噬體膜[12]。研究發(fā)現(xiàn)mTOR的上調(diào)與 OA軟骨細(xì)胞凋亡、ATG5、Beclin-1和LC3Ⅱ下調(diào)相關(guān)。而特異性基因敲除mTOR的小鼠，與正常小鼠相比軟骨的自噬水平升高，同時(shí)軟骨細(xì)胞凋亡數(shù)量減少[13]。

對于mTOR的調(diào)控受多種因素的影響，其中Ⅰ型和Ⅲ型磷脂酰肌醇3 激酶(phosphatidylinositol 3 kinase, PI3K)均參與自噬調(diào)節(jié)。生長因子可通過胞外細(xì)胞因子受體酪氨酸激酶激活Ⅰ型PI3K，進(jìn)而激活下游蛋白激酶B (Protein Kinase B, Akt)磷酸化，正向調(diào)控mTOR[14]，抑制自噬。但是當(dāng)營養(yǎng)和能量缺乏應(yīng)激情況下， PI3K活化的下游的Akt減少，誘導(dǎo)自噬發(fā)生[15]。Ⅲ型PI3K可直接與Beclin-1形成復(fù)合物，促進(jìn)自噬。此外，AMP/ATP比值升高激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)，磷酸化AMPK可直接對mTOR產(chǎn)生負(fù)性調(diào)控，激活自噬[16]。

最近研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt/mTOR和AMPK/mTOR通路對自噬的調(diào)節(jié)與活性氧(reactive oxygen species,ROS) 有關(guān)。Li P等[17]在研究肺炎鏈球菌感染A549細(xì)胞，促進(jìn)自噬是通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路，并伴隨細(xì)胞內(nèi)ROS增加，加入ROS清除劑后，自噬水平下降?？梢娂?xì)胞內(nèi)ROS水平也是調(diào)節(jié)自噬關(guān)鍵因素之一。

2. 自噬與骨性關(guān)節(jié)炎

自噬具有抑制炎癥激活作用。Saitoh T等[18]在研究自噬與克羅恩病時(shí)發(fā)現(xiàn)，ATG16L敲除的克羅恩病小鼠與克羅恩病小鼠相比，外周血IL-1和IL-18明顯增加。在無菌環(huán)境下，自噬可清除異常的細(xì)胞器、蛋白聚集體和胞漿碎片，發(fā)揮內(nèi)源性炎癥激活功能，但研究表明正常生理?xiàng)l件下的自噬可以控制炎癥的激活，一但自噬被阻斷，胞內(nèi)線粒體去極化積累，導(dǎo)致內(nèi)源性炎癥激活劑釋放，激活炎癥發(fā)生。

相反，炎癥也可抑制自噬水平。在OA早期和晚期均有炎癥存在，軟骨、滑膜和軟骨下骨促炎因子表達(dá)增加，推進(jìn)OA關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)改變和軟骨退化[19]。研究發(fā)現(xiàn)OA病人外周血單核細(xì)胞mTOR表達(dá)增加與OA炎癥活動(dòng)期相關(guān)，IL-1干預(yù)OA軟骨細(xì)胞mTOR表達(dá)增加[13]，提示促炎因子抑制自噬。阮麗萍等[9]在觀察骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型時(shí)，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬水平降低，Beclin-1和LC3Ⅱ表達(dá)下降，但外周血IL-4、IL-10和TNFα顯著升高，其兩者有相關(guān)性。

綜上所述，正常生理?xiàng)l件下的軟骨細(xì)胞自噬活動(dòng)具有一定抗炎作用，某些促炎因子很可能是軟骨細(xì)胞自噬水平降低原因之一。

3. 骨性關(guān)節(jié)炎中軟骨細(xì)胞的自噬

關(guān)節(jié)軟骨與其他組織器官不同，不存在血管、神經(jīng)、淋巴組織，其通過來自于滑膜液和軟骨下骨擴(kuò)散至軟骨層的氧氣和營養(yǎng)[20]，來合成和更新豐富的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)[21]。因此維持軟骨細(xì)胞健康狀態(tài)是關(guān)節(jié)軟骨完整性重要因素。

（1）骨性關(guān)節(jié)炎早期軟骨細(xì)胞的自噬

在正常成年關(guān)節(jié)軟骨中，自噬維持軟骨細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，關(guān)節(jié)軟骨淺表層的軟骨細(xì)胞高表達(dá)beclin-1、ATG5和 LC3Ⅱ[22]。此外，代謝和饑餓應(yīng)激初始階段，軟骨細(xì)胞的自噬也會(huì)增加。因此在關(guān)節(jié)軟骨退變的初始階段，OA的軟骨細(xì)胞LC3Ⅱ、Beclin-1 mRNA表達(dá)增加[23]。在大鼠顳下頜關(guān)節(jié)炎模型中，透射電鏡觀察早期退變的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，自噬小體增加；伴隨mTOR的活性下降[24]，LC3Ⅱ和Beclin-1 的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)均增加。細(xì)胞自噬一過性增加是細(xì)胞對應(yīng)激的代償性反應(yīng)，利于細(xì)胞生存，持續(xù)自噬升高，細(xì)胞會(huì)受到損害而凋亡[25]。Carames B等[26]研究發(fā)現(xiàn)在OA病變較輕時(shí)，關(guān)節(jié)軟骨中部和深層的自噬相關(guān)mRNA和蛋白ULK1、Beclin-1和LC3Ⅱ表達(dá)較高，關(guān)節(jié)軟骨表層其表達(dá)反而下降[27]，考慮表層軟骨細(xì)胞受損較深部時(shí)間長，增加自噬已失代償?？傊趹?yīng)激條件下骨骺生長板中軟骨細(xì)胞通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因提高自噬，從而實(shí)現(xiàn)降低細(xì)胞代謝，提高能量利用率，使其在惡劣的局部微環(huán)境中生存。

（2）骨性關(guān)節(jié)炎中晚期軟骨細(xì)胞的自噬

進(jìn)入中晚期的OA，軟骨細(xì)胞自噬下降，細(xì)胞凋亡增加，軟骨退變嚴(yán)重，伴隨ECM合成減少。小鼠膝關(guān)節(jié)炎模型中，ULK1和Beclin-1表達(dá)下降與糖胺多糖的丟失相一致，而凋亡相關(guān)蛋白PARP p85伴隨軟骨退化而表達(dá)增加[27]，提示自噬水平的降低不能維持細(xì)胞生存，進(jìn)而細(xì)胞凋亡增加。研究觀察人OA以及小鼠和狗OA模型的軟骨細(xì)胞，mTOR較正常軟骨細(xì)胞均過表達(dá)，mTOR的過表達(dá)與軟骨細(xì)胞凋亡增加、自噬調(diào)節(jié)因子ATG3、ATG5、ATG12、ULK1、LC3Ⅱ和Beclin-1的降低密切相關(guān)[13]。

（3）年齡相關(guān)的軟骨細(xì)胞自噬

OA的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)有許多因素，包括關(guān)節(jié)損傷、肥胖、遺傳學(xué)、性別和解剖學(xué)因素等，最突出的風(fēng)險(xiǎn)是年齡[28]。2014年的西班牙調(diào)查報(bào)道，超過300萬人診斷為OA，而年齡分布多在60～64歲[29]。軟骨細(xì)胞自噬水平也與年齡相關(guān)。Carames B等[27]還觀察了GFP-LC3轉(zhuǎn)基因的C57BL/6J小鼠，將綠色熒光蛋白GFP融合在LC3上，觀察到老年小鼠與年輕小鼠相比，關(guān)節(jié)軟骨自噬小體數(shù)量和自噬區(qū)域顯著減少，提示自噬的基礎(chǔ)水平也與年齡相關(guān)，隨著年齡增加自噬水平降低，從而原發(fā)性O(shè)A多發(fā)于中老年，軟骨細(xì)胞自噬水平下降是重要因素之一[30]。

4. 展望

隨著對骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞自噬下降研究逐漸明了，探索治療OA精確有效的方法成為重任。目前非甾體類抗炎藥、氨基葡萄糖是OA常用口服藥物，關(guān)節(jié)腔內(nèi)臭氧注射治療在臨床已廣泛開展，臨床研究表明30～40 μg/ml醫(yī)用臭氧注射可顯著緩解骨關(guān)節(jié)炎的疼痛[31]，在動(dòng)物骨關(guān)節(jié)炎模型中，40 μg/ml醫(yī)用臭氧關(guān)節(jié)腔注射促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)膠原網(wǎng)修復(fù)[32]，而醫(yī)用臭氧是否對軟骨細(xì)胞自噬產(chǎn)生影響，仍不清楚。最近提出的雷帕霉素，是一種mTOR抑制劑，直接作用于軟骨細(xì)胞的mTOR，提高細(xì)胞自噬，是潛在治療骨關(guān)節(jié)炎的靶向藥物，也為我們探索治療OA提供新的方向。

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10.3969/j.issn.1006-9852.2017.04.001

國家自然科學(xué)基金（81271346）

△通訊作者 zhijian_fu@163.com