腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)活性對動物宰后糖酵解的影響

張銘灝，朱立賢，張一敏，沈瑾，張明月，羅欣，梁榮蓉

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品與工程學(xué)院，山東 泰安,271018)

腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)活性對動物宰后糖酵解的影響

張銘灝，朱立賢，張一敏，沈瑾，張明月，羅欣*，梁榮蓉*

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品與工程學(xué)院，山東 泰安,271018)

動物宰后其骨骼肌的能量代謝是影響宰后肉品品質(zhì)的重要因素之一。在動物宰后的糖酵解中，腺苷酸蛋白活化激酶(AMP-activated proteinkinase，AMPK)可以通過對糖酵解關(guān)鍵限速酶活性的控制進(jìn)而對宰后的糖酵解和肉的品質(zhì)產(chǎn)生影響。文中綜述了AMPK結(jié)構(gòu)、其活性變化及活性調(diào)控對宰后糖酵解進(jìn)程的影響，并對通過AMPK活性的人工調(diào)控來改善肉質(zhì)提出了展望。

腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)；宰后糖酵解；活性調(diào)控

動物宰后，肌肉能量代謝過程中伴隨著pH值、胴體溫度變化和蛋白質(zhì)變性等生化反應(yīng)[1]，這對最終的肌肉品質(zhì)具有重要影響。因此，宰后肌肉的代謝活動與肉品質(zhì)的關(guān)系研究已成為肉品科學(xué)中的一個熱點(diǎn)。宰后肌肉以糖酵解為能量代謝方式，在無氧條件下葡萄糖被分解生成丙酮酸，丙酮酸又進(jìn)一步被還原為乳酸[1-2]。乳酸的積累導(dǎo)致了肌肉pH值的下降。而pH值的降低程度和降低速率則是影響宰后肌肉品質(zhì)的重要因素。不正常的pH值降低速率和極限pH值將導(dǎo)致異質(zhì)肉(PSE肉和DFD肉)的產(chǎn)生[3-4]。

在糖酵解過程中，相關(guān)限速酶活性是影響糖酵解進(jìn)程的關(guān)鍵因素[2]。在這些糖酵解限速酶中，糖原磷酸化酶(glycogen phosphorylase)和磷酸果糖激酶(phosphofructokinase)活性可以被腺苷酸蛋白活化激酶(AMP-activated proteinkinase，AMPK)調(diào)控[5-7]，進(jìn)而影響糖酵解進(jìn)程和肉的品質(zhì)。大量的研究已經(jīng)證明AMPK在宰后能量代謝中起到關(guān)鍵作用，Shen等指出AMPK在宰后1 h是影響糖酵解的關(guān)鍵因素，而其活性變化又進(jìn)一步對肉色及保水性造成影響[12,15,20]，李澤等在對羊肉品質(zhì)的研究中同樣指出AMPK通過對糖酵解理化指標(biāo)的影響進(jìn)而改變了肉品品質(zhì)，同時不同年齡和部位中AMPK的活性也不相同[14,50]。

因此，宰后AMPK的活性變化對肉的食用品質(zhì)具有重要影響。本文從AMPK的結(jié)構(gòu)，其活性變化及AMPK的活性調(diào)控對宰后糖酵解的影響，對未來發(fā)展提出了展望。

1 AMPK簡介

1.1 AMPK及其結(jié)構(gòu)

腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated proteinkinase，AMPKEC2.7.11.1)是一種能被一磷酸腺苷(AMP)激活的蛋白激酶，是蛋白激酶級聯(lián)的下游組件。它廣泛存在于真核細(xì)胞生物中。AMPK 能感知機(jī)體細(xì)胞能量代謝狀態(tài)的改變，并通過影響物質(zhì)代謝的多個環(huán)節(jié)來維持細(xì)胞能量的供求平衡[7]。

AMPK為異三聚體酶，由α、β和γ三種亞基組成。α亞基是催化亞基，γ調(diào)節(jié)亞基，β亞基為α和β亞基提供停泊地點(diǎn)。它表達(dá)于各種代謝相關(guān)的器官中，能被機(jī)體各種刺激激活，包括細(xì)胞壓力脅迫、運(yùn)動和很多激素及能影響細(xì)胞代謝的物質(zhì)[8]。AMPK可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的能量水平，當(dāng)腺嘌呤核苷三磷酸(Adenosine triphosphate, ATP)被消耗更精確的說是AMP/ATP增加時，其活性可以被激活。AMPK活性被激活后，可以磷酸化下游底物，試圖維持和貯存細(xì)胞內(nèi)的能量水平，一方面可以通過抑制糖原、脂肪和膽固醇的合成等減少ATP的利用，導(dǎo)致ATP的消耗途徑關(guān)閉，另一方面可以促進(jìn)生成途徑打開例如糖酵解、脂肪酸氧化、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等促進(jìn)ATP的生成，從而維持細(xì)胞能量平衡[8-11]。

1.2 動物宰后AMPK的活性變化及宰前應(yīng)激對其活性的影響

AMPK活性在動物宰后一定時間內(nèi)能達(dá)到最高，呈先升高后下降的趨勢。這是因為屠宰后動物機(jī)體供氧中斷，肌肉的糖代謝由有氧氧化轉(zhuǎn)變?yōu)闊o氧酵解，生成的ATP大量減少。這種能量狀態(tài)的改變會激活A(yù)MPK。當(dāng)pH值低于最適pH值后，酶蛋白變性失活，活性下降。SHEN等人發(fā)現(xiàn)宰后豬肉的 AMPK活性在0.5 ～ 1.0 h時達(dá)到最高，之后開始下降[12]，該學(xué)者隨后又發(fā)現(xiàn)小鼠一般在宰后大約20 min達(dá)到最大活性[13]。李澤發(fā)現(xiàn)蒙古雜交羊在宰后1 h左右其AMPK達(dá)到最大活性[14]。

禽畜宰前產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)可以使AMPK活性較早的到達(dá)到最大活性。SHEN等研究發(fā)現(xiàn)小鼠進(jìn)行游泳模擬應(yīng)激反應(yīng)后，其背最長肌AMPK活性在宰后1 h時顯著高于對照組(P<0.05)[15]。XING等人發(fā)現(xiàn)經(jīng)過運(yùn)輸應(yīng)激處理后的肉雞，宰后雞胸肉中的(AMP+IMP)/ATP的比值高于對照組(P<0.05)，同時運(yùn)輸組中的AMPK活性在0.5 h達(dá)到最大值，且高于對照組(P< 0.05)[16]。

2 AMPK活性變化對宰后糖代謝的影響

動物宰后的無氧酵解是可精確調(diào)節(jié)的，其中限速酶己糖激酶(hexokinase,HK)、6-磷酸果糖激酶1(6-phosphofructokinase1, PFK1)和丙酮酸激酶(pyruvate kinase, PK)催化的反應(yīng)是其中3個不可逆反應(yīng)，它們也是糖酵解的3個調(diào)節(jié)位點(diǎn)，而磷酸果糖激酶是糖酵解的主要調(diào)節(jié)點(diǎn)[1]。

動物宰后血液循環(huán)和氧氣供應(yīng)中斷，肌肉中糖原有氧氧化進(jìn)程終止；所需能量只能依靠糖原的無氧酵解來完成。而葡萄糖的無氧酵解過程只能凈產(chǎn)生2分子ATP，同時，生成的NADH+H+在線粒體內(nèi)最終氧化生成6分子ATP，因此，該過程可潛在產(chǎn)生8分子ATP，相較于有氧代謝中產(chǎn)生的38分子ATP，無氧酵解產(chǎn)生的ATP大大減少。這種能量狀態(tài)的改變可能會激活A(yù)MPK。AMPK活化后可通過提高磷酸化糖酵解的關(guān)鍵酶的活性，如HK、糖原磷酸化酶(glycogenphosphorylase, GP)、6-磷酸果糖激酶2(6-phosphofructokinase2, PFK2)和PK等，進(jìn)而促進(jìn)糖酵解。SHEN等人研究發(fā)現(xiàn)，氟烷基因陽性豬宰后早期ATP迅速消耗，使AMPK較早活化，從而加速了糖酵解，使乳酸積累，導(dǎo)致了PSE肉的產(chǎn)生[12]。多位學(xué)者也發(fā)現(xiàn)宰后AMPK活性與肉品品質(zhì)有顯著相關(guān)性[14,17]。已有研究發(fā)現(xiàn)不同條件下肉質(zhì)發(fā)生改變的機(jī)制可能是AMPK通過調(diào)節(jié)糖酵解的關(guān)鍵酶 HK、PK和重要酶LDH的活性，改變了糖酵解的程度和速度，最終影響了肌肉的成熟過程和肉的品質(zhì)[14,18]。

AMPK可以通過兩種途徑調(diào)節(jié)機(jī)體的糖代謝速率。一種是AMPK可以通過磷酸化6-磷酸果糖激酶2來調(diào)控糖代謝；另一種是AMPK可以通過活化糖原磷酸化酶并抑制糖原合成酶活性，控制肌肉內(nèi)糖原水平(圖1)。

2.1 AMPK調(diào)控磷酸果糖激酶2活性

AMPK可以通過磷酸化6-磷酸果糖激酶2的羧基末端調(diào)節(jié)域Ser-466到Ser-483中的Ser-466來激活磷酸果糖激酶活性，從而提高細(xì)胞中2,6-二磷酸果糖的產(chǎn)生(圖1)，而2,6-二磷酸果糖可以作為糖酵解的限速酶磷酸果糖激酶的變構(gòu)激活劑[19]。研究發(fā)現(xiàn)，在PSE豬肉中，放血結(jié)束0.5 h后，其2, 6-二磷酸果糖含量要顯著高于正常豬肉(P< 0.05)，而糖原磷酸化酶及丙酮酸激酶活性在宰后4h內(nèi)卻沒有顯著差異(P> 0.05)，2, 6-二磷酸果糖為PFK2的催化產(chǎn)物及PFK1的變構(gòu)激活劑，因此較高的PFK2和PFK1活性對宰后糖酵解及PSE肉的形成起著主要作用[20]。

圖1 AMPK調(diào)節(jié)宰后糖酵解通路圖Fig.1 The pathway of glycolysis under AMPK regulation

2.2 AMPK活性變化影響糖原代謝

糖原是最易取得的供能物質(zhì)，糖原水平受到糖原合成和糖原分解的影響，而這兩點(diǎn)又分別受到糖原合成酶(glycogen synthase，GS)和糖原磷酸化酶的影響。目前，已有大量學(xué)者對AMPK在糖原合成中扮演的角色表現(xiàn)出了極大興趣。最早CARLING和HARDIE于1989年指出AMPK可以磷酸化糖原合成酶的抑制位點(diǎn)Ser-7從而抑制其活性[21]。之后YOUNG發(fā)現(xiàn)，通過5-氨基咪唑 - 4-甲酰胺核糖核苷酸(AICAR)將小鼠肌肉細(xì)胞內(nèi)的AMPK活性激活，糖原磷酸化酶的活性升高[22]。因此，我們可以推斷AMPK可以通過活化糖原磷酸化酶并抑制糖原合成酶活性從而降低肌肉內(nèi)糖原水平。

然而在生物體內(nèi)的慢性激活實驗卻指出，通過AICAR將AMPK激活后后，肌肉的糖原含量及糖原合成酶活性反而增加[23-24]。隨后ASCHENBACH研究指出，AICAR之所以增加了糖原含量及糖原合成酶活性是由于葡萄糖攝取的增加造成的[23]。相同的研究結(jié)果也出現(xiàn)于對漢夏普豬及小鼠的AMPK γ3亞型的研究中[25-27]，而對AMPK α2缺陷型小鼠的研究中則得出了相反的結(jié)論[28]。因此，雖然在基礎(chǔ)狀態(tài)AMPK可以通過磷酸化糖原磷酸化酶的Ser-7位點(diǎn)抑制其活性，而在刺激狀態(tài)下(例如AICAR造成的葡萄糖吸收增加)由于6-磷酸葡萄糖濃度的升高使AMPK對Ser-7的磷酸化抑制效果難以體現(xiàn)出來。

但對于宰后初期糖酵解及pH值下降速率的差異，SHENG還認(rèn)為AMPK在宰后初期并不是誘導(dǎo)初始糖酵解速率的全部因素，應(yīng)激誘導(dǎo)的快速糖酵解還存在其他機(jī)制[29]。DU等人通過小鼠模擬應(yīng)激的實驗也證明了β腎上腺素確實對宰后初期的糖酵解產(chǎn)生了影響[30]。

3 AMPK活性的調(diào)控

AMPK可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的能量水平，當(dāng)ATP被消耗，更精確的說是AMP/ATP增加時，可以激活其活性[25-26]。哺乳動物在較低的糖原含量、缺氧、局部缺血和熱休克時都會造成AMP/ATP的比值上升[27]。而也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)AMP/ATP在PSE肉實驗組和正常對照組中沒有顯著差異(P>0.05)，而AMPK活性卻存在顯著差異[14]。這可能是AMP部分又轉(zhuǎn)化為IMP的緣故。所以，許多學(xué)者認(rèn)為AMP和IMP的總量才能真正反應(yīng)宰后AMP的形成量[14]。實驗發(fā)現(xiàn)(AMP+IMP)/ATP在實驗組和對照組中存在顯著差異(P<0.05)，因此，(AMP+IMP)/ATP比例更適合作為AMPK激活的預(yù)測因素[16]。AMPK一旦被激活，可以磷酸化下游底物，導(dǎo)致ATP的消耗途徑關(guān)閉，生成途徑打開(例如糖酵解)，從而試圖恢復(fù)細(xì)胞能量平衡。

3.1 AMPK的上游激酶調(diào)控

AMPK的上游激酶包括LKB1(Liver kinase B1)、轉(zhuǎn)化生長因子激酶1(transforming growth factor activated kinase-1, Tak1)和鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶激酶(calmodulin dependent protein kinase kinase , CaMKK)，他們從不同的途徑激活A(yù)MPK活性(圖1)。

LKB1可以通過磷酸化AMPK α亞基活化環(huán)上的172位蘇氨酸來激活A(yù)MPK．Hawley等人發(fā)現(xiàn)不表達(dá)LKB1的Hela細(xì)胞中，AICAR以及二甲雙胍類藥物均不能激活A(yù)MPK，但在瞬時轉(zhuǎn)染LKBl以后可恢復(fù)激活A(yù)MPK。在轉(zhuǎn)染LKBl小鼠的胚胎成纖維細(xì)胞中，AICAR以及二甲雙胍類藥物均能激活A(yù)MPK，但在LKBl_缺陷型中均不能做到[31]。因此LKBl是激活A(yù)MPK的必要因素。目前對小鼠的研究指出LKB1是以與STRAD(Ste20-related adaptor protein)，MO25(Mouse protein 25)以異源三聚體的形式發(fā)揮作用。HAWLEY指出激活HEK293細(xì)胞AMPK通路中LKB1-STRAD-MO25復(fù)合體是必需的。ST RAD擁有α，β兩個亞基，在一般狀態(tài)下沒有活性，與LKB1結(jié)合后可以促進(jìn)磷酸化AMPK，同時也有利于將LKB1錨定在細(xì)胞漿內(nèi)[32]。MILBURN等指出MO25與STRADα的C-羧基端結(jié)合，其中MO25可能作為直接蛋白結(jié)合復(fù)合物底物或者其他調(diào)節(jié)成分[33]。

CaMKK通過改變細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度使其升高從而激活A(yù)MPK，其作為AMPK的上游激酶最早由HAWLEY提出CaMKK可以磷酸化激活A(yù)MPK[34]。動物宰后早期AMPK可能受到CaMKK的調(diào)控，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高從而對宰后糖酵解產(chǎn)生影響[35-36]。本研究室前期的研究發(fā)現(xiàn)42日齡的的白羽雞宰經(jīng)過36 ℃的宰前急性熱應(yīng)激處理后，雞胸肉中Ca2+濃度顯著提高(P<0.05)，糖酵解進(jìn)程顯著加快，導(dǎo)致類PSE肉發(fā)生率升高[37]?，F(xiàn)有的研究指出在LKB1缺陷細(xì)胞中AMPK可以受到Ca2+通道載體影響而被激活。HURLEY對Hela細(xì)胞及LKB1缺陷小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的研究指出通過甘露醇及離子通道載體處理后可以觀察到AMPK Thr172的磷酸化，同時這種反應(yīng)受到CaMKK的特定抑制因子STO-609的抑制[38],在這些細(xì)胞中AMPK信號受到CaMKKα和β亞基的抑制。HAWLEY通過向Hela細(xì)胞中添加離子載體(A23187)后觀察到AMPK被激活但ATP/ADP比例沒有改變，同時該現(xiàn)象被2.5 μmol/L STO-609遮蔽[36]。對大腦切片的觀察表明CaMKK是AMPK活化的主要通路之一[36]。

Tak1是最近被證明的AMPK上游激酶，Tak1缺陷小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中寡霉素，二甲雙胍和AICAR的激活效果減弱[39]。對于酵母菌的研究表明Tak1可以直接磷酸化AMPK[40]。MARTIN的研究證明TAK1-AMPK通路在腫瘤壞死方面起到相關(guān)作用，但具體作用還有待進(jìn)一步研究[41]。

近期的研究發(fā)現(xiàn)蛋白激酶β(Akt/PKB)同樣可以通過影響AMPK活性，并通過AMPK-TSC-mTOR途徑激活mTOR[42]。LIN等人研究發(fā)現(xiàn)，去乙?；o酶1(Sirtuin type 1, SIRTl)也是AMPK上游的一個調(diào)節(jié)因子，且并不依賴于LKBl和CaMKK的活化[43]。

3.2 AMPK活性的人工誘導(dǎo)

AMPK也可以通過人工誘導(dǎo)活性使其被AICAR和二甲雙胍(metformin)激活，或被Dorsomorphin (compound C)，阿糖腺苷(adenine 9-β-D-arabinfuranoside, araA)抑制。AICAR可以在被細(xì)胞吸收后通過腺苷激酶磷酸化生成ZMP(5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-D-ribofuranosyl-5-monophosphate)，ZMP作為AMP的類似物，可以激活A(yù)MPK參與能量代謝[32]。MUSI等通過研究發(fā)現(xiàn)治療糖尿病藥物Metformin同樣可以激活大鼠骨骼肌中AMPK活性并促進(jìn)葡萄糖攝取，其對于α1亞基的激活效果尤為明顯[44]；同時其激活A(yù)MPK依賴于LKB1，體外純化的AMPK并不能被Metformin有效激活[45]。Compound C則能夠抑制AICAR或者抑制Metformin引起的ACC失活，減弱肝細(xì)胞中AICAR和二甲雙胍增加的脂肪酸氧化，也會抑制脂肪生成基因的功能[46]。

對于宰前人工干預(yù)動物AMPK的研究現(xiàn)在主要還集中在體外細(xì)胞培養(yǎng)和小鼠注射方面，禽類及大型動物的宰前處理比較少見，這主要受到注射計量難以確定，Metformin和Compound C等在臨床上存在不良反應(yīng)，溶解Compound C使用的二甲基亞砜(Dimethylsulfoxide, DMSO)同樣具有毒性等問題的限制。小鼠一般采取腹腔注射，Compound C濃度一般為20 mg/kg[47-48]，激活劑濃度則一般在50 mg/kg[29,49]。部分學(xué)者也通過宰后浸泡的方式調(diào)控并觀察AMPK活性，馬霞曾使用0.2～1.0 mmol/L的阿糖腺苷(araA)將蒙古雜交羊肱二頭肌浸泡0～2 h，觀察AMPK活性變化和其活性變化對糖代謝和肉質(zhì)的影響，研究發(fā)現(xiàn)，AMPK 活性被有效抑制(P<0.01)后，己糖激酶的活性降低(P<0.05)，乳酸的蓄積率下降(P<0.05)，宰后初期羊肉的糖酵解過程得到減緩，羊肉品質(zhì)得到一定改善[50]。

4 展望

目前，關(guān)于AMPK活性對禽畜宰后無氧糖代謝和肉品品質(zhì)的影響已經(jīng)有許多報道，具體的影響機(jī)制和相關(guān)通路也逐漸明朗。AMPK已經(jīng)逐漸成為宰后能量代謝的標(biāo)志評價指標(biāo)之一。

既然AMPK活性受多種方式的調(diào)控，因此我們可以人為控制AMPK活性，以降低動物的宰前應(yīng)激效應(yīng)，并進(jìn)一步改善肉的品質(zhì)，降低異質(zhì)肉的發(fā)生率，這對畜禽肉質(zhì)的改善具有重要意義。目前現(xiàn)有的AMPK活性調(diào)節(jié)劑有AICAR、Metformin和Compound C等，但都存在價格過高和注射處理繁瑣等問題，并存在相關(guān)政策禁止使用的問題。同時Compound C本身存在細(xì)胞毒性，不宜在生產(chǎn)中應(yīng)用。因此，切實可用的AMPK活性調(diào)節(jié)技術(shù)有待進(jìn)一步研究。此外，通過宰前待宰條件和養(yǎng)殖環(huán)境的改善來緩解宰前應(yīng)激程度，將動物科學(xué)及食品科學(xué)串聯(lián)起來，將是一種有效的改善途徑。

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Effect of AMP-activated protein kinase on postmortem glycolysis

ZHANG Ming-hao, ZHU Li-xian, ZHANG Yi-min, SHEN Jin, ZHANG Ming-yue, LUO Xin*, LIANG Rong-rong*

(Shandong Agricultural University, Taian 271018, China)

The postmortem energy metabolism of skeletal muscle has important effect on meat quality. Under the condition of postmortem anaerobic, the key kinase activity can be affected by AMP-activated protein kinase (AMPK), which will then affect the glycolysis and meat quality. In this review, the molecule structure of AMPK and the effect of its activity on glycolysis were introduced, and the possible methods to regulate AMPK activity were also raised.

AMP-activated protein kinase(AMPK); postmortem glycolysis; activity regulation; meat quality

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201612040

碩士研究生(羅欣,梁榮蓉為通訊作者，E-mail：luoxin@sdau.edu.cn； lrr327@126.com)。

國家自然科學(xué)基金項目(31401518)；國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(car-038)；山東省農(nóng)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(SDAIT-09-09)

2016-03-31，改回日期：2016-08-10