醬香大曲產(chǎn)香酵母的分離及鑒定

羅小葉，邱樹毅，陸安謀，王曉丹，3*

1(貴州大學(xué),貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽，550025) 2(貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽，550025) 3(貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽，550025) 4(貴州中心釀酒集團(tuán)酒業(yè)有限責(zé)任公司，貴州 遵義，564500)

醬香大曲產(chǎn)香酵母的分離及鑒定

羅小葉1，2，邱樹毅1，2，陸安謀4，王曉丹1，2，3*

1(貴州大學(xué),貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽，550025) 2(貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽，550025) 3(貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽，550025) 4(貴州中心釀酒集團(tuán)酒業(yè)有限責(zé)任公司，貴州 遵義，564500)

采用可培養(yǎng)方法對醬香大曲酵母進(jìn)行分離、鑒定，共篩選出12株酵母，用高粱培養(yǎng)基對酵母的產(chǎn)香功能進(jìn)行初篩，通過感觀評定確定1株主要產(chǎn)果香味的酵母菌株，被篩選出的酵母經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化實驗及26S rDNA 分子生物學(xué)分析鑒定，確定為扣囊復(fù)膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)。對產(chǎn)香酵母風(fēng)味成分進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)檢測分析。結(jié)果表明，醇類物質(zhì)相對百分含量提高了51.87%，包括乙醇、異丁醇、異戊醇、苯乙醇等，這些醇類物質(zhì)共同賦予發(fā)酵產(chǎn)物果香味；酯類物質(zhì)相對百分含量提高了41.39%，包括乙酸乙酯、乙酸異戊酯呈現(xiàn)清靈果香，其他產(chǎn)物如丁酸乙酯、2-甲基丁基乙酸酯、丙酸正戊酯、辛酸乙酯、十六酸乙酯等也在不同程度上呈現(xiàn)出果香味；還檢測到少量的酚類、酮類、醛類、烷烴類以及少量未定成分的物質(zhì)。對醬香大曲產(chǎn)香酵母分離篩選及功能特性進(jìn)行研究，為深入研究醬香型白酒呈香機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)，進(jìn)一步挖掘酵母資源在白酒生產(chǎn)中的作用。

醬香大曲；酵母；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀

酵母的種類及數(shù)量影響白酒的產(chǎn)量和質(zhì)量[1]，同時代謝生成大量不同的風(fēng)味物質(zhì)，對醬香型白酒獨特風(fēng)格的形成具有重要作用。高溫制曲是醬香型白酒生產(chǎn)的一大特色，大曲培養(yǎng)管理曲坯溫度變化分3個階段，首先低溫培菌期，品溫30～40 ℃，霉菌、細(xì)菌、酵母等大量繁殖；進(jìn)入高溫轉(zhuǎn)化期，品溫50～65 ℃，讓已大量生成的菌代謝轉(zhuǎn)化成香味物質(zhì)；最后進(jìn)入后火排潮生香期，品溫不低于45 ℃，以后火促進(jìn)曲心少量多余的水分揮發(fā)和香味物質(zhì)的呈現(xiàn)[2]。酵母菌特殊的細(xì)胞結(jié)構(gòu)特性能使其對高溫的承受能力有限，因而酵母主要在制曲過程的前期大量繁殖，一般占2%～5%，而在大曲后火排潮生香期很少或未檢測到酵母菌[3]。成品曲經(jīng)入庫貯存期6個月，庫房四面通風(fēng)保持冷涼干燥狀態(tài)，貯存期間處于休眠的酵母在適宜溫度、濕度條件下生長活躍起來，出庫時曲塊粉碎成曲粉與高粱混合進(jìn)入釀造過程。本課題組利用純培養(yǎng)技術(shù)對多種醬香大曲生產(chǎn)用曲粉中酵母計數(shù)，表明曲粉中存在酵母，其數(shù)量約為103CFU/g[4]。盡管高溫制曲工藝降低了大曲中酵母的數(shù)量，但曲粉中仍然有一定數(shù)量的酵母，挖掘生產(chǎn)用曲粉酵母資源及探索其功能是有意義的。

茅臺酒廠技術(shù)中心在2001～2006年對茅臺酒制曲發(fā)酵過程中微生物的消長規(guī)律做了系統(tǒng)研究，共分離到了18種酵母，包括假絲酵母、絲孢酵母、漢遜酵母、異常漢遜酵母、畢赤酵母、紅酵母、擬內(nèi)孢霉、白地霉等酵母[5]。此外，還從醬香大曲中分離到了卡斯特假絲酵母、費比恩畢赤酵母、拜耳結(jié)合酵母、Zygosaccharomycesbailii、Stephanoascusciferrii、Pichiameyerae、Cryptococcusneoformans等酵母[1，6]。引入現(xiàn)代分子生態(tài)技術(shù)來研究醬香大曲中的酵母，發(fā)現(xiàn)大曲中還存在Candidasilvae、熱帶假絲酵母[7]。

產(chǎn)香酵母是中國白酒中酯香的主要產(chǎn)生菌，能夠產(chǎn)生以酯香為主的多種香味，這些香味物質(zhì)對賦予酒體濃郁的芳香及促進(jìn)酒體完美和豐滿具有重要作用。茅臺酒廠技術(shù)中心分離到2株產(chǎn)香功能酵母能夠產(chǎn)生多種香味物質(zhì)[8]。研究發(fā)現(xiàn)東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)能產(chǎn)生有機(jī)酸類和高級醇類香味物質(zhì)[9]，卡斯特假絲酵母(Candidacasterllani)能產(chǎn)生乙酸乙酯、異丁醇等香味物質(zhì)[10]。本課題組從醬香型白酒酒醅中分離出2株產(chǎn)乙酸乙酯、異戊醇、乙酸苯乙酯等香味物質(zhì)較高的酵母[11-12]。

成品曲在出房后的貯存過程中，繼續(xù)網(wǎng)絡(luò)周圍環(huán)境中的酵母發(fā)酵生長。釀酒生產(chǎn)使用的是貯存6個月成品曲經(jīng)過粉碎與高粱混合進(jìn)行釀酒生產(chǎn)，因此在生產(chǎn)用的曲粉中有大量的酵母能夠被檢測到。酵母對大曲香味物質(zhì)及前體形成具有重要作用，醬香白酒的生產(chǎn)每一次入窖都要進(jìn)行撒曲，酵母能夠通過撒曲進(jìn)入制酒過程進(jìn)行發(fā)酵和產(chǎn)香。特此對醬香型白酒發(fā)酵生產(chǎn)使用的大曲曲粉中的酵母進(jìn)行分離篩選，探索酵母的產(chǎn)香功能特性，為深入研究醬香型白酒呈香機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)，對進(jìn)一步挖掘酵母資源在白酒生產(chǎn)中的應(yīng)用及開發(fā)我國酒曲中傳統(tǒng)微生物資源具有一定價值。

1 材料與方法

1.1 材料

醬香大曲：由貴州中心釀酒集團(tuán)酒業(yè)有限公司提供，該集團(tuán)坐落于貴州茅臺鎮(zhèn)，始建于1982年，與茅臺集團(tuán)僅一河之隔，同享得天獨厚的水土、氣候等自然條件和空中微生物群資源。本研究所用醬香大曲是采用茅臺鎮(zhèn)傳統(tǒng)工藝制得，在白酒釀造車間取粉碎后待生產(chǎn)使用的曲粉，采用隨機(jī)取樣法在存放處的包裝袋中取20個樣品混勻，其品溫、水分、微生物區(qū)系等均比較穩(wěn)定，能充分代表該醬香大曲中微生物組成特點，樣品4 ℃保存。

1.2 主要培養(yǎng)基

(1)孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基、麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基、麥芽汁液體培養(yǎng)基、PDA瓊脂培養(yǎng)基、玉米粉瓊脂培養(yǎng)基、麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基(市售：上海博微生物科技有限公司)。

(2)生理生化培養(yǎng)基[13]。

(3)高粱小麥培養(yǎng)基：其中高粱與小麥質(zhì)量比為1∶1，小麥全部粉碎，高粱整?！盟榱Ｙ|(zhì)量比為3∶1；加水量50%～60%，混勻后90 ℃熱水潤糧4 h；將培養(yǎng)基盛裝放入滅菌鍋內(nèi)121 ℃滅菌蒸煮20 min；待培養(yǎng)基冷卻到60 ℃加入糖化酶(200 U/g)，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至4.0～4.5，在60 ℃水浴鍋糖化4 h；裝瓶，121 ℃滅菌20 min。其中選用本地高粱作為產(chǎn)香篩選培養(yǎng)基的主要原料，培養(yǎng)基的原料及培養(yǎng)基的制作流程與釀造生產(chǎn)醬香型白酒的相同，高粱的無機(jī)元素及維生素含量豐富，為微生物的生長與繁殖提供物質(zhì)基礎(chǔ)，高粱中COA 對產(chǎn)己酸有利，且對酯化亦有促進(jìn)作用。高粱所含單寧，味苦澀、性收斂，對酶有鈍化作用，降低發(fā)酵力，酒醅中適當(dāng)?shù)膯螌幒靠墒咕契l(fā)酵率高，單寧經(jīng)蒸煮發(fā)酵，可轉(zhuǎn)變成芳香物質(zhì)，賦予白酒特殊的香氣，并有抑制雜菌的作用[14-15]，因此更能模擬和體現(xiàn)酵母在釀造過程的代謝情況。

1.3 主要試驗試劑與儀器

糖化酶(市售)，山東隆大生物工程有限公司；酵母DNA提取試劑盒，美國BIOMIGA公司；其他試劑均為分析純(市售),上海博微生物科技有限公司)。

離心機(jī)，美國貝克曼庫爾特有限公司；Flex cycler多功能PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀，德國耶拿分析儀器股份公司；HP6890/5975C GC-MS聯(lián)用儀，美國安捷倫公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS，Stableflex(2cm)萃取頭，SUPELCO。

1.4 試驗方法

1.4.1 酵母分離純化

稱取樣品10 g至裝有滅菌玻璃珠的90 mL 無菌生理鹽水(9 g/L)的三角瓶中，混勻，30 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)30 min備用。取上清液1 mL進(jìn)行梯度稀釋，取10-2，10-3，10-4，10-5濃度梯度稀釋液200 μL于孟加拉紅培養(yǎng)基上，用涂布棒涂布均勻，30 ℃倒置培養(yǎng)2 d，挑選具有典型酵母菌落形態(tài)特征的菌株在平板上劃線純化，再挑取單菌落進(jìn)行斜面保存并編號，重復(fù)實驗3次[16]。

1.4.2 產(chǎn)香酵母的篩選

將上述純化篩選出的酵母菌株接入20 mL麥芽汁液體培養(yǎng)基，30 ℃、160 r/min擴(kuò)培48 h，使得酵母菌達(dá)到108數(shù)量級，按4%接種量接入高粱小麥培養(yǎng)基，以不接種酵母菌株擴(kuò)培液的高粱小麥培養(yǎng)基為空白對照，30 ℃發(fā)酵25 d，每24 h扣瓶1次，發(fā)酵結(jié)束進(jìn)行感官評定[2]，邀請10位專業(yè)品評人員在本課題組白酒專業(yè)品評室對發(fā)酵產(chǎn)物的酯、酸、酒味進(jìn)行感官評定，各指標(biāo)按照1～10數(shù)字評分，數(shù)值越大代表氣味越強，最后取10組數(shù)據(jù)的平均值作為各菌株各指標(biāo)的最終得分，篩選總體得分最高的菌株。

1.4.3 產(chǎn)香酵母鑒定

1.4.3.1 形態(tài)特征觀察鑒定

將產(chǎn)香菌株分別接種于PDA瓊脂培養(yǎng)基和孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基上，30 ℃倒置培養(yǎng)2 d，觀察并記錄菌落形狀、顏色、透明度、邊緣、質(zhì)地情況等菌落特征。

1.4.3.2 鏡檢特征觀察

在潔凈載玻片上滴加1滴美藍(lán)染液，用接種環(huán)涂布少許菌體涂均勻并蓋上蓋玻片，100倍油鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)特征[16]；同時將酵母接種于玉米粉瓊脂培養(yǎng)基和麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基上，30 ℃倒置培養(yǎng)3 d，觀察所篩選酵母菌假菌絲情況[17]，30 ℃倒置培養(yǎng)7 d觀察子囊孢子情況并分別記錄酵母各項特征[18]。

1.4.3.3 生理生化特征鑒定

對產(chǎn)香酵母進(jìn)行碳源同化實驗、氮源同化實驗、糖發(fā)酵實驗、缺維生素實驗、產(chǎn)類淀粉實驗、脲酶實驗，并參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》加以對比鑒定[13，19]。

1.4.3.4 分子鑒定

(1)酵母DNA提取：參照酵母DNA提取試劑盒(美國BIOMIGA公司)說明書進(jìn)行DNA提?。?/p>

(2)26S rDNA D1/D2區(qū)域的PCR擴(kuò)增[20]：PCR反應(yīng)體系：Mix 12.5 μL，NL1 1 μL，NL4 1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。引物對合成由上海立菲生物技術(shù)有限公司完成(引物序列：NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAA AG-3′)/NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)。

(3)PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)，72 ℃ 10 min，1%瓊脂糖電泳后在凝膠成像儀上確認(rèn)目標(biāo)產(chǎn)物有無及DNA提取效果，所得 PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化送交上海立菲生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

(4)將測序數(shù)據(jù)在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列搜索，選取同源性較高的相關(guān)菌株的26S rDNA D1/D2 區(qū)域序列作為參比對象[21]；用MEGA5.05軟件進(jìn)行多序列比對，并用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[22]。

1.4.4 產(chǎn)香酵母香味物質(zhì)GC-MS分析[12]

將1.4.2篩出的產(chǎn)香酵母的香味物質(zhì)及空白對照進(jìn)行GC-MS分析，其中色譜柱為ZB-5MSI 5% Phenyl-95% Di Methylpolysiloxane (30 m×0.25 mm×0.25 μm)彈性石英毛細(xì)管柱；升溫程序：柱溫35 ℃(保留1 min)，以4 ℃/min升溫至135 ℃，保持2 min，再以8 ℃/min升溫至180 ℃，保持5 min；載氣流量0.8 mL/min；分流比10∶1。樣品預(yù)處理：取高粱小麥發(fā)酵樣品20 g，置于固相微萃取儀采樣瓶中，插入裝有2cm-50/30μm DVB/CAR/PDMS StableFlex纖維頭的手動進(jìn)樣器，在80 ℃頂空萃取40 min；進(jìn)樣：快速移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進(jìn)樣口(溫度250 ℃)中，熱解析2 min，溶劑延遲時間2 min，掃描方式為全掃描。對總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜計算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對Nist2005和Wiley275標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，確定揮發(fā)性化學(xué)成分，用峰面積歸一化法測定各化學(xué)成分的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母分離純化

采用可培養(yǎng)方法，從該曲粉樣品中共分離出12株菌，根據(jù)菌落形態(tài)的差別共歸為5類，其菌落形態(tài)描述見表1。

表1 醬香型大曲中酵母菌落形態(tài)描述

2.2 產(chǎn)香酵母的篩選

將分離純化的12株菌進(jìn)行高粱小麥發(fā)酵，其感官評定結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，F(xiàn)BKL2.0094菌株總評分最高為18分，其中酯味的感官評分最高為9分，酸味6分，酒味3分，這與該發(fā)酵產(chǎn)物所呈現(xiàn)的濃郁果香味相吻合；FBKL2.0084、FBKL2.0085、FBKL2.0087、FBKL2.0089、FBKL2.0090、FBKL2.0093、FBKL2.0095 7株菌總評分均為16分，該7株菌的香味評定低于FBKL2.0094；FBKL2.0088和FBKL2.0092 2株菌的發(fā)酵產(chǎn)香最弱。FBKL2.0094菌株香味物質(zhì)香味最濃，且以果香味為主，最終確定FBKL2.0094菌株為產(chǎn)香功能菌。

表2 酵母發(fā)酵產(chǎn)香感官評價

2.3 產(chǎn)香菌株FBKL2.0094的鑒定

篩選得到產(chǎn)香菌株實驗室保藏編號為FBKL2.0094，在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號為CCTCCM2015382。

2.3.1 FBKL2.0094酵母菌落形態(tài)描述

表3 FBKL2.0094酵母菌落形態(tài)描述

PDA培養(yǎng)基 孟加拉紅培養(yǎng)基圖1 FBKL2.0094酵母菌在兩種培養(yǎng)基上菌落形態(tài)Fig.1 Morphology of yeasts colonies of FBKL2.0094 on two kinds of medium

2.3.2 鏡檢特征

對FBKL2.0094酵母菌進(jìn)行顯微鏡鏡檢，其結(jié)果特征如下表4及圖2所示。

表4 FBKL2.0094酵母顯微形態(tài)

圖2 FBKL2.0094酵母顯微形態(tài)Fig.2 The microscopic morphological description of FBKL2.0094 yeast

2.3.3 生理生化實驗

生理生化實驗結(jié)果表明，F(xiàn)BKL2.0094酵母能夠發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖及蔗糖，不能發(fā)酵乳糖，不能利用棉子糖，但能利用木糖，不能利用硝酸鉀，在缺維生素的培養(yǎng)基上不能生長，不能產(chǎn)生類淀粉，不能分解尿素。結(jié)合《酵母菌的特征與鑒定手冊》及該菌的顯微形態(tài)，該菌能產(chǎn)生子囊孢子和假菌絲，生殖方式為芽殖，可推測該菌與扣囊復(fù)膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)相似度較高。

2.3.4 分子鑒定

將FBKL2.0094酵母測序數(shù)據(jù)在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列搜索(BLAST search)，系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3。FBKL2.0094與扣囊復(fù)膜酵母(SaccharomycopsisfibuligeraJX645719)具有較高的同源性，相似度為100%。

圖3 FBKL2.0094酵母系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The phylogenetic tree of FBXL2.0094 yeast

結(jié)合以上試驗，將該酵母鑒定為扣囊復(fù)膜酵母(Sacchaomycopsisfibuligera)，該菌與扣囊擬內(nèi)孢霉(Endomycopsisfibuligera)同物異名[23]。對醬香大曲中的酵母研究發(fā)現(xiàn)扣囊復(fù)膜酵母是醬香大曲中的優(yōu)勢酵母[7]，茅臺技術(shù)中心在茅臺酒制曲發(fā)酵過程中微生物進(jìn)行分離時分離到擬內(nèi)孢霉[1，6]。從燒酒曲、清香型小曲酒醅中曾分離鑒定出[24-25]。利用高通量測序法對清香大曲酵母群落結(jié)構(gòu)分析及利用DGGE技術(shù)對甜酒曲中酵母多樣性進(jìn)行分析結(jié)果皆表明扣囊復(fù)膜酵母是酒曲中的主要酵母類型[26-28]。

2.4 FBKL2.0094揮發(fā)性成分分析

FBKL2.0094進(jìn)行高粱小麥發(fā)酵產(chǎn)香，結(jié)果表明該酵母香味物質(zhì)呈現(xiàn)濃郁的果香味，香味濃郁且柔和，將該菌株發(fā)酵產(chǎn)物及對照經(jīng)固相微萃取后進(jìn)行GC-MS分析檢測，得到各揮發(fā)性組分名稱及相對百分含量，如圖4所示。

注：對照為未接種酵母菌株的高粱小麥培養(yǎng)基的揮發(fā)性成分。圖4 FBKL2.0094香味物質(zhì)揮發(fā)性成分分析Fig.4 The volatile components analysis of FBKL2.0094 in solid-state fermentation

與對照相比，可看出FBKL2.0094揮發(fā)性香味成分中，醇類物質(zhì)相對百分含量最高為53.42%，而對照中醇類物質(zhì)相對百分含量僅為1.55%，這些醇類物質(zhì)包括乙醇、丙醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇、苯乙醇等共同賦予發(fā)酵產(chǎn)物酒香味和果香味。酯類物質(zhì)的相對百分含量為41.50%，而對照中酯類物質(zhì)相對百分含量僅為0.11%，其中檢測到的酯類物質(zhì)包括乙酸乙酯含量3.89%，表現(xiàn)出清靈、微帶果香的酒香，乙酸異戊酯含量占到1.85%，表現(xiàn)出較強的新鮮果香，其它產(chǎn)物如丁酸乙酯、2-甲基丁基乙酸酯、丙酸正戊酯、辛酸乙酯、十六酸乙酯等也在不同程度上呈現(xiàn)出果香味。在對照中酮類、醛類、呋喃類及烷烴類物質(zhì)相對百分含量略高于產(chǎn)香菌株，表明部分醛酮類物質(zhì)反應(yīng)生成醇類物質(zhì)，呋喃類化合物感官特征主要伴有焦糖和水果氣味，在發(fā)酵過程中，部分呋喃類化合物發(fā)生氧化、還原反應(yīng)[2]。在對照中檢測到烯類和酸類物質(zhì)在產(chǎn)香菌株中未檢測到，其中烯類物質(zhì)經(jīng)化學(xué)反應(yīng)生成醇類物質(zhì)，而酸類化合物在酒中既是重要呈味物質(zhì)又是酯類化合物的前提物質(zhì)[2]，酸類物質(zhì)和醇類物質(zhì)經(jīng)酯化反應(yīng)生成大量酯類物質(zhì)?？勰覐?fù)膜酵母能改善液態(tài)法釀造糯米酒口感淡寡的缺點，以增加酒體芳香類物質(zhì)種類及含量[29]。在醬香大曲中分離到的扣囊復(fù)膜酵母具有產(chǎn)果香功能為醬香型白酒的風(fēng)味有貢獻(xiàn)作用。

3 結(jié)論

通過對醬香大曲產(chǎn)香酵母分離篩選及功能特性進(jìn)行研究，采用可培養(yǎng)方法對醬香大曲酵母進(jìn)行分離、鑒定，共篩選出12株酵母，用發(fā)酵高粱小麥培養(yǎng)基對酵母的產(chǎn)香功能進(jìn)行初篩，通過感觀評定確定1株主要產(chǎn)果香味的酵母菌株，鑒定為扣囊復(fù)膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)。對產(chǎn)香酵母發(fā)酵高粱小麥后揮發(fā)性成分進(jìn)行GC-MS分析，該菌在高粱小麥上代謝產(chǎn)生大量醇類和酯類物質(zhì)使醇類物質(zhì)相對百分含量提高了51.87%；使酯類物質(zhì)的相株對百分含量提高了41.39%，從而賦予發(fā)酵產(chǎn)物濃郁的果香味，最終得到1株具有產(chǎn)果香功能的酵母菌株。

[1] CHEN S, XU Y. The Influence of yeast strains on the volatile flavor compounds of Chinese rice wine[J]. Journal of the Institute of Brewing, 2010, 116(2): 190-196.

[2] 沈怡方.白酒生產(chǎn)技術(shù)全書[M].北京：中國輕工業(yè)出版社.2013:45-87;762-784.

[3] 蔣紅軍.茅臺酒制曲發(fā)酵過程中微生物演替及作用規(guī)律[J].釀酒科技,2004(3):39-40.

[4] 龐博.醬香型大曲酒釀造過程酵母微生態(tài)及功能菌株篩選[D].貴陽:貴州大學(xué)碩士論文,2014.

[5] 范光先,王和玉,崔同弼,等.茅臺酒生產(chǎn)過程中的微生物研究進(jìn)展[J].釀酒科技,2006(10):75-77.

[6] 王彩虹.基于克隆文庫法研究不同香型大曲微生物群落結(jié)構(gòu)[D].自貢:四川理工學(xué)院碩士論文,2014.

[7] 吳徐建.醬香型白酒固態(tài)發(fā)酵過程中酵母與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化規(guī)律的研究[D].無錫:江南大學(xué)碩士論文,2013.

[8] 范光先,王和玉,崔同弼,等.茅臺酒生產(chǎn)過程中的微生物研究進(jìn)展[J].釀酒科技,2006(10):75-77.

[9] 孫劍秋,劉雯雯,臧威.基于26S rDNA D1/D2序列分析醬香型白酒酒醅中酵母菌的群落結(jié)構(gòu)[J].微生物學(xué)報,2012,52(10)：1 290-1 296.

[10] 趙爽,楊春霞,竇屾,等.白酒生產(chǎn)中釀酒微生物研究進(jìn)展[J].中國釀造,2012,31(4):5-10.

[11] 陳美竹,邱樹毅,胡寶東,等.醬香型白酒釀造體系中酵母菌研究進(jìn)展[J].中國釀造,2015,34(6):5-10.

[12] 龐博.醬香型大曲酒釀造過程酵母微生態(tài)及功能菌株篩選[D].貴陽:貴州大學(xué),2014.

[13] 巴尼特,佩恩·亞羅,胡瑞卿譯.酵母菌的特征與鑒定手冊[M].青島:青島海洋大學(xué)出版社,1991.

[14] 楊乾華,丁國祥,曾富言.南北方不同類型高粱的釀酒品質(zhì)差異[J].作物品質(zhì)資源，1994(4):32-33.

[15] 范志勇,左國營,杜新勇,等.高粱原料的不同對醬香型白酒產(chǎn)酒情況的影響[J].釀酒,2014,41(4):36-41.

[16] 沈萍,陳向東,方呈祥,等.微生物學(xué)實驗[M].第四版.北京:高等教育出版社,2007,28-24.

[17] 胡開輝.微生物學(xué)實驗[M].北京:中國林業(yè)出版社,2004:12-20.

[18] 楊文博.微生物學(xué)實驗[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2004.31-33.

[19] 汪江波,張晶,方尚玲,等.稻花香包包曲制曲過程微生物區(qū)系動態(tài)變化研究[J].釀酒,2010,37(2):35-37.

[20] FELL J W, BOEKHOUT T, FONSECA A, et al. Biodiversity and systematics of basidiomycetous yeasts as determined by large-subunit rDNA D1/D2 domain sequence analysis[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2000, 50(3): 1 351-1 371.

[21] 孔維兵,王曉丹,班世棟,等.醬香型大曲中酵母分離鑒定[J].釀酒,2015,42(1):57-62.

[22] TAMURA K, DUDLEY J, NEI M, et al. MEGA4: Molecular evolutionary genetics analysis (MEGA )software version 4.0[J]. Mol Biol Evol, 2007,24(8): 1 596-1 599.

[23] 高亦豹.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)—變性梯度電泳技術(shù)(PCR-DGGE)研究中國白酒大曲中微生物群落結(jié)構(gòu)[D].無錫:江南大學(xué), 2010.

[24] 應(yīng)玲云,伍時華,趙東玲,等.燒酒曲中扣囊復(fù)膜酵母的分離及鑒定[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2013,39(1):146-150.

[25] 庾昌文,薛棟升,郭威,等.酒醅中高產(chǎn)淀粉酶酵母的分離鑒定及產(chǎn)酶條件研究[J].釀酒,2015,42(5):71-75.

[26] 喬曉梅,趙景龍,杜小威,等.高通量測序法對清香大曲真菌群落結(jié)構(gòu)的分析[J].釀酒科技,2015(4):28-31.

[27] 喬曉梅.清香大曲糖化力酯化力功能及真菌群落結(jié)構(gòu)分析[D].太原:山西師范大學(xué),2015.

[28] 閆華文.甜酒曲中真菌多樣性的研究及甜酒營養(yǎng)成分分析[D].曲阜:曲阜師范大學(xué),2015.

[29] 王琨,伍時華,趙東玲,等.扣囊復(fù)膜酵母復(fù)合菌株對糯米酒風(fēng)味物質(zhì)的影響[J].釀酒,2015,42(2):28-33.

Isolation and identification of aroma-producing yeast in Moutai-flavorDaqu

LUO Xiao-ye1，2, QIU Shu-yi1，2, CHEN Mei-zhu1,3, LU An-mou4, WANG Xiao-dan1，2，3*

1(Guizhou Provincial Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biological Pharmacy,Guizhou University, Guiyang 550025,China) 2(School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China) 3(College of Life Sciences,Guizhou University,Guiyang 550025,China) 4(Zhong Xin Brewery Group Co. Ltd, Zunyi 564500,China)

Cultivable methods were used to isolate and identify the yeast from Moutai-flavorDaquand 12 yeast strains were selected. Sorghum medium was used to screen these yeast strains with aroma-producing ability and one strain producing strongest fruit flavor were screened out through sensory evaluation. By morphological observation, physiological and biochemical experiments and molecular biological analysis of 26S rDNA, this yeast strain was identified asSaccharomycopsisfibuligera. The flavor components of this aroma-producing yeast strain were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The results showed the relative content of alcohols including ethanol, isobutanol, isoamyl alcohol, phenethyl alcohol etc increased by 51.87%, which gave rise to fruit flavor of fermented products. The relative percentage of esters including ethyl acetate and iso-amyl acetate increased by 41.39%, andresulted in Qing-Ling fruit flavor. Other products such as ethyl butyrate, 2-methylbutyl acetate, N-amyl propionate, ethyl caprylate and ethyl palmitate etc also showed fruit flavor at varying degrees.Minor amounts of phenols, ketones, aldehydes, alkanes and little undetermined constituents were also detected. Research on functional properties of the isolated yeast strains from Moutai-flavorDaqucould not only provide basic data and theoretical basis for further study on aroma mechanism, but also could further explore the role of yeast resources in Moutai-flavor liquor production.

Moutai-flavorDaqu;yeast;gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201612005

碩士研究生(王曉丹工程師為通訊作者，E-mail：wangxiaodan0516@126.com)。

貴州省重大專項項目(黔科合重大專項字[2013]6009號)；貴州省省校合作計劃項目黔科合LH字[2014]7672

2016-06-16，改回日期：2016-07-23