RDP相同NFC及硫水平不同的日糧對人工奶牛瘤胃發(fā)酵影響

■黃國欣 劉大森杜江華 李桂森 王 賽 鄭 帥

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

粗蛋白(CP)是反芻動物的重要營養(yǎng)物質(zhì)之一,主要包括瘤胃降解蛋白(RDP)和過瘤胃蛋白(NFC)。其中瘤胃降解蛋白有利于瘤胃微生物的生長，而微生物為動物提供所需蛋白質(zhì)的70%～80%[1]，同時(shí)微生物的增加也有利于飼料的消化與吸收，但是瘤胃降解蛋白過多會導(dǎo)致瘤胃氨產(chǎn)生量過高[2]，過多的氨通過肝臟的轉(zhuǎn)化生成尿氮(N)，造成了蛋白質(zhì)的浪費(fèi)甚至?xí)?dǎo)致動物氨中毒。非結(jié)構(gòu)性碳水化合物(如谷物和糖蜜)通常作為反芻動物的高能量飼料。非結(jié)構(gòu)性碳水化合物在瘤胃的發(fā)酵過程中快速地轉(zhuǎn)化成丙酸，丙酸是糖異生作用的重要前提物質(zhì)[3]。非結(jié)構(gòu)性碳水化合物影響著瘤胃的發(fā)酵，如降低原蟲的數(shù)量、pH值和飼料的消化率，甚至?xí)绊憚游锏牟墒沉縖4]。瘤胃能氮同步釋放概念是根據(jù)瘤胃微生物的生長特性，通過對日糧中能量載體物質(zhì)和含氮物質(zhì)等同步化因子的調(diào)控，使其在瘤胃的發(fā)酵降解過程中物質(zhì)形式總量和釋放速度上相互匹配，促進(jìn)微生物生長和瘤胃發(fā)酵的過程[5-6]。因此NFC和RDP的比例對瘤胃發(fā)酵的影響顯得尤為重要[7]。在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)飼料中含有約10%～13%RDP和56%的NFC時(shí)，瘤胃中的微生物粗蛋白(MCP)含量高，然而當(dāng)NFC∶RDP的比為2∶1時(shí)，微生物粗蛋白含量最高[8]，此外，NFC與RDP適當(dāng)?shù)谋壤梢杂行У靥岣叩纳锢寐蔥9-10]。

硫(S)是反芻動物所必需的礦物元素之一，在動物體內(nèi)約占動物體重的0.25%，廣泛存在于含硫氨基酸、維生素、肝素、纖維蛋白原、輔酶A及谷胱甘肽中，同時(shí)動物的蹄爪、被毛、角等各種角質(zhì)蛋白質(zhì)中也含有。硫在反芻動物體內(nèi)起著重要的生理作用，對提高反芻動物生產(chǎn)力具有十分重要的意義。硫能夠影響瘤胃微生物的合成[11-12]以及纖維素的消化[12]。增加硫的含量會降低甲烷的排量[13]與干物質(zhì)采食量[14]，影響瘤胃的發(fā)酵。NRC(1981)建議S與N的比為1∶10，而N的來源主要是RDP提供的，因此我們猜想NFC/RDP與硫含量之間也會有相互作用共同影響瘤胃內(nèi)環(huán)境，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)研究的總體目標(biāo)是在滿足動物營養(yǎng)需要量的前提下，按照NRC營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，通過人工瘤胃體外培養(yǎng)瘤胃液的方法探究不同NFC/RDP及硫水平對瘤胃發(fā)酵內(nèi)環(huán)境、主要發(fā)酵指標(biāo)和菌體蛋白合成量的影響。從而揭示能氮同步釋放和硫之間的相互作用關(guān)系及對瘤胃發(fā)酵的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物與飼養(yǎng)管理

選擇3只健康無病、體重相近，且裝有永久性瘤胃瘺管的荷斯坦奶牛用于提取瘤胃液。瘺管牛的飼料按照NRC奶牛營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制，日喂兩次（07:00和19:00）先喂草料，后投精料，精粗比為45∶55，自由飲水，每日清晨清除剩料，并更換清潔飲水，清理牛舍，維持牛舍的干燥衛(wèi)生清潔。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)以短期人工瘤胃法模擬瘤胃發(fā)酵的方法進(jìn)行體外試驗(yàn)。試驗(yàn)的飼料原料采用尼龍袋法測定出原料中RDP與NFC的含量，并根據(jù)飼料原料中RDP與NFC含量的不同設(shè)計(jì)3種日糧中總的能量和蛋白相同，RDP含量相同，NFC含量不同，NFC/RDP分別為3.35、4、4.8，并向每一種日糧配方中添加硫酸鈉使3種日糧中的硫濃度分別達(dá)到0.15%、0.2%、0.25%和0.3%。形成3×4雙因素完全隨機(jī)分組試驗(yàn)，具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)分組見表1。每組日糧取少量制成風(fēng)干樣，粉碎過40目篩供體外發(fā)酵試驗(yàn)使用。

1.3 體外發(fā)酵試驗(yàn)

1.3.1 瘤胃液的采集與發(fā)酵液的制備

瘤胃液采集與混合發(fā)酵液制備，晨飼前從3頭已選好的荷斯坦奶牛瘤胃中采集瘤胃液，混合均勻后，通過4層紗布過濾，裝于充滿CO2的保溫瓶中保存，在最短時(shí)間內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，39℃水浴備用。人工唾液參照隋美霞[14]方法配制，加入1%刃天青數(shù)滴為指示劑，并向配制好的人工唾液中通入CO2直至溶液顏色由藍(lán)色變?yōu)闊o色即為氧氣除凈。然后按人工唾液與瘤胃液為2∶1的比例制備混合發(fā)酵液備用。

表1 日糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3.2 試驗(yàn)方法和測定指標(biāo)

試驗(yàn)共分12個(gè)處理組，每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)發(fā)酵瓶中加入0.6 g日糧和60 ml發(fā)酵液。發(fā)酵瓶口用橡皮塞密閉，使用三通氣閥與注射器相連。發(fā)酵瓶置于39℃水浴搖床中以40 r/min的速度振蕩。培養(yǎng)瓶分別在2、4、8、12、24 h后取出，立即用pH計(jì)測定pH值，3 500 r/min離心15 min,沉淀用于測定飼料干物質(zhì)的降解率(DMD)，取上清液-20℃冷凍保存用于測定氨態(tài)氮（NH3-N）、VFA、菌體蛋白的含量。

1.3.3 數(shù)據(jù)的測定方法

產(chǎn)氣量直接從注射器上就可讀出，采用Sartorius-PB-20型酸度計(jì)測pH值；NH3-N采用馮宗慈[15]的方法進(jìn)行測定；菌體蛋白含量參考Askar等[16]方法測定；干物質(zhì)用烘干稱重法測定，揮發(fā)性脂肪酸參照秦為琳[17]的方法采用氣相色譜柱進(jìn)行測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2003軟件初步整理，結(jié)果處理采用SAS進(jìn)行雙因素分析，方差分析和多重比較，以P＜0.05為差異顯著。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 pH值（見表2）

由表2可知，NFC/RDP對pH值影響除2 h外均顯著(P＜0.05)，NFC/RDP為4的處理組pH值顯著高于NFC/RDP為4.8的處理組(P＜0.05)。硫水平在4 h時(shí)對pH值影響不顯著（P＞0.05），其余時(shí)間點(diǎn)影響顯著。在各時(shí)間NFC/RDP的比值和硫水平之間均存在交互作用。

2.2 產(chǎn)氣量（見表3）

表2 NFC/RDP及硫水平對瘤胃pH值的影響

表3 NFC/RDP及硫水平對產(chǎn)氣量的影響（ml）

如表3所示，不同處理組底物發(fā)酵產(chǎn)氣量隨時(shí)間的動態(tài)變化情況。各處理組的底物發(fā)酵的產(chǎn)氣量均隨時(shí)間延長而增加。NFC/RDP水平對產(chǎn)氣量影響顯著（P＜0.05），NFC/RDP為4的處理組各時(shí)間點(diǎn)的產(chǎn)氣量均顯著高于其他兩水平（P＜0.05）。硫水平對處理的產(chǎn)氣量影響顯著（P＜0.05），硫水平為0.25%的處理組顯著高于其他處理組（P＜0.05）。除8 h外，NFC/RDP和硫水平對產(chǎn)氣量均存在交互效應(yīng)。

2.3 NH3-N（見表4）

表4 NFC/RDP及硫水平對瘤胃NH3-N的影響(mg/100 ml)

由表4可見，NFC/RDP比值在8、12 h和24 h時(shí)各處理組的NH3-N濃度影響顯著(P＜0.05)，且NFC/RDP比值為4的處理組顯著低于NFC/RDP水平為3.35的處理組。硫水平在2、4 h和8 h時(shí)對各處理組的NH3-N濃度影響不顯著（P＞0.05）；硫水平在12 h和24 h對各處理組的NH3-N濃度影響顯著(P＜0.05)，且NH3-N濃度隨著硫添加量的增加而降低。NFC/RDP和硫水平對NH3-N濃度存在交互作用。

2.4 菌體蛋白（見表5）

如表5所示，各處理組的菌體蛋白濃度隨時(shí)間的延長而增加。NFC/RDP對各處理的菌體蛋白含量影響差異顯著(P＜0.05)，NFC/RDP為4的處理組MCP含量顯著高于3.35的處理組(P＜0.05)，各NFC/RDP水平的處理組MCP含量由高到低依次為4＞4.8＞3.35。硫水平對各處理組MCP含量影響差異顯著(P＜0.05)。硫水平為0.25%的處理組的MCP含量最高。NFC/RDP和硫水平在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)對MCP濃度均不存在交互作用。

2.5 飼料干物質(zhì)降解率（見表6）

由表6可以看出，隨時(shí)間的延長，各處理組的DM降解率不斷增加。NFC/RDP在12 h時(shí)對DM降解率影響不顯著（P＞0.05），其他時(shí)間點(diǎn)影響均顯著(P＜0.05)。NFC/RDP水平為4時(shí)，DMD略高于其他時(shí)間點(diǎn)。不同硫水平在各時(shí)間點(diǎn)對DM降解率的影響差異均為顯著(P＜0.05)。硫水平為0.25%的處理組在各時(shí)間點(diǎn)DM的降解率均高于其他各組。各時(shí)間點(diǎn)的NFC/RDP和硫水平之間存在交互作用。

2.6 NFC/RDP和硫水平對瘤胃VFA含量的影響（見表7、表8、表9）

表5 NFC/RDP及硫水平對瘤胃菌體蛋白濃度的影響(mg/100 ml)

表6 NFC/RDP及硫水平對瘤胃DM降解率的影響(%)

表7 NFC/RDP及硫水平對瘤胃乙酸的影響(mmol/l)

由表7可知，各處理組底物發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸均隨時(shí)間的延長而增加。除24 h外，NFC/RDP對各處理組乙酸含量影響顯著(P＜0.05)，NFC/RDP水平為3.35的處理組的乙酸濃度顯著高于其他兩處理組(P＜0.05)，不同硫水平之間僅在4 h時(shí)存在差異（P＞0.05），硫水平在其他時(shí)間點(diǎn)對乙酸濃度影響不顯著。NFC/RDP與硫水平在8 h時(shí)存在交互作用。

如表8所示，各處理組的丙酸濃度隨時(shí)間的延長而增加。在各時(shí)間點(diǎn)NFC/RDP水平丙酸濃度影響顯著，NFC/RDP水平為4.8的處理組丙酸濃度最高。硫水平對相同時(shí)間點(diǎn)的各處理組丙酸濃度影響顯著(P＜0.05)，丙酸濃度隨底物含硫量的提高而升高，但硫含量為0.3%時(shí)略有下降。除2 h外，NFC/RDP和硫水平在各時(shí)間均存在交互作用。

表8 NFC/RDP及硫水平對瘤胃丙酸的影響(mmol/l)

表9 NFC/RDP及硫水平對瘤胃丁酸的影響(mmol/l)

表9列出了不同NFC/RDP和硫水平對不同處理組的丁酸濃度動態(tài)變化的影響。NFC/RDP水平對各處理組丁酸濃度在各時(shí)間點(diǎn)影響差異顯著(P＜0.05)，NFC/RDP水平為4.8的處理組丁酸水平顯著高于NFC/RDP水平為4的處理組(P＜0.05)，除2 h外，其他時(shí)間點(diǎn)3.35的處理組丁酸水平顯著高于NFC/RDP水平為4的處理組(P＜0.05)。硫水平對丁酸濃度影響顯著(P＜0.05)，硫水平為0.25%的處理組的丁酸濃度顯著高于其他各組(P＜0.05)。NFC/RDP水平和硫水平在各時(shí)間點(diǎn)均存在交互作用。

3 討論

pH值是瘤胃發(fā)酵的一個(gè)重要指標(biāo)。在這個(gè)試驗(yàn)中，pH值變化從6.5到6.75，適合纖維素的消化[18]。隨著NFC供給的不同，pH值的變化與Broderick[19]試驗(yàn)結(jié)果相一致；此外，pH值也隨S濃度增加而提高，但是這與Weston[20]的結(jié)果不一致，Qi[21]沒有發(fā)現(xiàn)硫濃度和pH值之間的關(guān)系。這種的結(jié)果不一致可能是由于試驗(yàn)動物不同，導(dǎo)致動物所提供的用于做人工瘤胃發(fā)酵的瘤胃液也不同。

NH3-N是反映了飼料氮源在瘤胃中的降解以及微生物對氮源的利用情況的重要指標(biāo)，12 h之后隨著硫濃度的增加瘤胃內(nèi)NH3-N的含量降低，這與Siebert[22]和Elliott[23]的試驗(yàn)結(jié)果一致。在NFC的水平,在8 h之后才有差異，其原因可能是，雖然各處理組NFC含量不同，但是前8 h時(shí)日糧中RDP水平和NFC均可滿足微生物的需要，然而隨著微生物的繼續(xù)發(fā)酵，雖然RDP還有剩余，但是由于各實(shí)驗(yàn)組的NFC含量的不同，致使NH3-N的利用率也不相同，各處理組之間由此出現(xiàn)差異。

瘤胃內(nèi)MCP的合成主要取決于瘤胃內(nèi)碳水化合物和N的利用效率，瘤胃微生物活性受到NFC與RDP比例的影響。當(dāng)比值為4時(shí)MCP產(chǎn)量最高這與[7]試驗(yàn)結(jié)果一致。硫?qū)w蛋白的影響也顯著，當(dāng)硫水平從0.15%到0.25%不等，MCP的含量逐漸上升[24]，但是當(dāng)硫水平提高到0.3%的濃度時(shí)菌體蛋白又有所下降，說明過量的硫抑制了瘤胃微生物的生長。

瘤胃中VFA主要包括乙酸、丙酸和丁酸，是碳水化合物在瘤胃中發(fā)酵的主要產(chǎn)物。乙酸是反芻動物合成乳脂的主要前體，丙酸則是反芻動物重要的葡萄糖前體，因此提高乙酸在VFA中的比例可以提高奶牛的產(chǎn)奶性能，而提高丙酸含量則有利于反芻動物的育肥。碳水化合物成為VFA的主要原因影響因素,隨著NFC的增加乙酸和丙酸的含量也隨之增加，當(dāng)硫濃度從0.15%提高到0.25%時(shí)，發(fā)現(xiàn)丙酸和丁酸濃度逐漸增加，然而乙酸濃度降低，這個(gè)結(jié)果與Zinn[25]一致。但是在硫水平為0.3%時(shí)略有下降。硫水平對乙酸的影響與張桂國的結(jié)果基本一致。

本試驗(yàn)中不同NFC/RDP水平的各處理組的產(chǎn)氣量由大到小依次為4＞4.8＞3.35，說明能氮同步化釋放對瘤胃發(fā)酵影響顯著，其中當(dāng)NFC/RDP為4時(shí)飼料的消化程度最高，但與湯少勛[26]的研究結(jié)果有差異。添加硫能顯著提高產(chǎn)氣量，但是當(dāng)硫?yàn)?.3%時(shí)對產(chǎn)氣量又有抑制作用。本試驗(yàn)中NFC/RDP水平和硫水平對各處理組的瘤胃發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響變化情況與各處理組DM降解情況基本一致，與Tuah[27]的研究結(jié)果基本一致。

當(dāng)RDP相同時(shí)，本試驗(yàn)中不同NFC/RDP對DM降解率的影響顯著（12 h除外），除4 h外，其它各時(shí)間點(diǎn)NFC/RDP水平為4時(shí)DMD數(shù)值上均高于其它各處理組，這與趙永生[28]的結(jié)果有一致性。試驗(yàn)中，DM的降解率隨著硫水平的提高而增加，但當(dāng)硫含量達(dá)到0.3%時(shí)，DM的降解率出現(xiàn)顯著下降。硫水平對DM降解率的影響結(jié)果與王娜[29]和王潤蓮等[30]研究結(jié)果基本一致。

4 結(jié)論

當(dāng)日糧RDP相同時(shí)，不同NFC/RDP水平對pH值、NH3-N、產(chǎn)氣量、VFA菌體蛋白、DM降解率影響顯著；NFC/RDP的比為4、硫添加量為0.25%的處理組可明顯改善瘤胃環(huán)境，促進(jìn)瘤胃發(fā)酵，提高飼料各成分的降解率。