黑果腺肋花楸花色苷對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901作用的初步探究

李夢(mèng)莎，王 化，朱良玉，周麗萍，張悅

（黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所濕地與生態(tài)保育國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150040）

黑果腺肋花楸花色苷對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901作用的初步探究

李夢(mèng)莎，王 化，朱良玉，周麗萍*，張悅

（黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所濕地與生態(tài)保育國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150040）

以人胃癌細(xì)胞SGC-7901作為模型研究黑果腺肋花楸花色苷的抗腫瘤活性，通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)黑果腺肋花楸花色苷對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。MTT結(jié)果表明，不同濃度的黑果腺肋花楸花色苷處理SGC-7901細(xì)胞24h、48h、72h后，黑果腺肋花楸花色苷均可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。當(dāng)濃度在1mg/mL-8mg/mL范圍內(nèi)，兩種花色苷組分均有明顯的抑制效果。8mg/mL花色苷組分2處理72h抑制率最高達(dá)到49.49%。但是在低濃度（1mg/mL以下）給藥后兩種花色苷組分并沒有明顯的線性規(guī)律與變化趨勢(shì)，說明花色苷的純度與還原能力與腫瘤的抑制率并沒有直接的關(guān)系，還需要進(jìn)一步探究。

黑果腺肋花楸；花色苷；胃癌細(xì)胞SGC-7901

黑果腺肋花楸（Aornia mealnocarpa Elliot）為薔薇科（Roseeeae）腺肋花楸屬多年生葉灌木。該植物原產(chǎn)于美國(guó)東北部，波羅的海沿岸至太平洋沿岸均有廣泛分布，是集食用、藥用、綠化和觀賞于一身的經(jīng)濟(jì)樹種。黑果腺肋花楸果實(shí)不僅具有很好的風(fēng)味和色澤，而且含有高濃度的花色苷等黃酮類化合物，均具有較強(qiáng)的抗氧化活性，其中花色苷是其主要的抗氧化成分[1-4]。

花色苷是一類廣泛地存在植物中的水溶性天然色素，是糖與糖苷鍵結(jié)合的一類化合物，Nemanija[5]等對(duì)直腸癌細(xì)胞Caco-2與HT-29的研究表明，黑果腺肋花楸果汁提取物具有很強(qiáng)的抑制作用，同時(shí)，在體外消化模型中具有極強(qiáng)的抗氧化與抗癌作用。Malik等[6]研究了黑果腺肋花楸對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞（HT-29）細(xì)胞周期的阻滯作用及作用機(jī)制，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)該癌細(xì)胞的抑制作用是通過抑制其生長(zhǎng)實(shí)現(xiàn)的，而非細(xì)胞毒作用。且花色苷的抗突變活性是通過其自由基清除作用和抑制前致突變物的活化酶而發(fā)揮作用的。有研究表明紫薯花色苷能促進(jìn)人肝癌細(xì)胞HepG2的凋亡，且細(xì)胞的凋亡率隨著花色苷的濃度增加而增大[7]。

近年來花色苷抗腫瘤的作用越來越受到人們的關(guān)注。有研究表明花色苷對(duì)人腫瘤細(xì)胞有殺傷作用，對(duì)多種癌細(xì)胞如乳腺癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞等都具有不同程度的抑制作用[8-10]。然而黑果腺肋花楸花色苷抑制人胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖，誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制尚不清楚，本實(shí)驗(yàn)以SGC-7901細(xì)胞為模型，采用MTT比色法，初步探究黑果腺肋花楸花色苷對(duì)SGC-7901細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)，為胃病的預(yù)防、治療及功能食品開發(fā)提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

黑果腺肋花楸果實(shí)：采購(gòu)自吉林省延吉市。

人胃癌細(xì)胞株SGC-7901由東北林業(yè)大學(xué)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室提供。

主要試劑：胰蛋白酶（天津市灝洋生物制品有限責(zé)任公司）；胚胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；DMEM培養(yǎng)基（Gibson公司）；二甲基亞砜（DMSO）（Amresco公司）；無水乙醇（天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠）。

1.2 方法

1.2.1 黑果腺肋花楸花色苷的制備

取黑果腺肋花楸適量，依據(jù)李夢(mèng)莎[11]的方法進(jìn)行高效提取花色苷。合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去提取溶劑，經(jīng)X-5大孔樹脂純化，挑選出兩種體外抗氧化活性較高的花色苷組分（組分1、組分2），減壓濃縮，真空冷凍干燥得到藍(lán)靛果花色苷粉末，用培養(yǎng)基稀釋到一定濃度，過0.22mm濾孔膜后用于細(xì)胞試驗(yàn)。

1.2.2 黑果腺肋花楸花色苷純度的評(píng)價(jià)

取經(jīng)純化制備的黑果腺肋花楸花色苷各組分0.0100g（精確到0.0001g），用80%乙醇溶解后定容至于100mL的容量瓶中，pH試差法測(cè)定各組分中花色苷含量，根據(jù)公式計(jì)算制備的花色苷的純度。

P(%)=(M1/M2)×100%

式中：P表示漿果花色苷純度（%）；M1表示組分中花色苷含量（mg）；M2表示組分重量（mg）。

1.2.3 黑果腺肋花楸花色苷總還原力的測(cè)定

還原能力的測(cè)定選取Tsai等采用的鐵氰化鉀還原顯色法。通過700nm波長(zhǎng)下的吸光度值（A1-A0）來衡量各濃度漿果花色苷的還原能力，還原能力高低與吸光度值大小成正相關(guān)。以抗壞血酸作為陽性對(duì)照品。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)

人胃癌細(xì)胞株SGC-7901用含10%胎牛血清的DMEM作為細(xì)胞培養(yǎng)基，細(xì)胞株置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.5 細(xì)胞抑制率的測(cè)定

將兩種癌細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，經(jīng)胰蛋白酶消化后，用培養(yǎng)基稀釋成1×105個(gè)/mL。在96孔板的每孔中加入100μL的細(xì)胞懸液，置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。再取出孔板在每孔中加入設(shè)定好濃度的樣品液，同時(shí)設(shè)不加樣的為空白對(duì)照，培養(yǎng)24h。

培養(yǎng)時(shí)間到后，將每孔中加入10μLMTT（5mg/mL），置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。用移液槍移去清液，再加入150mL DMSO溶液，振蕩10min使其充分溶解，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。并計(jì)算抑制率：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組OD/對(duì)照組OD）×100%

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 黑果腺肋花楸花色苷純度

通過對(duì)黑果腺肋花楸花色苷純度進(jìn)行分析，樣品1和樣品2的純度分別達(dá)到了46.03%和56.77%（表1）。樣品2的純度高于樣品1的純度，但是二者差異比較顯著（P＜0.05）。

2.2 黑果腺肋花楸花色苷的總還原能力分析

從圖1可以得出，黑果腺肋花楸花色苷組分2的總還原能力最強(qiáng)，達(dá)到590/g。組分1與組分2的總還原能力均與同濃度的Vc的總還原力差異顯著（P＜0.05）（圖1）。這說明組分1和組分2的總還原力都高于Vc對(duì)照。

2.3 MTT法的檢測(cè)結(jié)果

由圖2可以看出，組分1對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901有一定的抑制作用，但是當(dāng)濃度小于1mg/mL的時(shí)候，抑制率不明顯，隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，抑制率也隨之升高。當(dāng)濃度為8mg/mL的時(shí)候，抑制率最高，達(dá)到了39.87%。

在1、2、4、8mg/mL花色苷樣品1作用SGC-7901細(xì)胞24h后，抑制了細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制率分別為19.54%、25.33%、30.21%、33.45%；在加藥培養(yǎng)48h后，抑制率為27.01%、30.22%、32.36%、35.88%；加藥72h后，抑制率最終達(dá)到28.93%、34.21%、35.05%、39.87%。

表1 漿果花色苷純度

圖1 黑果腺肋花楸花色苷總還原力比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黑果腺肋花楸花色苷組分1在濃度達(dá)到一定水平后（1mg/mL-8 mg/mL）可以有效抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)，其抑制作用隨藥物濃度的增大而增大，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，顯示出有明顯的量效關(guān)系。

由圖3可以看出，組分2對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901有一定的抑制作用，抑制率隨著濃度逐漸增加，呈現(xiàn)先下降再上升的趨勢(shì)。當(dāng)濃度為8mg/mL的時(shí)候，抑制率最高，達(dá)到了49.49%。

在1、2、4、8mg/mL花色苷樣品2作用SGC-7901細(xì)胞24h后，抑制了細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制率分別為10.30%、32.01%、32.96%、44.22%；在加藥培養(yǎng)48h后，抑制率為12.54%、34.63%、35.42%、46.18%；加藥72h后，抑制率最終達(dá)到15.21%、38.16%、39.45%、49.49%。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黑果腺肋花楸花色苷組分2抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901制細(xì)胞生長(zhǎng)，其抑制作用隨藥物濃度的增大而顯示出先下降再上升的趨勢(shì)，而當(dāng)濃度達(dá)到0.25mg/mL以后，其抑制作用隨藥物濃度的增大而增大，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增大。

綜上，兩種黑果腺肋花楸花色苷組分都可以有效的抑制癌細(xì)胞的增殖，并且當(dāng)濃度在1mg/mL-8mg/mL范圍內(nèi)，兩種花色苷組分均有明顯的量效關(guān)系。

3 討論

至今為止癌癥一直是讓人類難以攻克的疾病之一，也是人類最主要的死亡病因之一。目前常用來治療惡性腫瘤的方法是外科手術(shù)、化學(xué)療法和放射療法。但是存在毒副作用，治療不徹底，復(fù)發(fā)率高等弊端，此外還會(huì)出現(xiàn)耐藥性[12-14]。因此從天然產(chǎn)物中尋找毒副作用小、作用顯著的具有抗腫瘤作用的生物活性成分或者抗腫瘤輔助藥物，成為現(xiàn)在抗腫瘤藥物的發(fā)展戰(zhàn)略和方向之一。

圖2 黑果腺肋花楸花色苷組分1對(duì)癌細(xì)胞的抑制率

圖3 黑果腺肋花楸花色苷組分2對(duì)癌細(xì)胞的抑制率

本研究應(yīng)用MTT比色法研究黑果腺肋花楸花色苷對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901的作用進(jìn)行了初探，結(jié)果表明，兩種黑果腺肋花楸花色苷組分都可以有效的抑制癌細(xì)胞的增殖。實(shí)驗(yàn)中所用的黑果腺肋花楸花色苷組分2的純度要高于組分1，同時(shí)，總還原能力也比組分1強(qiáng)。當(dāng)濃度高于2mg/mL時(shí)，組分2在所有水平下的抑制率均高于組分1的抑制率，并且兩種花色苷組分都顯示出了明顯的量效關(guān)系。但是在低濃度（1mg/mL以下）給藥后兩種花色苷組分并沒有明顯的線性規(guī)律與變化趨勢(shì)，說明花色苷的純度與還原能力與腫瘤的抑制率并沒有直接的關(guān)系，還需要進(jìn)一步探究。本研究結(jié)果為花色苷應(yīng)用于新型抗腫瘤藥物提供了理論依據(jù)，也為進(jìn)一步開發(fā)利用黑果腺肋花楸資源奠定了重要基礎(chǔ)。

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Study on the Effects of Anthocyanin of Aronia on Human Gastric Cancer Cell SGC-7901

LI Meng-sha et al

(Institute of Natural Resources and Ecology,HAS.National and Provincial Joint Engineering Laboratory of Wetlands and Ecological Conservation,Harbin 150040,China)

The anti-tumor activity of Anthocyanin of Aronia to human Gastric cancer cells SGC-7901 was studied by MTT experiment which studied the inhibiting effect of Anthocyanin of Aronia on cell growth.The results of MTT experiment indicated that the Anthocyanin of Aronia of different concentrations which were treated for 24,48,72h can all restrain the growth of cancer cell.WhentheconcentrationsofAnthocyaninwerebetween 1mg/mL-8mg/mL,the two Anthocyanin components had obviously dose-effect relationships.The highest inhibition ratio was 49.49%, which is 8mg/mL of the component 2 of Anthocyanin after being treated on 72 hours.However,there was no obviously linear rules and variation trend in the two components of Anthocyanin when in the low concentrations(below 1mg/mL),which showed that the purity and reducing capacity of Anthocyanin were no directly relationships with inhibition ratio of tumor.

Aronia melanocarpa;Anthocyanin; Gastric Cancer Cell SGC-7901

R284

A

李夢(mèng)莎（1986-），女，黑龍江哈爾濱人，助理研究員，碩士，從事植物天然產(chǎn)物提取及利用。

周麗萍（1976-），女，吉林延邊人，副研究員，碩士，從事植物天然產(chǎn)物提取及利用。

（2016-11-03收稿S編輯）

1003-7853（2016）06-0090-03

黑龍江省科學(xué)院青年創(chuàng)新基金重點(diǎn)資助項(xiàng)目“黑果腺肋花楸花色苷分離純化及抗癌活性初步研究”（ZRS201501）