微生物轉(zhuǎn)化連翹苷制備連翹脂素的研究

梅建鳳， 董志紅， 易 喻， 陳建澍， 張彥璐， 應(yīng)國清

浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014

微生物轉(zhuǎn)化連翹苷制備連翹脂素的研究

梅建鳳， 董志紅， 易 喻， 陳建澍， 張彥璐， 應(yīng)國清

浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014

本文旨在開發(fā)一種微生物轉(zhuǎn)化工藝，將連翹苷轉(zhuǎn)化為活性更高的連翹脂素。結(jié)果從土壤中分離篩選到一株桔青霉(Penicilliumcitrinum)LB菌株，轉(zhuǎn)化連翹苷為連翹脂素的專一性較高。經(jīng)培養(yǎng)基主要組成和轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化，得出較佳的產(chǎn)酶培養(yǎng)組成為：蔗糖7 g/L，(NH4)2SO45 g/L，NaCl 5 g/L，KH2PO45 g/L，MgSO41 g/L，MnSO40.5 g/L，pH 6.0。LB菌株經(jīng)產(chǎn)酶培養(yǎng)后，過濾收集菌體懸浮于2倍發(fā)酵液體積的磷酸鹽緩沖液中，加入2 g/L的底物連翹苷，于30 ℃、200 r/min轉(zhuǎn)化20 h，連翹脂素的轉(zhuǎn)化得率可達(dá)94.1%。利用微生物將連翹苷轉(zhuǎn)化為連翹脂素，具有方法簡單、轉(zhuǎn)化得率高、產(chǎn)物容易純化和副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)，有潛在的工業(yè)化應(yīng)用價值。

連翹苷； 連翹脂素； 生物轉(zhuǎn)化； 桔青霉

中藥材連翹(Frucutusforsythiae)是木犀科(Oleaceae)連翹屬(Forsythia)植物連翹[Forsythiasuspense(Thunb) Vahl]的干燥果實(shí)，又稱黃花條、連殼和落翹等，是中國臨床常用的傳統(tǒng)中藥之一[1]。連翹具有清熱解毒、排膿化瘀、抗氧化、抗病毒等功效[2-4]。連翹的主要有效成分為連翹苷(phillyrin)和連翹酯苷A(forsythoside A)，中國藥典規(guī)定合格的連翹中，連翹苷的含量不低于0.15%，連翹酯苷A的含量不低于0.25%[1]。

連翹中另一活性成分往往被人們忽視，即連翹脂素(phillygenin)，它是連翹苷的苷元(結(jié)構(gòu)式見圖1)，由于含量比較低，藥典對其含量沒有要求。然而許多研究表明，相比于連翹苷，連翹脂素具有更好的藥理活性，如在抗腫瘤方面，連翹脂素對人胃癌細(xì)胞株SGC7901的生長有一定的抑制作用，IC50值為379 μg/mL，而連翹苷的抑制作用不明顯，在對人肝癌細(xì)胞SMMC-7721研究中，連翹脂素的抑制作用大于連翹苷[5]；在治療肝纖維化與肝損傷方面，連翹脂素對免疫性大鼠肝纖維化有較好的治療作用[6]；對乙酰氨基酚導(dǎo)致的肝損傷，對于抗腫瘤藥物順鉑導(dǎo)致的肝損傷，四氯化碳導(dǎo)致的急慢性肝損傷，D-氨基半乳糖導(dǎo)致的肝損傷，以及D-氨基半乳糖和脂多糖導(dǎo)致的肝衰竭均具有很好的治療效果，且其治療肝損傷及肝衰竭的效果顯著優(yōu)于連翹苷[7]。另外，有研究表明連翹苷的口服吸收效果較差[8]，在體內(nèi)分解成連翹脂素后發(fā)揮效用[9]?？梢钥闯?，連翹脂素具有較好的藥理活性，如將連翹苷轉(zhuǎn)化為連翹脂素，對連翹資源的深度開發(fā)具有重要意義。

圖1 微生物轉(zhuǎn)化連翹苷為連翹脂素的反應(yīng)式

目前已有酶法轉(zhuǎn)化連翹苷為連翹脂素的研究報道，但該方法的纖維素酶用量較大，是底物質(zhì)量的1～10倍，酶的成本無疑較高[10, 11]；如果采用酸水解法，存在的問題則是副產(chǎn)物較多，構(gòu)型容易轉(zhuǎn)變，生成的同分異構(gòu)體難以分離。本文研究微生物法將連翹苷轉(zhuǎn)化為連翹脂素，則具有成本低、流程簡單、轉(zhuǎn)化得率高和副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 試劑

連翹苷標(biāo)準(zhǔn)品購自阿拉丁試劑有限公司，批號為F104482，純度97%；連翹脂素標(biāo)準(zhǔn)品購自上海源葉生物技術(shù)有限公司，批號為B20726，純度97%，其他試劑均為市售分析純、色譜純或生物試劑。

1.2 培養(yǎng)基

平板培養(yǎng)基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，種子培養(yǎng)基采用馬鈴薯液體培養(yǎng)基(PDB)[12]；初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基的組成為：葡萄糖 8 g/L，蛋白胨 5 g/L，NaCl 5 g/L，KH2PO45 g/L，MgSO41 g/L，MnSO40.5 g/L，pH 7.0。所有培養(yǎng)基均經(jīng)121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.3 方法

1.3.1 菌種分離

采集花壇有機(jī)質(zhì)含量較高的土壤，用無菌水稀釋適當(dāng)倍數(shù)后涂布于PDA平板培養(yǎng)基，于28 ℃培養(yǎng)3 d，挑取形態(tài)和顏色不同的霉菌菌落轉(zhuǎn)接PDA平板，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，多次純化得到純種菌株。

1.3.2 連翹苷的生物轉(zhuǎn)化

菌種篩選時，用接種環(huán)挑取分離得到的菌株孢子直接接種100 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基，于30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，加入1 mg 連翹苷(溶于1 mL甲醇)后繼續(xù)培養(yǎng)18 h。培養(yǎng)基組成優(yōu)化時，接種霉菌孢子2環(huán)于50 mL的PDB中，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)2 d，再移取種子液5 mL接種100 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，接種后的產(chǎn)酶培養(yǎng)基于30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)2 d，加入1 mg 連翹苷(溶于1 mL甲醇)后繼續(xù)培養(yǎng)18 h。

1.3.3 連翹苷和連翹脂素的分析

轉(zhuǎn)化結(jié)束后，100 mL轉(zhuǎn)化液用同等體積的乙酸乙酯萃取2次，45 ℃下減壓蒸干后，用3 mL甲醇溶解殘留物，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾待測。

高效液相色譜法(HPLC)分析萃取樣品中連翹苷和連翹脂素的濃度。儀器為島津LC-20AD型高效液相色譜儀(日本島津儀器有限公司)，色譜柱為Phenomenex Luna C18鍵合硅膠柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)；檢測條件為：流動相為乙腈和水梯度洗脫(0 min～30 min，乙腈10%～100%，水90%～0%)。流速0.8 mL/min，柱溫25 ℃，檢測波長277 nm，進(jìn)樣量20 μL，由相同分析條件下的連翹苷和連翹脂素濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的兩者的濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 轉(zhuǎn)化菌株的分離、篩選和鑒定

2.1.1 轉(zhuǎn)化菌株的分離與篩選

從土壤中分離出12株霉菌菌株，經(jīng)產(chǎn)酶培養(yǎng)后，加入底物連翹苷，HPLC分析它們轉(zhuǎn)化生成連翹脂素濃度，不同菌株的轉(zhuǎn)化液中連翹脂素的濃度和得率見表1。從表1可以看出，多數(shù)菌株轉(zhuǎn)化能力較弱，僅有菌株LB轉(zhuǎn)化連翹苷生成的連翹脂素濃度最高，得率達(dá)到73.3%。菌株LB轉(zhuǎn)化連翹苷的樣品HPLC分析圖譜見圖2，可以看出還有部分連翹苷未被轉(zhuǎn)化，底物和產(chǎn)物的總摩爾數(shù)基本等于加入底物的摩爾數(shù)，說明連翹脂素基本未被水解，菌株LB轉(zhuǎn)化連翹苷生成連翹脂素的專一性良好。

表1 不同菌株轉(zhuǎn)化連翹苷生成連翹脂素的濃度和得率

2.1.2 轉(zhuǎn)化菌株的鑒定

LB菌株在PDA平板培養(yǎng)基上，28 ℃條件下培養(yǎng)2 d，即可長出菌落。菌落初期為白色細(xì)絨毛狀，之后表面逐漸呈灰綠色，產(chǎn)生大量綠色分生孢子，背

A—連翹苷和連翹脂素標(biāo)準(zhǔn)品；B—轉(zhuǎn)化0 h的對照；C—菌株LB轉(zhuǎn)化18 h的樣品

圖2 連翹苷生物轉(zhuǎn)化為連翹脂素的HPLC分析圖譜

面呈黃色。在顯微鏡下觀察到菌絲有橫隔，孢子梗頂端產(chǎn)生成串的青色分生孢子，分生孢子穗呈青霉屬菌種特有的帚狀。

將菌株LB交由生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行18S rDNA測序，測得序列大小為1 282 bp。將序列在GenBank上進(jìn)行BLAST比對，與超過100株青霉屬菌株有99%以上的同源性，與6株桔青霉(Penicilliumcitrinum)菌株的18S rDNA序列有100%的同源性。依據(jù)18S rDNA序列，繪制的該菌株與青霉屬不同種的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)顯示，該菌株與桔青霉親緣關(guān)系較近，與青霉屬其他種的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)，綜合菌株LB的形態(tài)特征和18S rDNA的序列分析，可以確定菌株LB為一株桔青霉，已保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號：GDMCC No: 60050。

圖3 依據(jù)18S rDNA序列同源性比較構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成及pH優(yōu)化

2.2.1 碳源種類與濃度

分別將初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的葡萄糖替換成濃度為8 g/L的蔗糖、麥芽糖、乳糖和淀粉，以選出較佳的碳源種類。結(jié)果表明碳源為蔗糖時，連翹脂素的轉(zhuǎn)化得率最高，達(dá)到了79.1%。二糖結(jié)構(gòu)的蔗糖優(yōu)于單糖結(jié)構(gòu)的葡萄糖，說明含糖苷鍵的二糖既能滿足菌體生長需要，又可誘導(dǎo)表達(dá)水解連翹苷的糖苷酶。實(shí)驗(yàn)進(jìn)而考察了蔗糖濃度對連翹脂素轉(zhuǎn)化得率的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4可以看出，當(dāng)蔗糖濃度為7 g/L時，連翹脂素的轉(zhuǎn)化得率最高，達(dá)到了81.4%。如蔗糖濃度繼續(xù)提高，連翹脂素的轉(zhuǎn)化得率反而迅速下降，但轉(zhuǎn)化體系中并未殘留未轉(zhuǎn)化的連翹苷，說明蔗糖濃度過高，雖然菌體生長更加旺盛，但是產(chǎn)生了更多的連翹脂素的水解酶，其得率反而降低。

圖4 蔗糖濃度對連翹脂素得率的影響

2.2.2 培養(yǎng)基氮源種類與濃度

初始產(chǎn)酶培養(yǎng)中的碳源改為7 g/L的蔗糖，并將其中的蛋白胨替換成濃度為5 g/L的酵母浸出粉或牛肉膏，或替換為濃度為3 g/L的(NH4)2SO4和NH4Cl，以選出較佳的氮源。結(jié)果表明氮源為(NH4)2SO4時，連翹脂素的轉(zhuǎn)化得率最高，達(dá)到了83.8%。實(shí)驗(yàn)進(jìn)而考察了(NH4)2SO4濃度對連翹脂素得率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 (NH4)2SO4的濃度對連翹脂素得率的影響

由圖5可以看出，在(NH4)2SO4濃度從2 g/L增加到5 g/L時，連翹脂素的得率隨(NH4)2SO4濃度增加而提高；(NH4)2SO4濃度繼續(xù)提高，得率則不再增加，所以較佳的(NH4)2SO4濃度為5 g/L，此時連翹脂素的轉(zhuǎn)化得率為86.5%。

2.2.3 培養(yǎng)基初始pH

考察不同培養(yǎng)基初始pH對連翹脂素得率的影響，在轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基組成為蔗糖7 g/L，(NH4)2SO45 g/L，NaCl 5 g/L，KH2PO45 g/L，MgSO41 g/L，MnSO40.5 g/L時，用濃度為2 mol/L的HCl或NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH。在底物濃度為10 mg/L時，連翹脂素的轉(zhuǎn)化得率見圖6。

由圖6可以看出，培養(yǎng)基初始pH對連翹脂素得率影響較大，偏低或偏高都不利于菌體產(chǎn)酶轉(zhuǎn)化連翹苷，適宜的pH范圍應(yīng)在5～7之間，最適pH為6。

2.3 轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

2.3.1 酶源方式

將產(chǎn)酶培養(yǎng)好的桔青霉LB發(fā)酵液分為4種酶源方式轉(zhuǎn)化連翹苷，即發(fā)酵液、濾液、菌體重懸于pH 6.0、0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液以及菌體懸液經(jīng)超聲破碎，在底物濃度均為10 mg/L的條件下，轉(zhuǎn)化連翹苷生成連翹脂素的得率見圖7。

圖6 培養(yǎng)基初始pH對連翹脂素得率的影響

圖7 不同酶源方式對連翹脂素得率的影響

由圖7可以看出，與發(fā)酵液中直接加入底物轉(zhuǎn)化相比，去除菌體的濾液作為酶源進(jìn)行轉(zhuǎn)化時，連翹脂素的得率僅為3.17%；而菌體重新懸浮于緩沖液轉(zhuǎn)化連翹苷，連翹脂素的得率與發(fā)酵液直接轉(zhuǎn)化無顯著性差異(P>0.05)，說明轉(zhuǎn)化連翹苷的糖苷酶存在于菌體中。菌體懸浮于緩沖液轉(zhuǎn)化，雖然增加了操作步驟，但不含菌體的代謝產(chǎn)物，有利于連翹脂素的分離純化。此外，菌體懸浮于緩沖液并經(jīng)超聲破碎后轉(zhuǎn)化連翹苷，連翹脂素的得率與未破碎也無顯著差異(P>0.05)，說明細(xì)胞壁和細(xì)胞膜沒有構(gòu)成轉(zhuǎn)化過程中的傳質(zhì)障礙。

2.3.2 菌體稀釋倍數(shù)

菌體培養(yǎng)結(jié)束后，發(fā)酵液經(jīng)過濾收集菌體，菌體用原發(fā)酵液體積的1～5倍體積的磷酸鹽緩沖液懸浮，在底物濃度為10 mg/L時，連翹脂素的得率見圖8。

圖8 菌體稀釋倍數(shù)對連翹脂素得率的影響

由圖8中可以看出，菌體懸浮于1～3倍發(fā)酵液體積的緩沖液中，連翹脂素的得率沒有顯著差異(P>0.05)，將菌體懸浮于大于原發(fā)酵液體積的緩沖液，無疑可以降低菌體的使用量，有利于節(jié)約菌體發(fā)酵的成本。

2.3.3 底物濃度

將發(fā)酵液過濾后，菌體用2倍發(fā)酵液體積的緩沖液懸浮，加入不同濃度的底物連翹苷，30 ℃轉(zhuǎn)化18 h，連翹脂素的得率見圖9。

圖9 連翹苷的濃度對根皮素轉(zhuǎn)化的影響

由圖9中可以看出，連翹苷的濃度增加到2 g/L，連翹脂素的得率仍然保持在90%以上，繼續(xù)增加連翹苷濃度，連翹脂素的得率則顯著下降，為了保證有較高的轉(zhuǎn)化得率，減少底物的消耗，所以適宜的底物濃度為2 g/L。

2.3.4 轉(zhuǎn)化時間

桔青霉LB的發(fā)酵液經(jīng)過濾后，菌體用2倍發(fā)酵液體積的緩沖液懸浮菌體，加入2 g/L的底物連翹苷，30 ℃條件下轉(zhuǎn)化不同時間，連翹脂素的得率見圖10。

由圖10中可以看出，隨著轉(zhuǎn)化時間的延長，連翹脂素的得率不斷增加，在20 h時達(dá)到最大值，連翹脂素的得率為94.1%，之后則有所下降，說明菌體中也存在一些分解連翹脂素的酶類，所以，在底物濃度為2 g/L時，適宜的轉(zhuǎn)化時間為20 h左右。

圖10 轉(zhuǎn)化時間對連翹脂素得率的影響

3 結(jié)論

連翹苷切去葡萄糖殘基的苷元—連翹脂素，在抗腫瘤和治療肝纖維化與肝損傷等方面有更好的藥用價值，但由于生產(chǎn)方法不成熟而未被大規(guī)模開發(fā)利用，微生物轉(zhuǎn)化法具有成本低廉，生產(chǎn)周期短，產(chǎn)物較易分離純化等優(yōu)點(diǎn)，目前已被用于多種藥物、精細(xì)化學(xué)品和香精香料的生產(chǎn)[13-15]。中藥有效成分經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化后，可以提高藥理活性、降低毒副作用或者改善藥代特性，對中藥現(xiàn)代化有重要作用。本研究從土壤中篩選出一株桔青霉能將連翹苷轉(zhuǎn)化成連翹脂素，且?guī)缀醪划a(chǎn)生水解酶。經(jīng)過培養(yǎng)基主要成分及pH和轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化后，在底物濃度為2 g/L時，菌體用2倍發(fā)酵液體積的緩沖液懸浮，30 ℃條件下轉(zhuǎn)化20 h，連翹脂素的轉(zhuǎn)化得率高達(dá)94.1%，轉(zhuǎn)化液用乙酸乙酯萃取分離，分離物中主要是連翹脂素和少量的連翹苷，幾乎不含菌體代謝物質(zhì)，連翹脂素的純度可達(dá)85%以上，進(jìn)一步純化將非常容易。研究結(jié)果對連翹和連翹苷的開發(fā)利用提供了新的方向，方法具有工藝簡單，生產(chǎn)周期短、產(chǎn)物易于純化的優(yōu)點(diǎn)，具有一定的工業(yè)利用價值。

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Production of phillygenin from phillyrin by microbial bioconversion

MEI Jian-feng, DONG Zhi-hong, YI Yu, CHEN Jian-shu, ZHANG Yan-lu, YING Guo-qing

College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China

A bioconversion process was developed for production of phillygenin from its glycosidic form—phillyrin. A strain ofPenicilliumcitrinumdesignated as LB was isolated from the soil, which could specifically produce enzyme for bioconversion of phillyrin to phillygenin. After main composition for LB strain producing enzyme and bioconversion conditions were optimized, a high molar yield of phillygenin could be obtained. The optimized medium contained sucrose 7 g/L, (NH4)2SO45 g/L, NaCl 5 g/L, KH2PO45 g/L, MgSO41 g/L, MnSO40.5 g/L, with pH 6.0. After the strain LB was cultivated in enzyme-producing medium for 2 days, the cells were harvested by filtration and suspended in pH 6.0 phosphate buffer at the volume of 2 times of the culture. 2 g/L of phillyrin was added in the cell suspension, and the bioconversion was carried out at 30 ℃, 200 r/min for 20 h. The molar yield of phillygenin could reach 94.1%. The developed process had advantages of simple operation, high productivity, convenience for product purification and less by-products, which might be a potential way for production of phillygenin in the pharmaceutical industry.

phillyrin; phillygenin; bioconversion;Penicilliumcitrinum

10.3969/j.issn.1001-6678.2016.06.002

梅建鳳(1973～)，男，博士，副教授。電話：0571-88871029，E-mail：mrion@zjut.edu.cn。