高產(chǎn)洛伐他汀棒曲霉菌株的篩選、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化

章 婷， Bedelkhan Almagul， 鄭婕施， 韓肖飛， 任 浩， 蔣冬花

浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院， 浙江 金華 321004

高產(chǎn)洛伐他汀棒曲霉菌株的篩選、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化

章 婷， Bedelkhan Almagul， 鄭婕施， 韓肖飛， 任 浩， 蔣冬花*

浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院， 浙江 金華 321004

從不同生境(食品、土壤、空氣、有機(jī)質(zhì)等)收集到的自然發(fā)酵樣品中分離得到150株曲霉屬菌株。用高效液相色譜(HPLC)法檢測(cè)發(fā)酵液中洛伐他汀(Lovastatin)含量，篩選獲得1株穩(wěn)定高產(chǎn)Lovastatin的曲霉菌株(編號(hào)：Ac-32)。根據(jù)菌落形態(tài)特征并結(jié)合18S rDNA測(cè)序，鑒定其為棒曲霉(Aspergillusclavatus)。通過搖瓶發(fā)酵單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了碳氮源種類、碳氮源含量、碳氮比(C/N)、發(fā)酵溫度、初始pH、轉(zhuǎn)速、種齡和接種量，確定了棒曲霉菌株Ac-32 搖瓶發(fā)酵產(chǎn)Lovastatin的適宜條件為：乳糖為碳源、蛋白胨為氮源、碳源含量為100 g/L、氮源含量為12 g/L、碳氮比(C/N)為15∶1.8、溫度28 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min、初始pH 5.2、種齡4 d、接種量6%。采用Minitab 17 軟件的P-B實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法，篩選對(duì)Lovastatin產(chǎn)量有顯著影響的因素為：溫度、pH、碳源含量和氮源含量。根據(jù)P-B實(shí)驗(yàn)結(jié)果，運(yùn)用響應(yīng)面法分析，確定棒曲霉菌株Ac-32產(chǎn)Lovastatin的最優(yōu)條件為：碳源含量100 g/L，氮源含量11.8 g/L，溫度28 ℃，pH 5.2。在此條件下，Lovastatin最高產(chǎn)量為236.221 μg/mL。

棒曲霉； 洛伐他??； 響應(yīng)面； 發(fā)酵條件

洛伐他汀(Lovastatin)是一種羥甲基戊二酞輔酶A還原酶的強(qiáng)效抑制劑，有強(qiáng)效的降膽固醇、降血脂作用，因在高血脂、動(dòng)脈粥樣硬化及心腦血管疾病的防治中作用機(jī)理明確、臨床療效顯著，已成為治療心血管疾病的最暢銷藥品之一[1,2]。此外，其可通過限制膽固醇和脂肪酸合成而抑制腫瘤細(xì)胞增長，還有報(bào)道稱其可用于抑郁癥的治療[3-6]。

曲霉是重要的工業(yè)微生物資源[7,8]。Lovastatin是曲霉(Aspergillus)的次級(jí)代謝產(chǎn)物[2,4]。1980年，Alberts等[9]從土曲霉(A.terreus)中提取出Lovastatin。美國Merck公司將其作為降脂藥投放市場(chǎng)，成為降血脂藥物研究進(jìn)展的里程碑[9,10]。隨后，美國、日本等國家以發(fā)酵方法開發(fā)出一系列Lovastatin藥物。相比之下，我國在利用降脂曲霉產(chǎn)Lovastatin的研發(fā)及生產(chǎn)中，普遍存在Lovastatin產(chǎn)量低、生產(chǎn)成本高等問題。因此，選育穩(wěn)定高產(chǎn)Lovastatin的曲霉菌株對(duì)并其發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化[10,11]，具有現(xiàn)實(shí)意義[12]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、試劑、及培養(yǎng)基

曲霉屬菌株：從不同生境(食品、土壤、有機(jī)質(zhì)等)收集的自然發(fā)酵樣品，經(jīng)分離篩選得到曲霉屬純菌株。

色譜級(jí)乙腈購自德國Fisher Scientific 公司，色譜級(jí)甲醇購自德國Merck公司，分析純磷酸購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

PDA培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯200、葡萄糖20、瓊脂15、水、pH 5.5。

種子培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯200、葡萄糖20、牛肉膏5、水、pH 5.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：乳糖100、蛋白胨12、MgSO4·7 H2O 1、KH2PO41、NaCl 2、水、pH 5.2。

1.2 方法

1.2.1 曲霉菌株的分離純化

從食品、土壤、有機(jī)質(zhì)等發(fā)酵樣品表面挑取少量菌絲接入PDA培養(yǎng)基平板表面，28 ℃培養(yǎng)2 d ～3 d，顯微鏡觀察具有曲霉的典型特征，挑出純化3次得性狀均一的曲霉純菌株，編號(hào)保存于25%的甘油中，放置-40 ℃冰箱中備用。

1.2.2 高產(chǎn)Lovastatin曲霉菌株的篩選

保存的曲霉屬各菌株在PDA培養(yǎng)基上28 ℃活化培養(yǎng)3 d后，取2菌餅(直徑0.8 cm)接種于種子培養(yǎng)基(裝液量50 mL/250 mL三角瓶)中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)2 d，然后按6%接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)7 d，發(fā)酵液用于檢測(cè)Lovastatin的含量[13]，從中篩選高產(chǎn)Lovastatin曲霉菌株。

1.2.3 HPLC法檢測(cè)發(fā)酵液中Lovastatin含量

取發(fā)酵液0.4 mL，加入甲醇1.6 mL，超聲20 min，50 ℃水浴2 h，3 000 r/min離心3 min，取上清液過有機(jī)膜，HPLC法檢測(cè)。色譜條件：Agilent Prep-C18 液相色譜柱，檢測(cè)波長：λ= 237 nm，柱溫28 ℃。

1.2.4 菌株鑒定

顯微鏡觀察菌絲、分生孢子頭、分生孢子梗、頂囊、分生孢子等形態(tài)特征，并拍照。提取曲霉菌株Ac-32的基因組DNA，擴(kuò)增18S rDNA基因，送上海生物工程公司測(cè)序。根據(jù)形態(tài)特征、18S rDNA基因序列，參考曲霉屬《The GenusAspergillus》分種檢索表，確定目的菌株的分類地位。

1.2.5 培養(yǎng)基配方及搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化

菌株活化、種子液和發(fā)酵液制備方法同1.2.2。采用單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基配方(碳源種類，氮源種類，碳源含量，氮源含量，碳氮比C/N)和發(fā)酵條件(溫度、初始pH、搖床轉(zhuǎn)速、接種量、種齡)進(jìn)行優(yōu)化(實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行)。

1.2.6 篩選影響Lovastatin產(chǎn)量的關(guān)鍵因素

采用Minitab 17 軟件的Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法，以溫度(X1)，pH(X2)，碳源含量(X3)，氮源含量(X4)，轉(zhuǎn)接量(X5)，轉(zhuǎn)速(X6)，種齡(X7)進(jìn)行7因子2水平的設(shè)計(jì)，以Lovastatin產(chǎn)量(Y)為響應(yīng)值，篩選影響Lovastatin產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。各因子的編碼水平和取值如表1所示。

表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.7 響應(yīng)面方法優(yōu)化培養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件

根據(jù)所篩選出的影響顯著的關(guān)鍵因素，運(yùn)用Design Expert軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面Box-Behnken實(shí)驗(yàn)，以Lovastatin產(chǎn)量為響應(yīng)值，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[14-16]，建立回歸方程并描述各因子對(duì)響應(yīng)值的影響，用響應(yīng)面圖直觀呈現(xiàn)分析結(jié)果，同時(shí)求出響應(yīng)值最大時(shí)各因子的水平[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 從不同生境中分離純化得到的曲霉菌株

從各地不同生境收集的自然發(fā)酵樣品(食品、土壤、有機(jī)質(zhì)等)中分離純化得到150株曲霉。編號(hào)后加25%甘油保藏于-40 ℃冰箱中。不同曲霉菌株的菌落、分生孢子頭、分生孢子梗、頂囊、分生孢子等形態(tài)特征各不相同，表明來源于不同生境的曲霉菌株具有豐富的多樣性(圖1)。

2.2 高產(chǎn)Lovastatin曲霉菌株的篩選

用HPLC法對(duì)150株曲霉純菌株發(fā)酵液進(jìn)行Lovastatin產(chǎn)量檢測(cè)，其中有46株曲霉菌株檢測(cè)不到Lovastatin，102株曲霉菌株Lovastatin產(chǎn)量分布在10 μg/mL ～50 μg/mL范圍，2株曲霉菌株產(chǎn)量達(dá)到70 μg/mL以上，圖2為50株代表性曲霉菌株的Lovastatin產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，表明不同曲霉菌株Lovastatin產(chǎn)量存在顯著差異。經(jīng)比較分析32號(hào)曲霉菌株的Lovastatin產(chǎn)量最高最穩(wěn)定，達(dá)75.382 μg/mL，并命名為Ac-32，后續(xù)以該菌株為實(shí)驗(yàn)的出發(fā)菌株。

2.3 曲霉菌株Ac-32的鑒定結(jié)果

2.3.1 曲霉菌株Ac-32的形態(tài)特征

曲霉菌株Ac-32 在PDA平板上培養(yǎng)5 d后，菌落呈灰藍(lán)色，邊緣白色，菌落直徑約45 mm，質(zhì)地粉粒狀，有環(huán)形溝紋(圖3A)。顯微鏡下觀察，菌絲光滑，有隔膜，直徑6 μm～8 μm分支狀；分生孢子頭呈棒形，長度達(dá)300 μm，直徑達(dá)200 μm；分生孢子梗莖長短不一，500 μm～ 1 000 μm不等，直徑30 μm～50 μm；頂囊膨大成為棍棒形，長度達(dá)250 μm，直徑50 μm～60 μm；產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)單層，瓶梗密集著生于頂囊的全部表面，(8～12) μm×(2～3) μm(圖3B、3C)；分生孢子暗藍(lán)綠色，橢圓形，表面光滑，(3～4.5) μm×(2.5～3) μm(圖3D)；未見菌核及有性階段。

圖2 50株代表性曲霉菌株的Lovastatin產(chǎn)量

2.3.2 曲霉菌株Ac-32的18S rDNA序列分析

經(jīng)上海生工公司測(cè)序，曲霉菌株Ac-32的18S rDNA序列長度為1 329 bp(圖3E，序列結(jié)果未顯示)，系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，與棒曲霉(A.clavatus)的相似度最高，達(dá)99%(圖3F)。

2.3.3 曲霉菌株Ac-32的鑒定結(jié)果

根據(jù)曲霉菌株Ac-32的形態(tài)特征，參考曲霉屬分種檢索表，鑒定為棒曲霉(A.clavatus)。

2.4 培養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件優(yōu)化

以發(fā)酵液中Lovastatin含量為指標(biāo)，經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，曲霉菌株Ac-32產(chǎn)Lovastatin的適宜條件為：以乳糖為碳源、蛋白胨為氮源、碳源含量為100 g/L、氮源含量為12 g/L、C/N為15∶1.8、溫度為28 ℃、pH為5.2、搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min、種齡為4 d、接種量為6%時(shí)，曲霉菌株Ac-32發(fā)酵產(chǎn)Lovastatin的水平最高，達(dá)144.021 μg/mL，比優(yōu)化前提高了1.91倍(圖4)。

(A) 菌落形態(tài)； (B) 分生孢子頭自然生長形態(tài)； (C) 棒狀分生孢子頭； (D) 分生孢子； (E) 18S rDNA 的PCR產(chǎn)物； (F) 系統(tǒng)發(fā)育樹圖3 曲霉菌株Ac-32的菌落形態(tài)、顯微特征、18S rDNA擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

2.5 影響曲霉菌株Ac-32發(fā)酵產(chǎn)Lovastatin的關(guān)鍵因素

采用Minitab 17 軟件的P-B實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法，以溫度(X1)、pH(X2)、碳源含量(X3)、氮源含量(X4)、接種量(X5)、轉(zhuǎn)速(X6)和種齡(X7)作為影響因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，Lovastatin產(chǎn)量(Y)為響應(yīng)值，進(jìn)行7因子2水平的Plackett-Burman設(shè)計(jì)，篩選影響曲霉菌株Ac-32發(fā)酵產(chǎn)Lovastatin的關(guān)鍵因素。

實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果如表2所示，用Minitab 17 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，建立一次回歸方程：Y = 72.317 + 5.155 X1+ 5.104 X2+ 3.583 X3+ 0.812 X4-1.389X5-1.117X6-1.283 X7。

表2 Plackett-Burman設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果

圖4 不同培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件對(duì)曲霉菌株Ac-32產(chǎn) Lovastatin的影響

表3中溫度和pH的P值均小于0.01，差異極顯著；碳源含量和氮源含量的P值分別為0.001和0.027(P<0.05)，差異顯著，確立這4個(gè)因素為影響Lovastatin合成的顯著因子。校正決定系數(shù)R-sq(adj)= 97.16%，表明Lovastatin產(chǎn)量的97.16%的變異分布在方程的七個(gè)因子中。相關(guān)系數(shù)R-sq(pred)= 90.71%，表明該方程的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值之間擬合度較好。

除以上4個(gè)顯著因素外，其他因素的變化對(duì)Lovastatin的發(fā)酵產(chǎn)量影響不大，所以實(shí)驗(yàn)采用同一結(jié)合P-B影響Lovastatin產(chǎn)量的單因素實(shí)驗(yàn)，選溫度、pH、碳源含量、氮源含量 4種顯著的關(guān)鍵因素，分別用A、B、C、D來定義，編碼水平與取值如表4所示，運(yùn)用Design Expert軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面Box-Behnken實(shí)驗(yàn)，以Lovastatin產(chǎn)量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)4因素3水平共進(jìn)行27組實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示。

表3 P-B實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)

注：R-sq=98.97%，R-sq(adj)= 97.16%，R-sq(pred)= 90.71%。

條件，即：轉(zhuǎn)接量為6%，轉(zhuǎn)速為180 r/min，種齡為4 d。

2.6 響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件

2.6.1 響應(yīng)面回歸方程建立與方差分析

由Design Expert軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面Box-Behnken以Lovastatin為響應(yīng)值進(jìn)行分析后，軟件給出的回歸方程為：Lovastatin=+234.14-7.05A+4.31B-13.41C+11.48D-3.20AB +9.19AC-8.65AD-5.40BC+5.80BD-3.96CD-21.53A2-32.51B2-11.11C2-12.30D2。

表4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因子取值表

由表6方差分析表可知：失擬不足(P=0.1975>0.05)，而模型P值<0.001，達(dá)到極顯著，說明該模型對(duì)實(shí)驗(yàn)分析具有意義。各因子的P值均小于0.05，均有顯著性。模型R-Squared=0.9609，表明該方程的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值之間擬合度較好，模型的矯正決定系數(shù)Adj R-Squared=0.9152，說明該模型可靠性高，能有效預(yù)測(cè)Lovastatin的總變異。

表5 響應(yīng)面(RSM)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目及結(jié)果

注：因子：4，基礎(chǔ)次數(shù)：27，中心點(diǎn)：3，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置三個(gè)平行組。

2.6.2 響應(yīng)面分析

由圖5可知，當(dāng)溫度在(25，27.5)區(qū)間，pH在(4.9，5.2)區(qū)間內(nèi)，Lovastatin的單位產(chǎn)量隨著兩者的升高而升高，呈現(xiàn)正相關(guān)。而當(dāng)溫度在(27.5，30)區(qū)間，pH在(5.2，5.5)區(qū)間內(nèi)，Lovastatin單位產(chǎn)量隨著兩者的升高而降低，呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。

注：**極顯著(P<0.01)；*顯著(0.01

由圖6中可知，當(dāng)溫度在(25，27.5)區(qū)間，碳源含量在(100，125)區(qū)間內(nèi)，Lovastatin的單位產(chǎn)量隨著兩者的升高而升高，呈現(xiàn)正相關(guān)。而當(dāng)溫度在(27.5，30)區(qū)間，碳源含量在(125，150)區(qū)間內(nèi)，Lovastatin單位產(chǎn)量隨著兩者的升高而降低，呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。

由圖7中可知，當(dāng)溫度在(25，27.5)區(qū)間，氮源含量在(8，10)區(qū)間內(nèi)，Lovastatin的單位產(chǎn)量隨著兩者的升高而升高，呈現(xiàn)正相關(guān)。而當(dāng)溫度在(27.5，30)區(qū)間，氮源含量在(125，150)區(qū)間內(nèi)，Lovastatin單位產(chǎn)量隨著兩者的升高而降低，呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。

由圖8中可知，當(dāng)pH在(4.9，5.5)區(qū)間，碳源含量在(100，125)區(qū)間內(nèi)，Lovastatin的單位產(chǎn)量隨著兩者的升高而升高，呈現(xiàn)正相關(guān)。而當(dāng)溫度在(5.2，5.5)區(qū)間，碳源含量在(125，150)區(qū)間內(nèi)，Lovastatin單位產(chǎn)量隨著兩者的升高而降低，呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。

由圖9中可知，當(dāng)pH在(4.9，5.5)區(qū)間，氮源含量在(8，10)區(qū)間內(nèi)，Lovastatin的單位產(chǎn)量隨著兩者的升高而升高，呈現(xiàn)正相關(guān)。而當(dāng)溫度在(5.2，5.5)區(qū)間，氮源含量在(10，12)區(qū)間內(nèi)，Lovastatin單位產(chǎn)量隨著兩者的升高而降低，呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。

由圖10中可知，當(dāng)碳源含量在(100,125)區(qū)間，氮源含量在(8，10)區(qū)間內(nèi)，Lovastatin的單位產(chǎn)量隨著兩者的升高而升高，呈現(xiàn)正相關(guān)。而當(dāng)碳源含量在(125,150)區(qū)間，氮源含量在(10，12)區(qū)間內(nèi)，Lovastatin單位產(chǎn)量隨著兩者的升高而降低，呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。

為了更清晰的了解實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化結(jié)果，利用Box-Behnken軟件根據(jù)數(shù)據(jù)分析得出的理論最優(yōu)條件為：溫度28.18 ℃，pH 5.24，碳源含量109.55 g/L，氮源含量11.78 g/L，此時(shí)達(dá)到最大值236.221 μg/mL。

2.6.3 響應(yīng)面以及等高線結(jié)果驗(yàn)證試驗(yàn)

為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的可靠性，采用上述最優(yōu)發(fā)酵條件進(jìn)行Lovastatin發(fā)酵驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，考慮到實(shí)際操作的現(xiàn)實(shí)性，將最佳條件修正為溫度28 ℃，pH 5.2，碳源含量100 g/L，氮源含量11.8 g/L，3次平行實(shí)驗(yàn)的Lovastatin產(chǎn)量分別為210.645 μg/mL，233.813 μg/mL，229.421 μg/mL，Lovastatin平均產(chǎn)量為224.626 μg/mL，實(shí)際平均值與預(yù)測(cè)值無顯著差別，證明此次實(shí)驗(yàn)參數(shù)可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

3 討論

從不同生境(食品、土壤、空氣、有機(jī)質(zhì)等)的自然發(fā)酵樣品中分離篩選到1株高產(chǎn)Lovastatin曲霉菌株Ac-32，經(jīng)培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件優(yōu)化，發(fā)酵液中Lovastatin產(chǎn)量可達(dá)224.626 μg/mL。目前國內(nèi)外生產(chǎn)Lovastatin大多用紅曲霉和土曲霉，本文篩選到的菌株經(jīng)鑒定為棒曲霉，豐富了生產(chǎn)Lovastatin的菌種資源。

Plackett-Burman法確定對(duì)棒曲霉液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Lovastatin影響顯著的四個(gè)因素分別是溫度，pH，碳源含量和氮源含量。響應(yīng)面Box-Behnken法優(yōu)化后的條件為：溫度28 ℃，pH 5.2，碳源含量100 g/L，氮源含量11.8 g/L，轉(zhuǎn)接量為6 %，轉(zhuǎn)速180 r/min，種齡為4 d。優(yōu)化后的Lovastatin產(chǎn)量比優(yōu)化前提高了2.98倍。

魏巍[17]確定了紅曲霉發(fā)酵合成Lovastatin的最優(yōu)培養(yǎng)基配方和發(fā)酵工藝，Lovastatin產(chǎn)量為142.51 μg/mL。劉愛英[18]等用紫外誘變方式處理紅曲霉，誘變后菌株搖瓶發(fā)酵產(chǎn)Lovastatin水平為219.9 μg/mL。童振宇[19]等對(duì)紫色紅曲霉液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，使Lovastatin產(chǎn)量達(dá)到297.4 μg/mL，而利用棒曲霉發(fā)酵產(chǎn)Lovastatin尚未見報(bào)道，試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，選用的棒曲霉菌株具有良好的應(yīng)用前景。

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Screening and identification of Aspergillus clavatus strain with high-yielding lovastatin and its optimization of fermentation conditions

ZHANG Ting, Bedelkhan Almagul, ZHENG Jie-shi, HAN Xiao-fei, REN-Hao, JIANG Dong-hua

College of Chemistry and Life Science, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004, China

150Aspergillusstrains were selected from different natural fermentation samples of food, soil, air and so on, and their products of lovastatin were measured by high performance liquid chromatography (HPLC) method. Among them, theAspergillusstrain Ac-32 producing higher-level lovastatin was screened. Based on 18S rDNA sequence and morphology characteristics, the strain Ac-32 was identified asAspergillusclavatus. Through analyzing the influence of C source, N source, C content, N content, C/N, temperature, initial pH and so on, the results indicated that optimal fermentation conditions were as follows: C source lactose, N source peptone, C content 100 g/L, N content 12 g/L, C/N 15∶1.8, temperature 28 ℃, shaking speed 180 r/min, initial pH 5.2, inoculating age 4 d and inoculum size 6%. Using Plackett-Burman (P-B) in Minitab 17, 4 significant effects (C content, N content, temperature and pH) on lovastatin yields were screened out. According to the P-B experiment results and analysis of response surface methodology in Design Expert, the optimum conditions were as follows: C content 100 g/L, N content 11.8 g/L, temperature 28 ℃, pH 5.2. Under the optimized conditions, the maximum lovastatin yield was 236.221 μg/mL.

Aspergillusclavatus; Lovastatin; response surface methodology; fermentation conditions

10.3969/j.issn.1001-6678.2016.06.005

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(NO.31270061;NO.31570013)。

章 婷(1991～),女,碩士研究生。研究方向:應(yīng)用微生物。E-mail:704486377@qq.com。

*通信作者: 蔣冬花(1964～)，女，教授。Tel:13566997832,E-mail:jdh@zjnu.cn。