• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    高產(chǎn)洛伐他汀棒曲霉菌株的篩選、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化

    2017-01-09 09:36:37BedelkhanAlmagul鄭婕施韓肖飛蔣冬花
    工業(yè)微生物 2016年6期
    關(guān)鍵詞:曲霉菌氮源碳源

    章 婷, Bedelkhan Almagul, 鄭婕施, 韓肖飛, 任 浩, 蔣冬花

    浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院, 浙江 金華 321004

    高產(chǎn)洛伐他汀棒曲霉菌株的篩選、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化

    章 婷, Bedelkhan Almagul, 鄭婕施, 韓肖飛, 任 浩, 蔣冬花*

    浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院, 浙江 金華 321004

    從不同生境(食品、土壤、空氣、有機(jī)質(zhì)等)收集到的自然發(fā)酵樣品中分離得到150株曲霉屬菌株。用高效液相色譜(HPLC)法檢測(cè)發(fā)酵液中洛伐他汀(Lovastatin)含量,篩選獲得1株穩(wěn)定高產(chǎn)Lovastatin的曲霉菌株(編號(hào):Ac-32)。根據(jù)菌落形態(tài)特征并結(jié)合18S rDNA測(cè)序,鑒定其為棒曲霉(Aspergillusclavatus)。通過搖瓶發(fā)酵單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了碳氮源種類、碳氮源含量、碳氮比(C/N)、發(fā)酵溫度、初始pH、轉(zhuǎn)速、種齡和接種量,確定了棒曲霉菌株Ac-32 搖瓶發(fā)酵產(chǎn)Lovastatin的適宜條件為:乳糖為碳源、蛋白胨為氮源、碳源含量為100 g/L、氮源含量為12 g/L、碳氮比(C/N)為15∶1.8、溫度28 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min、初始pH 5.2、種齡4 d、接種量6%。采用Minitab 17 軟件的P-B實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法,篩選對(duì)Lovastatin產(chǎn)量有顯著影響的因素為:溫度、pH、碳源含量和氮源含量。根據(jù)P-B實(shí)驗(yàn)結(jié)果,運(yùn)用響應(yīng)面法分析,確定棒曲霉菌株Ac-32產(chǎn)Lovastatin的最優(yōu)條件為:碳源含量100 g/L,氮源含量11.8 g/L,溫度28 ℃,pH 5.2。在此條件下,Lovastatin最高產(chǎn)量為236.221 μg/mL。

    棒曲霉; 洛伐他??; 響應(yīng)面; 發(fā)酵條件

    洛伐他汀(Lovastatin)是一種羥甲基戊二酞輔酶A還原酶的強(qiáng)效抑制劑,有強(qiáng)效的降膽固醇、降血脂作用,因在高血脂、動(dòng)脈粥樣硬化及心腦血管疾病的防治中作用機(jī)理明確、臨床療效顯著,已成為治療心血管疾病的最暢銷藥品之一[1,2]。此外,其可通過限制膽固醇和脂肪酸合成而抑制腫瘤細(xì)胞增長,還有報(bào)道稱其可用于抑郁癥的治療[3-6]。

    曲霉是重要的工業(yè)微生物資源[7,8]。Lovastatin是曲霉(Aspergillus)的次級(jí)代謝產(chǎn)物[2,4]。1980年,Alberts等[9]從土曲霉(A.terreus)中提取出Lovastatin。美國Merck公司將其作為降脂藥投放市場(chǎng),成為降血脂藥物研究進(jìn)展的里程碑[9,10]。隨后,美國、日本等國家以發(fā)酵方法開發(fā)出一系列Lovastatin藥物。相比之下,我國在利用降脂曲霉產(chǎn)Lovastatin的研發(fā)及生產(chǎn)中,普遍存在Lovastatin產(chǎn)量低、生產(chǎn)成本高等問題。因此,選育穩(wěn)定高產(chǎn)Lovastatin的曲霉菌株對(duì)并其發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化[10,11],具有現(xiàn)實(shí)意義[12]。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株、試劑、及培養(yǎng)基

    曲霉屬菌株:從不同生境(食品、土壤、有機(jī)質(zhì)等)收集的自然發(fā)酵樣品,經(jīng)分離篩選得到曲霉屬純菌株。

    色譜級(jí)乙腈購自德國Fisher Scientific 公司,色譜級(jí)甲醇購自德國Merck公司,分析純磷酸購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

    PDA培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯200、葡萄糖20、瓊脂15、水、pH 5.5。

    種子培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯200、葡萄糖20、牛肉膏5、水、pH 5.2。

    發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):乳糖100、蛋白胨12、MgSO4·7 H2O 1、KH2PO41、NaCl 2、水、pH 5.2。

    1.2 方法

    1.2.1 曲霉菌株的分離純化

    從食品、土壤、有機(jī)質(zhì)等發(fā)酵樣品表面挑取少量菌絲接入PDA培養(yǎng)基平板表面,28 ℃培養(yǎng)2 d ~3 d,顯微鏡觀察具有曲霉的典型特征,挑出純化3次得性狀均一的曲霉純菌株,編號(hào)保存于25%的甘油中,放置-40 ℃冰箱中備用。

    1.2.2 高產(chǎn)Lovastatin曲霉菌株的篩選

    保存的曲霉屬各菌株在PDA培養(yǎng)基上28 ℃活化培養(yǎng)3 d后,取2菌餅(直徑0.8 cm)接種于種子培養(yǎng)基(裝液量50 mL/250 mL三角瓶)中,28 ℃、180 r/min培養(yǎng)2 d,然后按6%接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中,28 ℃、180 r/min培養(yǎng)7 d,發(fā)酵液用于檢測(cè)Lovastatin的含量[13],從中篩選高產(chǎn)Lovastatin曲霉菌株。

    1.2.3 HPLC法檢測(cè)發(fā)酵液中Lovastatin含量

    取發(fā)酵液0.4 mL,加入甲醇1.6 mL,超聲20 min,50 ℃水浴2 h,3 000 r/min離心3 min,取上清液過有機(jī)膜,HPLC法檢測(cè)。色譜條件:Agilent Prep-C18 液相色譜柱,檢測(cè)波長:λ= 237 nm,柱溫28 ℃。

    1.2.4 菌株鑒定

    顯微鏡觀察菌絲、分生孢子頭、分生孢子梗、頂囊、分生孢子等形態(tài)特征,并拍照。提取曲霉菌株Ac-32的基因組DNA,擴(kuò)增18S rDNA基因,送上海生物工程公司測(cè)序。根據(jù)形態(tài)特征、18S rDNA基因序列,參考曲霉屬《The GenusAspergillus》分種檢索表,確定目的菌株的分類地位。

    1.2.5 培養(yǎng)基配方及搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化

    菌株活化、種子液和發(fā)酵液制備方法同1.2.2。采用單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基配方(碳源種類,氮源種類,碳源含量,氮源含量,碳氮比C/N)和發(fā)酵條件(溫度、初始pH、搖床轉(zhuǎn)速、接種量、種齡)進(jìn)行優(yōu)化(實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行)。

    1.2.6 篩選影響Lovastatin產(chǎn)量的關(guān)鍵因素

    采用Minitab 17 軟件的Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法,以溫度(X1),pH(X2),碳源含量(X3),氮源含量(X4),轉(zhuǎn)接量(X5),轉(zhuǎn)速(X6),種齡(X7)進(jìn)行7因子2水平的設(shè)計(jì),以Lovastatin產(chǎn)量(Y)為響應(yīng)值,篩選影響Lovastatin產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。各因子的編碼水平和取值如表1所示。

    表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

    1.2.7 響應(yīng)面方法優(yōu)化培養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件

    根據(jù)所篩選出的影響顯著的關(guān)鍵因素,運(yùn)用Design Expert軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面Box-Behnken實(shí)驗(yàn),以Lovastatin產(chǎn)量為響應(yīng)值,對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[14-16],建立回歸方程并描述各因子對(duì)響應(yīng)值的影響,用響應(yīng)面圖直觀呈現(xiàn)分析結(jié)果,同時(shí)求出響應(yīng)值最大時(shí)各因子的水平[16]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 從不同生境中分離純化得到的曲霉菌株

    從各地不同生境收集的自然發(fā)酵樣品(食品、土壤、有機(jī)質(zhì)等)中分離純化得到150株曲霉。編號(hào)后加25%甘油保藏于-40 ℃冰箱中。不同曲霉菌株的菌落、分生孢子頭、分生孢子梗、頂囊、分生孢子等形態(tài)特征各不相同,表明來源于不同生境的曲霉菌株具有豐富的多樣性(圖1)。

    2.2 高產(chǎn)Lovastatin曲霉菌株的篩選

    用HPLC法對(duì)150株曲霉純菌株發(fā)酵液進(jìn)行Lovastatin產(chǎn)量檢測(cè),其中有46株曲霉菌株檢測(cè)不到Lovastatin,102株曲霉菌株Lovastatin產(chǎn)量分布在10 μg/mL ~50 μg/mL范圍,2株曲霉菌株產(chǎn)量達(dá)到70 μg/mL以上,圖2為50株代表性曲霉菌株的Lovastatin產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果,表明不同曲霉菌株Lovastatin產(chǎn)量存在顯著差異。經(jīng)比較分析32號(hào)曲霉菌株的Lovastatin產(chǎn)量最高最穩(wěn)定,達(dá)75.382 μg/mL,并命名為Ac-32,后續(xù)以該菌株為實(shí)驗(yàn)的出發(fā)菌株。

    2.3 曲霉菌株Ac-32的鑒定結(jié)果

    2.3.1 曲霉菌株Ac-32的形態(tài)特征

    曲霉菌株Ac-32 在PDA平板上培養(yǎng)5 d后,菌落呈灰藍(lán)色,邊緣白色,菌落直徑約45 mm,質(zhì)地粉粒狀,有環(huán)形溝紋(圖3A)。顯微鏡下觀察,菌絲光滑,有隔膜,直徑6 μm~8 μm分支狀;分生孢子頭呈棒形,長度達(dá)300 μm,直徑達(dá)200 μm;分生孢子梗莖長短不一,500 μm~ 1 000 μm不等,直徑30 μm~50 μm;頂囊膨大成為棍棒形,長度達(dá)250 μm,直徑50 μm~60 μm;產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)單層,瓶梗密集著生于頂囊的全部表面,(8~12) μm×(2~3) μm(圖3B、3C);分生孢子暗藍(lán)綠色,橢圓形,表面光滑,(3~4.5) μm×(2.5~3) μm(圖3D);未見菌核及有性階段。

    圖2 50株代表性曲霉菌株的Lovastatin產(chǎn)量

    2.3.2 曲霉菌株Ac-32的18S rDNA序列分析

    經(jīng)上海生工公司測(cè)序,曲霉菌株Ac-32的18S rDNA序列長度為1 329 bp(圖3E,序列結(jié)果未顯示),系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明,與棒曲霉(A.clavatus)的相似度最高,達(dá)99%(圖3F)。

    2.3.3 曲霉菌株Ac-32的鑒定結(jié)果

    根據(jù)曲霉菌株Ac-32的形態(tài)特征,參考曲霉屬分種檢索表,鑒定為棒曲霉(A.clavatus)。

    2.4 培養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件優(yōu)化

    以發(fā)酵液中Lovastatin含量為指標(biāo),經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化,曲霉菌株Ac-32產(chǎn)Lovastatin的適宜條件為:以乳糖為碳源、蛋白胨為氮源、碳源含量為100 g/L、氮源含量為12 g/L、C/N為15∶1.8、溫度為28 ℃、pH為5.2、搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min、種齡為4 d、接種量為6%時(shí),曲霉菌株Ac-32發(fā)酵產(chǎn)Lovastatin的水平最高,達(dá)144.021 μg/mL,比優(yōu)化前提高了1.91倍(圖4)。

    (A) 菌落形態(tài); (B) 分生孢子頭自然生長形態(tài); (C) 棒狀分生孢子頭; (D) 分生孢子; (E) 18S rDNA 的PCR產(chǎn)物; (F) 系統(tǒng)發(fā)育樹圖3 曲霉菌株Ac-32的菌落形態(tài)、顯微特征、18S rDNA擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

    2.5 影響曲霉菌株Ac-32發(fā)酵產(chǎn)Lovastatin的關(guān)鍵因素

    采用Minitab 17 軟件的P-B實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法,以溫度(X1)、pH(X2)、碳源含量(X3)、氮源含量(X4)、接種量(X5)、轉(zhuǎn)速(X6)和種齡(X7)作為影響因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),Lovastatin產(chǎn)量(Y)為響應(yīng)值,進(jìn)行7因子2水平的Plackett-Burman設(shè)計(jì),篩選影響曲霉菌株Ac-32發(fā)酵產(chǎn)Lovastatin的關(guān)鍵因素。

    實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果如表2所示,用Minitab 17 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,建立一次回歸方程:Y = 72.317 + 5.155 X1+ 5.104 X2+ 3.583 X3+ 0.812 X4-1.389X5-1.117X6-1.283 X7。

    表2 Plackett-Burman設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果

    圖4 不同培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件對(duì)曲霉菌株Ac-32產(chǎn) Lovastatin的影響

    表3中溫度和pH的P值均小于0.01,差異極顯著;碳源含量和氮源含量的P值分別為0.001和0.027(P<0.05),差異顯著,確立這4個(gè)因素為影響Lovastatin合成的顯著因子。校正決定系數(shù)R-sq(adj)= 97.16%,表明Lovastatin產(chǎn)量的97.16%的變異分布在方程的七個(gè)因子中。相關(guān)系數(shù)R-sq(pred)= 90.71%,表明該方程的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值之間擬合度較好。

    除以上4個(gè)顯著因素外,其他因素的變化對(duì)Lovastatin的發(fā)酵產(chǎn)量影響不大,所以實(shí)驗(yàn)采用同一結(jié)合P-B影響Lovastatin產(chǎn)量的單因素實(shí)驗(yàn),選溫度、pH、碳源含量、氮源含量 4種顯著的關(guān)鍵因素,分別用A、B、C、D來定義,編碼水平與取值如表4所示,運(yùn)用Design Expert軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面Box-Behnken實(shí)驗(yàn),以Lovastatin產(chǎn)量為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)4因素3水平共進(jìn)行27組實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示。

    表3 P-B實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)

    注:R-sq=98.97%,R-sq(adj)= 97.16%,R-sq(pred)= 90.71%。

    條件,即:轉(zhuǎn)接量為6%,轉(zhuǎn)速為180 r/min,種齡為4 d。

    2.6 響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件

    2.6.1 響應(yīng)面回歸方程建立與方差分析

    由Design Expert軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面Box-Behnken以Lovastatin為響應(yīng)值進(jìn)行分析后,軟件給出的回歸方程為:Lovastatin=+234.14-7.05A+4.31B-13.41C+11.48D-3.20AB +9.19AC-8.65AD-5.40BC+5.80BD-3.96CD-21.53A2-32.51B2-11.11C2-12.30D2。

    表4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因子取值表

    由表6方差分析表可知:失擬不足(P=0.1975>0.05),而模型P值<0.001,達(dá)到極顯著,說明該模型對(duì)實(shí)驗(yàn)分析具有意義。各因子的P值均小于0.05,均有顯著性。模型R-Squared=0.9609,表明該方程的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值之間擬合度較好,模型的矯正決定系數(shù)Adj R-Squared=0.9152,說明該模型可靠性高,能有效預(yù)測(cè)Lovastatin的總變異。

    表5 響應(yīng)面(RSM)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目及結(jié)果

    注:因子:4,基礎(chǔ)次數(shù):27,中心點(diǎn):3,每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置三個(gè)平行組。

    2.6.2 響應(yīng)面分析

    由圖5可知,當(dāng)溫度在(25,27.5)區(qū)間,pH在(4.9,5.2)區(qū)間內(nèi),Lovastatin的單位產(chǎn)量隨著兩者的升高而升高,呈現(xiàn)正相關(guān)。而當(dāng)溫度在(27.5,30)區(qū)間,pH在(5.2,5.5)區(qū)間內(nèi),Lovastatin單位產(chǎn)量隨著兩者的升高而降低,呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。

    注:**極顯著(P<0.01);*顯著(0.01

    由圖6中可知,當(dāng)溫度在(25,27.5)區(qū)間,碳源含量在(100,125)區(qū)間內(nèi),Lovastatin的單位產(chǎn)量隨著兩者的升高而升高,呈現(xiàn)正相關(guān)。而當(dāng)溫度在(27.5,30)區(qū)間,碳源含量在(125,150)區(qū)間內(nèi),Lovastatin單位產(chǎn)量隨著兩者的升高而降低,呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。

    由圖7中可知,當(dāng)溫度在(25,27.5)區(qū)間,氮源含量在(8,10)區(qū)間內(nèi),Lovastatin的單位產(chǎn)量隨著兩者的升高而升高,呈現(xiàn)正相關(guān)。而當(dāng)溫度在(27.5,30)區(qū)間,氮源含量在(125,150)區(qū)間內(nèi),Lovastatin單位產(chǎn)量隨著兩者的升高而降低,呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。

    由圖8中可知,當(dāng)pH在(4.9,5.5)區(qū)間,碳源含量在(100,125)區(qū)間內(nèi),Lovastatin的單位產(chǎn)量隨著兩者的升高而升高,呈現(xiàn)正相關(guān)。而當(dāng)溫度在(5.2,5.5)區(qū)間,碳源含量在(125,150)區(qū)間內(nèi),Lovastatin單位產(chǎn)量隨著兩者的升高而降低,呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。

    由圖9中可知,當(dāng)pH在(4.9,5.5)區(qū)間,氮源含量在(8,10)區(qū)間內(nèi),Lovastatin的單位產(chǎn)量隨著兩者的升高而升高,呈現(xiàn)正相關(guān)。而當(dāng)溫度在(5.2,5.5)區(qū)間,氮源含量在(10,12)區(qū)間內(nèi),Lovastatin單位產(chǎn)量隨著兩者的升高而降低,呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。

    由圖10中可知,當(dāng)碳源含量在(100,125)區(qū)間,氮源含量在(8,10)區(qū)間內(nèi),Lovastatin的單位產(chǎn)量隨著兩者的升高而升高,呈現(xiàn)正相關(guān)。而當(dāng)碳源含量在(125,150)區(qū)間,氮源含量在(10,12)區(qū)間內(nèi),Lovastatin單位產(chǎn)量隨著兩者的升高而降低,呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。

    為了更清晰的了解實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化結(jié)果,利用Box-Behnken軟件根據(jù)數(shù)據(jù)分析得出的理論最優(yōu)條件為:溫度28.18 ℃,pH 5.24,碳源含量109.55 g/L,氮源含量11.78 g/L,此時(shí)達(dá)到最大值236.221 μg/mL。

    2.6.3 響應(yīng)面以及等高線結(jié)果驗(yàn)證試驗(yàn)

    為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的可靠性,采用上述最優(yōu)發(fā)酵條件進(jìn)行Lovastatin發(fā)酵驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),考慮到實(shí)際操作的現(xiàn)實(shí)性,將最佳條件修正為溫度28 ℃,pH 5.2,碳源含量100 g/L,氮源含量11.8 g/L,3次平行實(shí)驗(yàn)的Lovastatin產(chǎn)量分別為210.645 μg/mL,233.813 μg/mL,229.421 μg/mL,Lovastatin平均產(chǎn)量為224.626 μg/mL,實(shí)際平均值與預(yù)測(cè)值無顯著差別,證明此次實(shí)驗(yàn)參數(shù)可靠,具有實(shí)用價(jià)值。

    3 討論

    從不同生境(食品、土壤、空氣、有機(jī)質(zhì)等)的自然發(fā)酵樣品中分離篩選到1株高產(chǎn)Lovastatin曲霉菌株Ac-32,經(jīng)培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件優(yōu)化,發(fā)酵液中Lovastatin產(chǎn)量可達(dá)224.626 μg/mL。目前國內(nèi)外生產(chǎn)Lovastatin大多用紅曲霉和土曲霉,本文篩選到的菌株經(jīng)鑒定為棒曲霉,豐富了生產(chǎn)Lovastatin的菌種資源。

    Plackett-Burman法確定對(duì)棒曲霉液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Lovastatin影響顯著的四個(gè)因素分別是溫度,pH,碳源含量和氮源含量。響應(yīng)面Box-Behnken法優(yōu)化后的條件為:溫度28 ℃,pH 5.2,碳源含量100 g/L,氮源含量11.8 g/L,轉(zhuǎn)接量為6 %,轉(zhuǎn)速180 r/min,種齡為4 d。優(yōu)化后的Lovastatin產(chǎn)量比優(yōu)化前提高了2.98倍。

    魏巍[17]確定了紅曲霉發(fā)酵合成Lovastatin的最優(yōu)培養(yǎng)基配方和發(fā)酵工藝,Lovastatin產(chǎn)量為142.51 μg/mL。劉愛英[18]等用紫外誘變方式處理紅曲霉,誘變后菌株搖瓶發(fā)酵產(chǎn)Lovastatin水平為219.9 μg/mL。童振宇[19]等對(duì)紫色紅曲霉液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化,使Lovastatin產(chǎn)量達(dá)到297.4 μg/mL,而利用棒曲霉發(fā)酵產(chǎn)Lovastatin尚未見報(bào)道,試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,選用的棒曲霉菌株具有良好的應(yīng)用前景。

    [1] Satoshi K. Lovastatin rescues human and mice cartilage disorders [J]. Journal of Cell Communication and Signaling, 2015, 9 (1): 95-98.

    [2] Guo CJ, Wang CCC. Recent advances in genome mining of secondary metabolites inAspergillusterreus[J]. Frontiers in Microbiology, 2014, 5(1): 1-13.

    [3] Guo CJ, Sun WW, Bruno KS,etal. Molecular genetic characterization of terreic acid pathway inAspergillusterreus[J]. Organic Letters, 2014, 16: 5250-5253.

    [4] Boruta T, and Bizukojc M. Culture-based and sequence-based insights into biosynthesis of secondary metabolites byAspergillusterreus ATCC 20542 [J]. Journal of Biotechnology, 2014, 175: 53-62.

    [5] Salagre E, Fernandes BS, Dodd S,etal. Statins for the treatment of depression: A meta-analysis of randomized, double-blind, placebo-controlled trials [J]. Journal of Affective Disorders, 2016, 200: 235-242.

    [6] Notarnicola M, Barone M, Francavilla A,etal. Lovastatin, but not orlistat, reduces intestinal polyp volume in an ApcMin/+ mouse model [J]. Oncology Reports, 2016, 36 (2): 893-900.

    [7] Robles JE, Suarez IR, Diaz JE,etal. Secondary metabolites isolated from the strainAspergillusterreus[J]. Chemistry of Natural Compounds, 2014, 50 (6): 1101-1102.

    [8] Krull R, Bley T, Filaments in bioprocesses preface [C]. Advances in Biochemical Engineering Biotechnology, 2015, 149: 5-7.

    [9] Alberts AW, Chen J, Kuron G,etal. Mevinolin, a highly potent competitive inhibitor of hydroxymethyl -glutaryl-coenzyme a reductase and cholesterol-lowering agent [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1980, 77(7): 3957-3961.

    [10] Huang XN, Lu XF, Li YM,etal. Improving itaconic acid production through genetic engineering of an industrialAspergillusterreusstrain [J]. Microbial Cell Factories, 2014, 13: 1-9.

    [11] Ahmed A, Mukhtar H, Gohar UF,etal. Production of Lovastatin fromAspergillusterreusthrough submerged fermentation [J]. Pakistan Journal of Botany, 2013, 45(5): 1795-1800.

    [12] 黃卓, 李東棟. 洛伐他汀最新研究進(jìn)展[J]. 中國生化藥物雜志, 2010(2): 144-147.

    [13] Abd Rahim MH, Hasan H, Montoya A,etal. Lovastatin and (+)-geodin production byAspergillusterreusfrom crude glycerol [J]. Engineering in Life Sciences, 2015, 15(2): 220-228.

    [14] El-Naggar NE, Haroun SA, Owis EA,etal. Optimization of beta-glucosidase production byAspergillusterreusstrain EMoo 6-4 using response surface methodology under solid-state fermentation [J]. Preparative Biochemistry and Biotechnology, 2015, 45(6): 568-587.

    [15] 鄭虹. 紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)洛伐他汀的響應(yīng)面優(yōu)化 [J]. 中國釀造, 2014, 33(10): 76-80.

    [16] Tepe O, Dursun AY. Exo-pectinase production byBacilluspumilususing different agricultural wastes and optimizing of medium components using response surface methodology [J]. Environmental Science and Pollution Research, 2014, 21(16): 9911-9920.

    [17] 魏巍. 紅曲霉發(fā)酵合成洛伐他汀的研究 [D]. 華中科技大學(xué), 2013.

    [18] 劉愛英, 孫嘉龍, 鄒曉等. 提高紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)品Monacolin K含量的研究 [J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007(6): 5-7.

    [19] 童振宇, 周立平, 陳旭峰. 響應(yīng)面法優(yōu)化紅曲霉菌株MonascuspurpureusWX液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Monacolin K工藝條件 [J]. 2007(1): 35-40.

    Screening and identification of Aspergillus clavatus strain with high-yielding lovastatin and its optimization of fermentation conditions

    ZHANG Ting, Bedelkhan Almagul, ZHENG Jie-shi, HAN Xiao-fei, REN-Hao, JIANG Dong-hua

    College of Chemistry and Life Science, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004, China

    150Aspergillusstrains were selected from different natural fermentation samples of food, soil, air and so on, and their products of lovastatin were measured by high performance liquid chromatography (HPLC) method. Among them, theAspergillusstrain Ac-32 producing higher-level lovastatin was screened. Based on 18S rDNA sequence and morphology characteristics, the strain Ac-32 was identified asAspergillusclavatus. Through analyzing the influence of C source, N source, C content, N content, C/N, temperature, initial pH and so on, the results indicated that optimal fermentation conditions were as follows: C source lactose, N source peptone, C content 100 g/L, N content 12 g/L, C/N 15∶1.8, temperature 28 ℃, shaking speed 180 r/min, initial pH 5.2, inoculating age 4 d and inoculum size 6%. Using Plackett-Burman (P-B) in Minitab 17, 4 significant effects (C content, N content, temperature and pH) on lovastatin yields were screened out. According to the P-B experiment results and analysis of response surface methodology in Design Expert, the optimum conditions were as follows: C content 100 g/L, N content 11.8 g/L, temperature 28 ℃, pH 5.2. Under the optimized conditions, the maximum lovastatin yield was 236.221 μg/mL.

    Aspergillusclavatus; Lovastatin; response surface methodology; fermentation conditions

    10.3969/j.issn.1001-6678.2016.06.005

    國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(NO.31270061;NO.31570013)。

    章 婷(1991~),女,碩士研究生。研究方向:應(yīng)用微生物。E-mail:704486377@qq.com。

    *通信作者: 蔣冬花(1964~),女,教授。Tel:13566997832,E-mail:jdh@zjnu.cn。

    猜你喜歡
    曲霉菌氮源碳源
    緩釋碳源促進(jìn)生物反硝化脫氮技術(shù)研究進(jìn)展
    雞曲霉菌病的發(fā)病特點(diǎn)、臨床癥狀、鑒別與防治
    不同碳源對(duì)銅溜槽用鋁碳質(zhì)涂抹料性能的影響
    昆鋼科技(2021年6期)2021-03-09 06:10:20
    肺曲霉菌合并肺放線菌感染一例
    佩特曲霉菌次生代謝產(chǎn)物的研究
    中成藥(2017年7期)2017-11-22 07:33:13
    無機(jī)氮源對(duì)紅曲霉調(diào)控初探
    中國釀造(2016年12期)2016-03-01 03:08:11
    四甘醇作碳源合成Li3V2(PO4)3正極材料及其電化學(xué)性能
    中藥渣生產(chǎn)蛋白飼料的氮源優(yōu)化研究
    中國釀造(2014年9期)2014-03-11 20:21:03
    響應(yīng)面分析法和氮源改進(jìn)優(yōu)化L-賴氨酸發(fā)酵工藝
    外加碳源對(duì)污水廠異常進(jìn)水時(shí)的強(qiáng)化脫氮效果分析
    河南科技(2014年16期)2014-02-27 14:13:33
    韩国av在线不卡| 国模一区二区三区四区视频| .国产精品久久| 九九爱精品视频在线观看| 美女大奶头黄色视频| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产免费一区二区三区四区乱码| 亚洲怡红院男人天堂| 精品酒店卫生间| 久久久国产欧美日韩av| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 少妇丰满av| 女性生殖器流出的白浆| 三级国产精品片| 丰满人妻一区二区三区视频av| 交换朋友夫妻互换小说| 在线观看免费视频网站a站| 99热6这里只有精品| 久久影院123| 亚洲精品aⅴ在线观看| 夜夜爽夜夜爽视频| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲情色 制服丝袜| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 久久久久久久亚洲中文字幕| 少妇人妻精品综合一区二区| 久久97久久精品| 久久久久久伊人网av| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 亚洲av二区三区四区| 国产高清三级在线| 少妇 在线观看| 在线观看免费高清a一片| 午夜激情久久久久久久| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 91精品一卡2卡3卡4卡| 丝瓜视频免费看黄片| 下体分泌物呈黄色| 高清不卡的av网站| 2018国产大陆天天弄谢| 五月伊人婷婷丁香| 亚洲精品aⅴ在线观看| 99re6热这里在线精品视频| 日韩视频在线欧美| av线在线观看网站| 国产日韩欧美视频二区| 人妻人人澡人人爽人人| 午夜免费鲁丝| 亚洲内射少妇av| 久久人人爽人人爽人人片va| 国产精品福利在线免费观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 中国美白少妇内射xxxbb| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 久久久久国产精品人妻一区二区| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 各种免费的搞黄视频| 哪个播放器可以免费观看大片| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 丰满少妇做爰视频| a级毛片免费高清观看在线播放| 精品一区二区免费观看| 亚洲av国产av综合av卡| 欧美激情国产日韩精品一区| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 老司机影院成人| 国产黄片视频在线免费观看| 亚州av有码| 美女主播在线视频| 亚洲精品aⅴ在线观看| 老司机影院毛片| 久久毛片免费看一区二区三区| 赤兔流量卡办理| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产亚洲一区二区精品| 最近手机中文字幕大全| 天美传媒精品一区二区| 五月玫瑰六月丁香| 少妇人妻一区二区三区视频| 人体艺术视频欧美日本| av视频免费观看在线观看| 三上悠亚av全集在线观看 | 免费少妇av软件| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 极品人妻少妇av视频| 黄色欧美视频在线观看| 三级国产精品片| 一本一本综合久久| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产精品三级大全| 亚洲av成人精品一二三区| 高清午夜精品一区二区三区| 午夜福利,免费看| 日日啪夜夜爽| 久久人人爽人人片av| 午夜老司机福利剧场| 成人特级av手机在线观看| 日本wwww免费看| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 色94色欧美一区二区| 久久久久久久亚洲中文字幕| 精品人妻一区二区三区麻豆| 97在线人人人人妻| 内地一区二区视频在线| 免费在线观看成人毛片| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲国产精品一区三区| 免费av中文字幕在线| 一边亲一边摸免费视频| 中文欧美无线码| 久久热精品热| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 91精品一卡2卡3卡4卡| 国产欧美日韩精品一区二区| videos熟女内射| 晚上一个人看的免费电影| 妹子高潮喷水视频| av女优亚洲男人天堂| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产av国产精品国产| a级毛片免费高清观看在线播放| 97超视频在线观看视频| 七月丁香在线播放| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 国产精品久久久久久久久免| 国产精品国产三级国产专区5o| 夫妻午夜视频| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 日韩中字成人| 欧美人与善性xxx| 丰满饥渴人妻一区二区三| 精品久久久精品久久久| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 午夜福利视频精品| av在线播放精品| 久久综合国产亚洲精品| 亚洲精品色激情综合| 少妇人妻 视频| 日本色播在线视频| 深夜a级毛片| 免费高清在线观看视频在线观看| 男人舔奶头视频| 五月开心婷婷网| 亚洲久久久国产精品| 久热这里只有精品99| 亚洲av在线观看美女高潮| 亚洲av在线观看美女高潮| 伊人久久国产一区二区| 自线自在国产av| 国产91av在线免费观看| 嘟嘟电影网在线观看| 99热6这里只有精品| 熟女人妻精品中文字幕| 免费黄色在线免费观看| 亚洲国产精品成人久久小说| 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产成人aa在线观看| 欧美3d第一页| 特大巨黑吊av在线直播| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产视频内射| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产精品久久久久久精品古装| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 少妇人妻精品综合一区二区| 色视频www国产| 妹子高潮喷水视频| 超碰97精品在线观看| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 久久久久久久大尺度免费视频| 妹子高潮喷水视频| 免费看日本二区| 亚洲不卡免费看| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产黄片视频在线免费观看| 热re99久久国产66热| 春色校园在线视频观看| 国产美女午夜福利| 久久久久久久大尺度免费视频| 久久久久久久久久久丰满| 国产免费又黄又爽又色| 一级毛片aaaaaa免费看小| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 亚洲av二区三区四区| 亚洲经典国产精华液单| 久久女婷五月综合色啪小说| 老司机影院毛片| 黑丝袜美女国产一区| 老司机影院毛片| 久久国产精品大桥未久av | 国产一区亚洲一区在线观看| 国产精品三级大全| 精品久久国产蜜桃| 国产精品女同一区二区软件| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 搡老乐熟女国产| 久久久精品94久久精品| 国产精品女同一区二区软件| 国产免费视频播放在线视频| 美女福利国产在线| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 一区二区三区乱码不卡18| 最近手机中文字幕大全| 久久 成人 亚洲| 一级毛片我不卡| 一级毛片我不卡| 国产黄色视频一区二区在线观看| 免费在线观看成人毛片| 啦啦啦啦在线视频资源| 午夜精品国产一区二区电影| 久热久热在线精品观看| 色视频在线一区二区三区| 国产av一区二区精品久久| 最新的欧美精品一区二区| 国产高清有码在线观看视频| 最近最新中文字幕免费大全7| 久久久久久伊人网av| 亚洲欧洲日产国产| 久久精品久久精品一区二区三区| 婷婷色综合www| 韩国av在线不卡| 欧美成人午夜免费资源| 成人综合一区亚洲| 人妻一区二区av| 国产av码专区亚洲av| 久久热精品热| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 五月玫瑰六月丁香| 在线观看国产h片| 嫩草影院入口| 亚洲精品成人av观看孕妇| 中文字幕免费在线视频6| 男人添女人高潮全过程视频| 亚洲国产日韩一区二区| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 免费观看a级毛片全部| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 久久精品久久精品一区二区三区| 日韩亚洲欧美综合| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 精品少妇黑人巨大在线播放| 我的老师免费观看完整版| 美女主播在线视频| 久久久国产一区二区| 日日爽夜夜爽网站| a 毛片基地| 国产日韩欧美在线精品| 女人久久www免费人成看片| 亚洲av中文av极速乱| 久久久久久伊人网av| 天美传媒精品一区二区| 亚洲精品日本国产第一区| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 国产伦精品一区二区三区四那| 夫妻性生交免费视频一级片| freevideosex欧美| 女人精品久久久久毛片| 国产视频首页在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 丰满饥渴人妻一区二区三| 免费少妇av软件| 五月开心婷婷网| 亚洲av中文av极速乱| 各种免费的搞黄视频| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 男女边吃奶边做爰视频| 99久久综合免费| 午夜激情福利司机影院| 久久久久久久久久久丰满| 免费看不卡的av| 免费观看av网站的网址| 又大又黄又爽视频免费| 国产亚洲最大av| 婷婷色综合www| 国产精品蜜桃在线观看| av专区在线播放| 全区人妻精品视频| 精品国产乱码久久久久久小说| 搡老乐熟女国产| 国产淫片久久久久久久久| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 午夜免费男女啪啪视频观看| 久久99一区二区三区| xxx大片免费视频| 大片免费播放器 马上看| 嘟嘟电影网在线观看| 国产精品国产av在线观看| 国产成人精品久久久久久| 精品一区二区免费观看| 综合色丁香网| 午夜激情福利司机影院| 美女中出高潮动态图| 亚洲电影在线观看av| 日韩精品有码人妻一区| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产成人aa在线观看| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 夫妻性生交免费视频一级片| 深夜a级毛片| 偷拍熟女少妇极品色| av女优亚洲男人天堂| 国产高清三级在线| 成人亚洲欧美一区二区av| 视频区图区小说| 亚洲情色 制服丝袜| 韩国av在线不卡| av专区在线播放| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 99热网站在线观看| 最近中文字幕高清免费大全6| 青春草国产在线视频| 人人妻人人看人人澡| 交换朋友夫妻互换小说| 少妇人妻久久综合中文| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 99热这里只有精品一区| 欧美日本中文国产一区发布| 男女边摸边吃奶| 精品久久久久久电影网| 免费观看性生交大片5| 99热全是精品| 青春草视频在线免费观看| .国产精品久久| 日本午夜av视频| 黄色怎么调成土黄色| 久久精品国产亚洲网站| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 免费大片黄手机在线观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 欧美xxⅹ黑人| 日日撸夜夜添| 久久午夜福利片| 亚洲人成网站在线播| 三级经典国产精品| 美女国产视频在线观看| 亚洲国产最新在线播放| 日本91视频免费播放| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 日韩制服骚丝袜av| 国产免费视频播放在线视频| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 日韩一区二区视频免费看| 男女边摸边吃奶| 久久久精品94久久精品| 老司机影院成人| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 天天操日日干夜夜撸| 夫妻午夜视频| 少妇熟女欧美另类| 国产伦理片在线播放av一区| 日本与韩国留学比较| 国产成人免费无遮挡视频| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 看免费成人av毛片| 少妇人妻 视频| 国模一区二区三区四区视频| 老女人水多毛片| 永久网站在线| 国产亚洲欧美精品永久| 久久久久精品性色| 国产淫语在线视频| 在线观看av片永久免费下载| 精品一区在线观看国产| 免费在线观看成人毛片| 99国产精品免费福利视频| 精品久久久久久久久亚洲| 免费观看无遮挡的男女| 亚洲美女搞黄在线观看| 久久国产精品大桥未久av | 欧美 日韩 精品 国产| 久久久久国产网址| 精品国产一区二区久久| 久久国内精品自在自线图片| 日韩电影二区| 日日啪夜夜撸| 日本爱情动作片www.在线观看| 极品教师在线视频| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 久久久久视频综合| 简卡轻食公司| 日韩一区二区视频免费看| 亚洲精品亚洲一区二区| 国产综合精华液| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产av码专区亚洲av| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 成年人午夜在线观看视频| 久久久精品免费免费高清| 欧美日韩精品成人综合77777| 国产精品.久久久| 99热网站在线观看| 最近中文字幕高清免费大全6| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 色网站视频免费| 我的女老师完整版在线观看| 插阴视频在线观看视频| 精品一品国产午夜福利视频| 日韩人妻高清精品专区| 视频中文字幕在线观看| 亚洲精品一区蜜桃| 成人毛片60女人毛片免费| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 国产成人91sexporn| 日本欧美国产在线视频| av在线app专区| 国产av码专区亚洲av| 国国产精品蜜臀av免费| 嘟嘟电影网在线观看| 欧美区成人在线视频| 色哟哟·www| 日韩 亚洲 欧美在线| 麻豆成人av视频| 精品一区二区免费观看| 国产成人aa在线观看| 伊人久久精品亚洲午夜| 国产一区二区在线观看av| 男人爽女人下面视频在线观看| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 成人国产麻豆网| 女性被躁到高潮视频| 国产在线男女| 观看av在线不卡| 99久久精品国产国产毛片| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 久久久亚洲精品成人影院| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 欧美一级a爱片免费观看看| av播播在线观看一区| 大片免费播放器 马上看| 夜夜爽夜夜爽视频| 午夜av观看不卡| 久久午夜福利片| 亚洲人成网站在线观看播放| 一区在线观看完整版| 午夜老司机福利剧场| 国产午夜精品一二区理论片| 国产精品福利在线免费观看| 美女福利国产在线| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 最新的欧美精品一区二区| 免费观看无遮挡的男女| 观看免费一级毛片| 久久99精品国语久久久| 校园人妻丝袜中文字幕| 水蜜桃什么品种好| 97在线人人人人妻| 两个人的视频大全免费| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 我的老师免费观看完整版| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产日韩欧美亚洲二区| 亚洲av中文av极速乱| 91精品国产国语对白视频| 国产色婷婷99| 精品国产乱码久久久久久小说| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 大香蕉久久网| 国产精品免费大片| 欧美3d第一页| 精品国产露脸久久av麻豆| 久久午夜综合久久蜜桃| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲av国产av综合av卡| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产精品人妻久久久久久| 色婷婷av一区二区三区视频| 日韩一区二区三区影片| 精品熟女少妇av免费看| 午夜免费鲁丝| 一级毛片aaaaaa免费看小| 精品国产乱码久久久久久小说| 51国产日韩欧美| av有码第一页| 成人影院久久| 熟妇人妻不卡中文字幕| 亚洲av中文av极速乱| 99久久综合免费| 亚洲性久久影院| 亚洲av福利一区| 中文字幕免费在线视频6| 边亲边吃奶的免费视频| 男男h啪啪无遮挡| 久久亚洲国产成人精品v| 国产成人免费观看mmmm| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲av日韩在线播放| av卡一久久| 久久久欧美国产精品| av免费在线看不卡| 国产精品一二三区在线看| 色94色欧美一区二区| 亚洲av成人精品一二三区| 热re99久久国产66热| tube8黄色片| 天天操日日干夜夜撸| 精品午夜福利在线看| 嫩草影院入口| 国产精品久久久久久精品古装| 国产成人精品久久久久久| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲丝袜综合中文字幕| 精品久久久久久电影网| 色视频www国产| 日韩一本色道免费dvd| 热99国产精品久久久久久7| av有码第一页| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 日韩一区二区视频免费看| 一本色道久久久久久精品综合| 99热这里只有精品一区| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 大香蕉97超碰在线| 五月开心婷婷网| 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲丝袜综合中文字幕| 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲国产成人一精品久久久| 免费人妻精品一区二区三区视频| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 大片免费播放器 马上看| 大片免费播放器 马上看| 波野结衣二区三区在线| av国产久精品久网站免费入址| www.av在线官网国产| 久久青草综合色| 亚洲,欧美,日韩| 成人无遮挡网站| 内射极品少妇av片p| 久久久久人妻精品一区果冻| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 久久久久久久久大av| 亚洲不卡免费看| 少妇丰满av| 极品教师在线视频| 国产精品偷伦视频观看了| 秋霞在线观看毛片| 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲成人手机| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 亚洲无线观看免费| av天堂久久9| 欧美高清成人免费视频www| 国产精品免费大片| 免费人成在线观看视频色| 日韩中文字幕视频在线看片| av黄色大香蕉| 国产一区二区在线观看av| 欧美成人午夜免费资源| 视频区图区小说| 香蕉精品网在线| 街头女战士在线观看网站| 色视频www国产| 国产真实伦视频高清在线观看| 最近的中文字幕免费完整| 三级国产精品欧美在线观看| 免费观看的影片在线观看| 久久久久久久久久人人人人人人| 91在线精品国自产拍蜜月| 熟女av电影| 国产精品女同一区二区软件| 久久亚洲国产成人精品v| a级毛片免费高清观看在线播放| 欧美97在线视频| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 国产乱人偷精品视频| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 亚洲精品456在线播放app| 国产一区二区三区av在线| 韩国av在线不卡| 日韩一本色道免费dvd| 丝袜脚勾引网站| 美女大奶头黄色视频| 国产黄色视频一区二区在线观看| 两个人的视频大全免费| 日韩欧美精品免费久久| 在线天堂最新版资源| 大香蕉97超碰在线| 日本-黄色视频高清免费观看| 99久国产av精品国产电影| 永久网站在线| 成年人午夜在线观看视频| 天堂中文最新版在线下载| 精品一区二区三区视频在线| 国产精品一区二区性色av| 在线 av 中文字幕| 成人毛片a级毛片在线播放| 人妻少妇偷人精品九色| 2022亚洲国产成人精品| 国产亚洲一区二区精品| 中文欧美无线码| 晚上一个人看的免费电影| 精品国产乱码久久久久久小说| 欧美 日韩 精品 国产| 又大又黄又爽视频免费| 99久久人妻综合| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产成人精品婷婷| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 亚洲国产色片| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产日韩欧美视频二区| 亚洲熟女精品中文字幕| 高清毛片免费看| 中国三级夫妇交换| 欧美一级a爱片免费观看看|