小蓬竹植物內(nèi)生真菌多樣性1)

劉濟明 柳嘉佳 顏強 熊雪 李麗霞 駱暢

(貴州大學(xué)，貴陽，550025)(貴州省社會科學(xué)院)(貴州大學(xué))

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小蓬竹植物內(nèi)生真菌多樣性1)

劉濟明 柳嘉佳 顏強 熊雪 李麗霞 駱暢

(貴州大學(xué)，貴陽，550025)(貴州省社會科學(xué)院)(貴州大學(xué))

以喀斯特地區(qū)特有瀕危物種小蓬竹(DrepanostachyumluodianenseKeng f.)為研究對象，采用組織塊分離法分離內(nèi)生真菌，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征與分子生物學(xué)鑒定的方法對分離到的菌株進行鑒定。研究其內(nèi)生真菌的多樣性，研究結(jié)果表明：從180個供試組織塊中分離得到105株內(nèi)生真菌，可劃分為19個屬，31種(含2個可能的新種)，相似度為95%～100%。在屬的分類水平上，以節(jié)菱孢霉屬(Arthrinium)、鐮刀菌屬(Fusarium)、木霉屬(Trichoderma)、炭角菌屬(Xylaria)為優(yōu)勢菌屬，分別占菌株總數(shù)量的12.38%和9.52%、6.67%、6.67%。小蓬竹內(nèi)生真菌Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H)為2.800，Simpson指數(shù)(D)為0.932，均勻度指數(shù)(E)為0.604，且在不同組織部位中小蓬竹內(nèi)生真菌多樣性也存在一定差異。Jaccard指數(shù)與Sorenson指數(shù)變化趨勢一致，均為根莖的相似性最低，莖葉的相似性最高，而根和葉的居于兩者之間。

小蓬竹；內(nèi)生真菌；多樣性

Journal of Northeast Forestry University，2016,44(12)：71-75,90.

We studied on Endophytic Fungal diversity ofDrepanostachyumluodianense, which is unique endangered species of Karst area. Endophytic fungal were isolated by tissue isolation method and identified to species and gene level based on morphological characteristics and molecular analysis for cultivation, protection, exploit ofD.luodianenseand ecological restoration of vegetation in karst area. By statistics, 105 strains of Endophytic Fungal were isolated from the 180 tested tissues, and were divided into 19 genus, 31 strains (maybe including 2 species). Their homologies ranged in 95%-100%. In the genus classification level,Arthriniummortierellaaccounted for 12.38%,Fusariumfor 9.52%,Trichodermafor 6.67%, andGenusxylariafor 6.80%, and they were the dominant species. The Shannon-Wiener index (H) was 2.800, Simpson index (D) was 0.932, and evenness index (E) was 0.604, and there was difference for diversity of Endophytic Fungal fromD.luodianensein different plant part. The variation tendency of Jaccard index and Sorenson index were consistent, the highest homologies were in root and stem, the lowest in leaf and stem, and root and leaf were in between.

植物內(nèi)生真菌是指那些在其生活史的一定階段，或全部階段生活于健康植物各組織和器官內(nèi)的真菌[1-3]。目前，國內(nèi)外部分學(xué)者深入研究了部分植物內(nèi)生真菌的組成和分布[4-7]。由于植物內(nèi)生真菌具有豐富的多樣性，所以要針對不同植物進行內(nèi)生真菌多樣性研究[8-9]。同時，要不斷深入研究和分析同一植物不同季節(jié)和組織部位內(nèi)生真菌的多樣性[10-11]，進一步比較和探討不同宿主植物組織間動態(tài)變化，對于豐富真菌的物種以及增強宿主植物的生長、抗逆性和修復(fù)作用都具有重要意義[12-13]。目前，關(guān)于小蓬竹內(nèi)生真菌多樣性的研究尚未見報道。本文通過對小蓬竹不同組織部位可培養(yǎng)內(nèi)生真菌數(shù)量及菌群結(jié)構(gòu)的研究，探明小蓬竹內(nèi)生真菌多樣性，以期對小蓬竹的引種栽培和保護與利用以及喀斯特地區(qū)植被和生態(tài)恢復(fù)提供理論依據(jù)與科學(xué)支撐。同時，也為認(rèn)識內(nèi)生真菌的生態(tài)學(xué)功能，內(nèi)生真菌與宿主的關(guān)系以及竹類植物內(nèi)生真菌資源的開發(fā)利用提供參考和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

供試植株取自于小蓬竹典型自然分布地——貴州羅甸縣董架鄉(xiāng)董架村打鳥槽處，屬于典型的南亞熱帶季風(fēng)氣候，年平均氣溫18.6 ℃，年降水量在1 200 mm左右，土壤為典型的喀斯特石灰土，土壤肥力較高。

沿等高線分別設(shè)置5個樣地(5 m×5 m)，調(diào)查樣地內(nèi)小蓬竹選取3點進行土壤因子調(diào)查，各樣方隨機選取10株，整叢挖出后，篩選出色澤鮮艷、健康的植株，將植株分為根莖葉，莖分為上中下3部分，分別取樣分裝并編號，用裝有冰袋的取樣箱帶回。

1.2 培養(yǎng)基

25%雙抗PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯50 g，瓊脂4 g，葡萄糖4 g，定容至1 000 mL,pH自然，150 mg/L慶大霉素和100 mg/L青霉素。

雙抗竹稈煎汁瓊脂培養(yǎng)基：竹稈200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂20.0 g。蒸餾水1 000 mL，pH自然，150 mg/L慶大霉素和100 mg/L青霉素。

標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基:美國BD(Difco)公司生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)PDA(Potato dextrose agar)。

1.3 小蓬竹內(nèi)生真菌分離

采用組織塊分離法對內(nèi)生真菌進行分離培養(yǎng)，用無菌刀片削去組織塊兩端,切成4 mm×4 mm×3 mm的組織塊,然后分別接于25%雙抗PDA培養(yǎng)基上，每個優(yōu)化后的平板上6個瓊脂塊各接1個組織塊，每種處理重復(fù)10個，根莖葉各60組織塊，轉(zhuǎn)到真菌培養(yǎng)箱，26 ℃恒溫培養(yǎng)。用接種針挑取菌絲尖端部分轉(zhuǎn)接至新的PDA培養(yǎng)基上，純化2～3次后直至獲得單一菌種。采用斜面保藏方法，在斜面上將待保藏菌株接入，編號后置于培養(yǎng)箱26 ℃培養(yǎng)4～7 d，待菌株生長旺盛后，置于冰箱中4 ℃保藏備用，定期檢查[14]。采用組織印跡法、漂洗液洗涂布法、空白平板對照法三類檢測方法配合，綜合檢測消毒效果，最大程度確保分離的菌是植物組織的內(nèi)生真菌[15-17]。

1.4 小蓬竹內(nèi)生真菌分子生物學(xué)鑒定

內(nèi)生真菌DNA的提取、PCR擴增和序列測定：采用購買的生物工程(上海)股份有限公司Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取，對PCR擴增后的產(chǎn)物采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒Kit Ver.2.0(TaKaRa)進行純化，然后采用1%瓊脂糖凝膠(含0.5 mg/L溴化乙錠)電泳檢測DNA的質(zhì)量。

PCR擴增產(chǎn)物采用真菌通用引物，其序列為：ITS1-F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)、ITS4-R(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：PCR Master Mix 25 μL，DNA模板1 μL；ITS1-F 2 μL，ITS4-R 2 μL；雙蒸水補足50 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min后進行34個循環(huán)，每個循環(huán)包括94 ℃ 1 min，51 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。用1%的瓊脂糖凝膠(含0.5 mg/L溴化乙錠)電泳進行檢測，并拍照。

內(nèi)生真菌ITS序列的比對：所獲序列由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司Invitrogen測序后，將測序結(jié)果提交NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫，進行同源序列搜索(BLAST search)，選擇與目的序列最相近的真實可靠的菌種序列作參考，使用Clustal X-2.0軟件進行匹配排列，用MEGA 6構(gòu)建鄰接Neighbor-Joining分析方法進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

采用分離率(IR)、分離頻率(IF)衡量植物組織中內(nèi)生真菌的豐富程度，比較判斷優(yōu)勢菌群，同時采用Shannon-Wiener指數(shù)(H)、Simpson指數(shù)(D)、均勻度指數(shù)(J)分析小蓬竹內(nèi)生真菌的多樣性特征，用相似性系數(shù)(CS)和Jaccard(Cj)分析不同組織或樣本中內(nèi)生真菌種類組成的相似程度。

(1)

(2)

(3)

CS=2j/(a+b)，

(4)

CJ=j/(a+b-j)。

(5)

式(1)、(2)、(3)中：Pi是第i種的比例多度，S為物種總數(shù)目。

式(4)、(5)中:j為兩個組織或樣本共同具有的內(nèi)生真菌種類數(shù)，a、b分別為每個組織或樣本中的內(nèi)生真菌種類數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌的組成

試驗采用組織塊分離法從180個供試小蓬竹組織塊(根、莖和葉各60塊)中分離內(nèi)生真菌，共有85塊被內(nèi)生真菌侵染(見表1)，其中根44塊，莖21塊，葉20塊。共計從中分離得到105株內(nèi)生真菌，其中從根中分離出63株，莖中14株，葉中28株。其中根中內(nèi)生真菌的分離頻率最高，達到60%；莖和葉中分離到的內(nèi)生真菌分別占總菌株數(shù)的13.33%和26.67%。在根組織中，共有63株菌，分布于17個菌屬，其中鐮刀菌屬與漆斑菌屬的分離頻率最高，均占總菌株數(shù)的7.62%；莖中有14株菌6個屬，分布比較均，擬莖點霉屬、彎孢聚殼屬等為優(yōu)勢菌屬，占總菌株數(shù)的1.90%；葉片中，28株菌分布于9個屬，節(jié)菱孢霉屬分離頻率為7.62%，為優(yōu)勢菌屬。

2.2 內(nèi)生真菌的ITS-rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的建立

基于ITS序列BLAST分析將所分離到的105株菌株歸屬為19個屬，31種(含2個可能的新種)，通過進行BLAST search并與數(shù)據(jù)庫中序列相近的菌種進行比對(見表2)，發(fā)現(xiàn)該105株菌株的序列同源性都較大，都達到了95%～100%。再將獲取的不同基因型的菌株采用MEGA6.0構(gòu)建(Neighbor-Joining)系統(tǒng)進化樹(見圖1)。

分離到的105株真菌均屬于子囊菌門(Ascomycota)的盤菌亞門(Pezizomycotina)，在綱的分類水平上，以糞殼菌綱(Sordariomycetes)優(yōu)勢菌群占菌株總數(shù)的85.71%，散囊菌綱(Eurotiomycetes)占菌株總數(shù)的5.71%，座囊菌綱(Dothideomycetes)、錘舌菌綱(Leotiomycetes)與絲孢子菌綱(Hyphomycetes)分別僅占菌株總數(shù)的4.76%、1.90%；從目的分類水平上共有10個分類單元，以炭角菌目(Xylariales)、肉座菌目(Hypo Creales)為優(yōu)勢菌群，分別占菌株總數(shù)的24.76%和25.71%；在科的分類水平上，共有17個分類單元，以叢赤殼科(Nectriaceae)、梨孢假殼科(Apiosporaceae)為優(yōu)勢菌群，分別占總菌株數(shù)的9.52%、12.38%；在屬的分類水平上，共有19個分類單元，以節(jié)菱孢霉屬(Arthrinium)、鐮刀菌屬(Fusarium)、木霉屬(Trichoderma)、炭角菌屬(Xylaria)為優(yōu)勢菌屬，分別占菌株總數(shù)的12.38%和9.52%、6.67%。結(jié)果表明：小蓬竹植株中具有豐富的真菌物種多樣性。

表1 不同組織內(nèi)內(nèi)生真菌菌群的組成及分離頻率

表2 基于ITS序列BLAST分析和形態(tài)學(xué)特征推斷內(nèi)生真菌的分類單元

續(xù)(表2)

圖1 鄰接法構(gòu)建ITS序列的系統(tǒng)進化樹

2.3 不同組織內(nèi)生真菌分布多樣性及相似性

從多樣性指數(shù)來看，小蓬竹內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)(H)、Simpson指數(shù)(D)依次為2.800、0.932，均勻度指數(shù)(E)為0.604。但在不同組織中小蓬竹內(nèi)生真菌多樣性也存在一定差異?？偟膩砜?，在多樣性指數(shù)方面，Shannon-Wiener和Simpson指數(shù)在不同組織中的變化趨勢一致，均為根最高，莖其次，葉片最低。莖的均勻度指數(shù)(E)最高，為0.775，葉的最低為0.597(見表3)。結(jié)果表明，小蓬竹植株中存在大量的內(nèi)生真菌，并且根中內(nèi)生真菌數(shù)量和種群多樣性遠(yuǎn)高于葉和莖內(nèi)。

表3 小蓬竹根、莖、葉內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)

表4對不同組織中內(nèi)生真菌菌群的相似性比較發(fā)現(xiàn)：Jaccard指數(shù)與Sorenson指數(shù)變化趨勢一致，均為根莖的相似性最低，莖葉的相似性最高，而根和葉的居于兩者之間。此外，Jaccard指數(shù)都不大于0.5，Sorenson指數(shù)稍大于0.5(見表4)，這表明小蓬竹的內(nèi)生真菌菌群各組織間差異是適中的，雖具有一定的相似性，但相似性不高，各組織中分布的內(nèi)生真菌各有其特點。

表4 小蓬竹內(nèi)生真菌菌群相似性系數(shù)比較

注：表中對角線以上為Jaccard指數(shù)，以下為Sorenson指數(shù)。

3 結(jié)論與討論

本研究明確了喀斯特地區(qū)的小蓬竹內(nèi)生真菌的組成結(jié)構(gòu)，糞殼菌綱(Sordariomycetes)為優(yōu)勢菌群，可分為19屬，其中以節(jié)菱孢霉屬(Arthrinium)、鐮刀菌屬(Fusarium)、木霉屬(Trichoderma)、炭角菌屬(Xylaria)為優(yōu)勢菌屬。這與有關(guān)竹類真菌分類鑒定方面的研究基本相符[18-19]?？紤]竹類的生物特性，普遍被認(rèn)為其內(nèi)生真菌的腐生性較強、或為潛伏性病原菌菌屬，為排除相關(guān)干擾，所采集的樣本全部來自完全沒有受到傷害或感染病害健康植株，并且實驗采用組織印跡法、漂洗液洗涂布法、空白平板對照法三類檢測方法配合，綜合檢測消毒效果，確保分離的菌是植物組織的內(nèi)生真菌。因此，一些常見植物病原菌和腐生菌菌群，卻是在健康小蓬竹植物中普遍大量存在。主要是因為真菌與宿主兩者間互作用的結(jié)果隨著環(huán)境因子(氣候、土壤性質(zhì)等)、宿主種類和生理狀態(tài)、真菌基因型的變化都可能改變[20]。一方面，對于同一菌株對不同植株而言，隨著環(huán)境條件和宿主生理狀況的改變，菌類的基因型極易發(fā)生突變，可能由致病菌的偏利共生，甚至寄生變?yōu)榛セ莨采?，從而表現(xiàn)出不同的生活方式。致病性炭疽菌(Colletotrichum)的突變株可以定殖在葫蘆科植物如西瓜和南瓜上，表現(xiàn)出如抗病、促進生長和抗旱等偏利共生或互惠共生的生活方式[21]。另一方面，有些內(nèi)生真菌屬于潛在性病原菌，在宿主抵抗力下降或者某一生長階段才表現(xiàn)出致病性。此外，特定的環(huán)境條件，內(nèi)生真菌包括炭疽菌、鐮刀菌和擬莖點霉等[22-23]可能發(fā)揮腐生菌的功能，產(chǎn)生腐生菌相似的細(xì)胞降解酶[24]。綜上研究表明，小蓬竹內(nèi)生真菌的組成與種類與其喀斯特石漠化特殊生境有密不可分的關(guān)系。

小蓬竹不同組織中內(nèi)生真菌的數(shù)量、種類及分布存在顯著性差異，這體現(xiàn)了內(nèi)生真菌的組織偏好性和特異性，可能是由于不同部位的結(jié)構(gòu)成分不同、生長年限不同、富含的營養(yǎng)物質(zhì)不完全相同，以及真菌在土壤與空氣中傳播機制的不同造成的[25]。綜合來看，根部分離到的內(nèi)生真菌數(shù)量種類最多、多樣性指數(shù)最高，葉片其次，莖中最少的但分布均勻。這與孫麗等[26]的新疆阿魏、陳立軍等[27]油菜的內(nèi)生真菌的分離鑒定結(jié)果相符。同時與小蓬竹其地下莖合軸型，一年生與多年生根部混生，竹稈在地面密集叢生的生物特性關(guān)系密切：一方面由于很多源自土壤的內(nèi)生真菌從根部侵入向上擴展，再入侵到莖部；另外雨水飛濺、空氣流動也使葉片接觸到微生物的機會也比莖部相對更多。此外，在喀斯特相對貧瘠的土壤上，根中所含的營養(yǎng)物質(zhì)比莖、葉豐富也是不可忽視的因素。

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Diversity of Endophytic Fungal fromDrepanostachyumluodianense

Liu Jiming, Liu Jiajia

(Guizhou Uniersity, Guiyang 550025, P. R. China); Yan Qiang(Guizhou Provincial Academy of Social Science); Xiong Xue, Li Lixia, Luo Chang(Guizhou Uniersity)

Drepanostachyumluodianense; Endophytic fungal; Diversity

劉濟明，男，1963年6月生，貴州大學(xué)林學(xué)院，教授。E-mail:karst0623@163.com。

2016年6月26日。

Q938.1

1)貴州省國際科技合作計劃[黔科合外G字(2013)7010號]。

責(zé)任編輯：潘 華。