鉻脅迫對葎草雌雄葉片抗氧化酶活性及丙二醛含量的影響

馮 旭，王碧霞

(西華師范大學a.生命科學學院;b.環(huán)境科學與工程學院,四川 南充 637009)

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鉻脅迫對葎草雌雄葉片抗氧化酶活性及丙二醛含量的影響

馮 旭a，王碧霞b

(西華師范大學a.生命科學學院;b.環(huán)境科學與工程學院,四川 南充 637009)

采用盆栽法研究不同鉻濃度(Cr3+)(分別為0、50、200、300、500 mg/kg)下葎草(Humulusscandens)雌雄葉片抗氧化酶活性的不同影響。結(jié)果表明：1)Cr3+脅迫顯著影響了葎草雌雄幼苗的SOD、POD、CAT、Pr和MDA含量(P=0.002，P=0.001，P=0.002，P=0.000，P=0.000)，總體上呈現(xiàn)出低促高抑的變化趨勢。2)對照處理下，葎草雌株的超氧化物歧化酶(SOD)活性較雄株高，而丙二醛(MDA)含量、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)活性和可溶性蛋白(Pr)含量則比雄株低。3)葎草雌雄幼苗的抗氧化酶活性在低濃度Cr3+脅迫得到了促進，在中度Cr3+脅迫(200～300 mg/kg)下受到顯著抑制，膜質(zhì)過氧化作用的顯著增強，且高濃度Cr3+脅迫(500 mg/kg)條件下，葎草幼苗雌雄株的抗氧化活性顯著失衡，其抗氧化酶指標的變化出現(xiàn)差異。隨著Cr3+脅迫的增加，葎草雌雄幼苗SOD、POD和Pr含量呈先高后低的變化趨勢，CAT呈下降趨勢，而MDA卻呈上升趨勢，葎草雌株比雄株具有更積極的響應策略和更強的耐Cr3+機制。

葎草；鉻脅迫；雌雄異株；抗氧化酶活性

重金屬鉻是環(huán)境污染中的五毒之一，是一種毒性較大的致畸、致突變劑[1]。近年來，隨著鉻在印染、電鍍、皮革、化工等行業(yè)上的廣泛應用，使大量的含鉻廢水、廢氣、廢渣過度排放，導致重金屬鉻對土壤和農(nóng)作物的脅迫問題越來越突出，而農(nóng)田土壤中的鉻最終將通過食物鏈富集危害人類健康，為此研究和分析鉻對植物生長發(fā)育的影響及其毒害機理已成為當前的研究熱點。關于植物對鉻脅迫的耐性機制已有報道，抗氧化酶系統(tǒng)是植物應對各種環(huán)境脅迫的一種重要抗逆機制，在植物適應逆境的過程中起重要作用。有研究表明，鉻污染對薄荷(MenthahaplocalyxBriq.)、油菜(Brassicajuncea)、煙草(Tobacco)、水稻(Rice)等植物的生理和生長都具有影響[2-6]，低濃度鉻脅迫對植株生長產(chǎn)生促進作用，但高濃度鉻脅迫則表現(xiàn)出明顯的中毒癥狀，造成植株葉綠素含量減少，SOD活性下降，POD活性和MDA含量上升，且鉻脅迫還使李氏禾(Leersiahexandra)葉片的可溶性糖、可溶性蛋白含量等發(fā)生改變[7]。由于已有研究多集中在經(jīng)濟作物方面，而對草本植物的研究卻較少報道。因此，研究不同濃度鉻脅迫對草本植物的抗氧化酶特性的不同影響具有重要意義。雌雄異株植物作為陸地生態(tài)系統(tǒng)的重要組分，由于長期的進化，這類植物在生長、空間分布、生殖格局、資源配置等方面已表現(xiàn)出明顯的差異[8-11]，該類植物為我國生態(tài)系統(tǒng)中的常見物種，如楊屬、柳屬、槭屬、桑屬等常見植物，對維持陸地生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性起著重要作用。由于繁殖成本的不同，該類植物的雌雄個體在生理生化特征和環(huán)境適應性等方面出現(xiàn)出明顯的性別差異。如青楊雄株幼苗POD活性在鋁脅迫下顯著增加、SOD活性顯著降低，雌株對此卻無變化[12]，在淹水脅迫下青雌株幼苗的MDA含量比雄株高，SOD活性比雄株低[13]；桑樹雄株幼苗的Pr含量和SOD活性施鉛后其增加幅度比雌株高[14]，銀杏雌雄幼苗的POD、CAT和APX活性在模擬酸雨條件下均顯著降低[15]。然而，關于雌雄異株植物的抗氧化酶特性受重金屬脅迫影響的性別差異的研究卻較少，而葎草(HumulusscandensL.)為?？?Moraceae)葎草屬(Humulus)雌雄異株植物，一年或多年生草本，我國除青海、新疆外，南北各省區(qū)廣泛分布，主要生長在荒山荒坡及溝邊、路旁、荒蕪區(qū)域。鑒于葎草是常見的雌雄異株草本植物，生長快、分布廣，非常適合作為研究鉻脅迫對雌雄異株植物抗氧化酶特性的試材。因此，常見的葎草為實驗材料，探討不同鉻濃度下葎草雌雄植株抗氧酶活性的性別差異，以期揭示：雌雄植株對鉻脅迫的抗氧化機制是否一致？哪種性別具有更強的抗逆性？研究結(jié)果可能揭示鉻脅迫下雌雄植株間的不同耐性響應策略，從而為進一步研究未來鉻污染對雌雄異株植物種群繁衍能力的影響奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2012年10月中下旬采集南充市本地葎草野生種子，于2013年2月20日播種，待生長1個月后，選擇長勢基本一致的幼苗50株移栽到體積為10 L的塑料盆內(nèi)，毎盆裝入勻質(zhì)土壤7.5 kg，河沙1.5 kg，毎盆1株，緩苗20 d。于4月15日進行鉻脅迫，重金屬試劑為Cr3+。參照王愛云等的方法[3]，設濃度為0(對照)、50、200、300 、500 mg/kg共5個處理，將Cr3+按相應濃度配成1 000 mL的溶液，于4月15日一次性緩慢均勻澆灌于土壤中，每處理下雌雄植株各5株重復，對照組(5株)澆施等量清水。為防止溶液滲漏，對照組和處理組塑料盆內(nèi)均套有塑料袋(土壤置于塑料袋內(nèi))。

1.2 測量方法

試驗處理結(jié)束時，隨機選擇各種處理下的雌雄植株各5株，并選取各植株上部第3或4片完全展開的向陽葉片用于測定超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性、可溶性蛋白含量(Pr)及丙二醛(MDA)含量。

酶提取方法：取0.3 g葉片于預冷的研缽中，加入6 mL預冷的提取緩沖液(磷酸緩沖液pH 7.8，1 mmol/L)，乙二胺四乙酸(EDTA)和1%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)研磨成勻漿，于4 °C下離心30 min(12 000×g)，取上清液(酶液)用于試驗。

1.2.1 SOD活性的測定 采用氮藍四唑(NBT)比色法[16]，以不照光的對照為空白，測定560 nm波長下的吸光度值，樣品中SOD活性 (U·g-1·h-1·FW)=[(DCK-DE)×VT]/(0.5×DCK×W×V1)。

1.2.2 POD和CAT活性的測定 采用愈創(chuàng)木酚法測定[17]，將每分鐘OD470和OD240降低0.01定義為一個酶活力單位，分別讀取470 nm吸光光度值在3min內(nèi)每10 s中的變化，以每分鐘內(nèi)D470變化0.01為1個POD活性單位(U)表示，POD活性 (U·g-1·min-1·FW)=(ΔD 470×VT)/(W×VS×0.01×t)；CAT在240 nm處用相同的方法，CAT活性 (U·g-1·min-1·FW) =(ΔD 240×VT)/(W×VS×0.01×t)。

1.2.3 可溶性蛋白(Pr)含量的測定 采用考馬斯亮藍法進行[18]，在595 nm波長下分別測定各樣品管吸光度值，并通過標準曲線查得樣品中可溶性蛋白的含量，可溶性蛋白(Pr)含量 (μg/g) =(C×VT)/(FW×Vt)。

1.2.4 丙二醛(MDA)含量的測定 采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法[19]，測定在532、600和450 nm波長處的吸光度值D532、D600和D450，CMDA=6.45(D532-D600)-0.56 D450，樣品中MDA含量 (μmol/g)=(CMDA×VT)/(FW×1 000)。

1.2.5 統(tǒng)計分析 利用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。平均值間的比較采用單因素方差分析方法(One-Way ANOVA)；不同處理間的差異采用Duncan多重比較檢驗(Duncan’s Multiple Range Test)。顯著性水平設定為a=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cr3+脅迫對葎草雌雄葉片SOD活性的影響

從圖1(A)中可以看出，對照處理下，葎草雌株葉片的SOD活性比雄株高81.83%。與CK相比，50 mg/kg 時雌雄植株的SOD活性均減少，尤其是雄株顯著降低。雌雄植株的SOD活性在200 mg/kg時顯著增加，300 mg/kg 時升至最高，而500 mg/kg 時卻顯著減少，但仍高于對照。因此，Cr3+脅迫顯著影響了葎草雌雄葉片的SOD活性(P=0.002)，隨著Cr3+脅迫的加重，雌雄株均呈先降后升再降的趨勢，且雌株在不同濃度下均高于雄株。

2.2 Cr3+脅迫對葎草雌雄葉片POD活性的影響

從圖1(B)中可以看出，Cr3+脅迫條件下葎草雌雄葉片的POD差異顯著(P=0.001)。隨著Cr3+濃度的增加，雌雄植株的POD均呈現(xiàn)出先增后降的趨勢，高Cr3+濃度下的二者的下降幅度較小。同時，雌雄株的POD在CK時差異不顯著，當濃度增至300 mg/kg時雌雄株的POD顯著增高，500 mg/kg時二者略有下降，但仍比CK分別高66.67%和61.90%。

2.3 Cr3+脅迫對葎草雌雄葉片CAT活性的影響

從圖2(A)中可以看出，Cr3+脅迫條件下葎草雌雄葉片的CAT活性差異極為顯著(P=0.000)。雌株的CAT隨Cr3+濃度的增加而增加，雄株則下降。與雌株相比，雄株在CK時顯著升高，在低濃度50 mg/kg 時雄株仍明顯上升，而在濃度200 mg/kg 時二者同時降低。但300 mg/kg 時雌株卻比雄株顯著增高，500 mg/kg 時雌株仍較雄株高31.03%。

2.4 Cr3+脅迫對葎草雌雄葉片可溶性蛋白含量(Pr)的影響

從圖2(B)中可以看出，對照處理下，葎草雌株葉片的Pr含量比雄株低33.96%。50 mg/kg 時，雌雄葉片的Pr含量比CK顯著增加，200 mg/kg 時，二者均升至最高。但300 mg/kg 時，雌雄植株卻同時顯著減少，500 mg/kg 時二者繼續(xù)下降，且下降幅度相同，但仍比CK高。由此可以看出，Cr3+脅迫下葎草雌雄幼苗葉片的Pr含量具有極顯著的差異(P=0.000)，二者均呈現(xiàn)出先高后低的趨勢。與雄株相比，在低Cr3+濃度時雌株幼苗葉片的Pr較低，中Cr3+濃度時較高，高Cr3+濃度時沒有差異。

2.5 Cr3+脅迫對葎草雌雄葉片丙二醛(MDA)含量的影響

從圖3可以看出，CK時，雄株的MDA含量比雌株略高，50 mg/kg 時，雌雄株的MDA分別上升了96.53%和80.51%，200 mg/kg 時，雌雄植株略有下降，300 mg/kg 時二者仍然較高，500 mg/kg 時二者同時略為下降，但仍分別比CK高45.23%和21.62%減少。由此可以看出，雌雄株的MDA在Cr3+脅迫條件均比CK顯著增高，二者的變化趨勢相相近，但雄株低Cr3+濃度(50 mg/kg)時上升幅度大，高Cr3+濃度(Cr3+)時下降幅度更大雌株，雌株的變化幅度相對較小。因此，Cr3+脅迫顯著影響葎草幼苗葉片的MDA含量(P=0.000)，具有極顯著的差異性。

3 討論與結(jié)論

正常情況下，植物體內(nèi)的活性氧代謝保持平衡，但當植物遭受重金屬脅迫時，其體內(nèi)的活性氧產(chǎn)生和清除之間的動態(tài)平衡就會遭到破壞。作者研究中，葎草雌雄幼苗在低濃度Cr3+脅迫(50 mg/kg)時，SOD略有下降，POD略有增加，CAT活性和MDA含量顯著下降，Pr顯著增加。這表明Cr3+脅迫促進了葎草雌雄幼苗體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，開始啟動膜脂過氧化作用。而中度Cr3+脅迫(200 mg/kg和300 mg/kg)則引起葎草雌雄幼苗的活性氧代謝平衡失調(diào)， 如SOD和POD均在300 mg/kg時達到最大值，Pr則在200 mg/kg時也升至最高，而CAT卻持續(xù)下降，MDA也顯著高于CK。這說明葎草雌雄幼苗的SOD和POD活性在中度Cr3+脅迫下能協(xié)助清除過量的活性氧，維持ROS代謝平衡，保護膜結(jié)構，對提高葎草對Cr3+脅迫的耐受性具有重要作用。但高濃度Cr3+脅迫(500 mg/kg)下，葎草雌雄幼苗的SOD、POD、CAT和Pr卻比中度脅迫顯著下降，但均在不同程度上高于CK。這反映出葎草幼苗在中度脅迫時可能已達到其承受臨界點，因此高度Cr3+脅迫下的抗氧化酶系統(tǒng)已嚴重受損，其生物膜結(jié)構破壞加劇，對Cr3+脅迫敏感性受到破壞，因而出現(xiàn)反應遲緩，其抗氧化酶活性下降，MDA也降低。從總體上來看，低濃度Cr3+脅迫對葎草雌雄葉片的抗氧化酶活性有促進作用，高濃度則表現(xiàn)為抑制作用，呈現(xiàn)出先促后抑的趨勢。這不僅與鉻脅迫下的菖蒲(Acoruscalamus)、白花三葉草(Trifoliumrepens)、高羊茅(Festuceacaarundina)、紫花苜蓿(MedicagosativaL.)的抗氧化酶活性變化較為相似[3,20]，而且也與鉻脅迫下葎草幼苗葉片凈光合速率的變化規(guī)律相一致[21]。

還有研究表明，逆境脅迫對雌雄異株植物葉片的抗氧化酶活性的影響差異較大。如鋁脅迫使青楊(Populuscathayana)雄株的POD活性顯著增加，SOD活性顯著降低，雌株MDA含量顯著高于雄株，Pr含量則顯著低于雄株[12]；且鹽脅迫也降低了銀杏(Ginkgobiloba)雌雄幼苗的SOD活性，其雌株的POD活性顯著降低，雄株無明顯變化[15]；而淹水脅迫下的美洲黑楊(Populusdeltoides)雄株卻具有更高的SOD、POD活性以及脯氨酸含量[22]。作者研究顯示，雌株的SOD、POD、CAT活性和Pr含量在中度Cr3+脅迫下比雄株高，二者的MDA差異不顯著，說明雌株的抗氧化酶系統(tǒng)對Cr3+脅迫具有積極的響應，雌雄幼苗的膜脂過氧化作用均顯著增強。但在高濃度Cr3+脅迫下，與雄株相比，雌株的SOD、CAT和MDA均較高，而POD卻較低，Pr含量沒有差異。由于SOD是植物抗氧化系統(tǒng)的第一道防線，能夠通過歧化反應使超氧陰離子轉(zhuǎn)變?yōu)闊o毒的O2和毒性較低的H2O2[17]，而H2O2又被POD、CAT等酶進一步分解為H2O和O2。這說明高濃度Cr3+脅迫導致了葎草雌株幼苗體內(nèi)的超氧陰離子水平顯著提高，并通過升高CAT消除H2O2的累積，使細胞膜結(jié)構不致受到嚴重損壞。另一方面，由于MDA含量的高低可以衡量脅迫條件下植物活性氧傷害及細胞膜受傷害的程度，Pr含量的上升則是逆境脅迫下植物滲透調(diào)節(jié)的重要手段。因此，高濃度Cr3+脅迫使葎草雄株葉片活性氧代謝平衡受到破壞比雌株更強，膜脂過氧化也更嚴重，雌株具有較高的SOD和CAT活性，表明其抗性比雄株更強。這與葎草雌株個體在Cr3+脅迫下具有較高的光合速率以及更好的自我保護機制相關，也與干旱脅迫下葎草雌株通過增加生殖投入來最大程度保證其繁殖能力的生存策略的研究結(jié)果相吻合[10]。

綜上所述，低濃度Cr3+脅迫促進了葎草雌雄幼苗的抗氧化酶活性，中濃度Cr3+脅迫顯著抑制葎草幼苗的抗氧化酶系統(tǒng)，引起了膜質(zhì)過氧化作用的加強，而高濃度Cr3+脅迫條件下，葎草幼苗雌雄株的抗氧化活性顯著失衡，其不同指標的變化具有不同的差異。因此，Cr3+脅迫下葎草幼苗的SOD、POD和Pr含量呈先高后低的變化趨勢，而CAT則呈下降趨勢，但MDA卻呈上升趨勢。隨著Cr3+脅迫的增加，葎草雌株具有更積極的響應策略和更好的耐Cr3+機制。

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Effect of Cr(Ⅲ) Stress on Antioxidative Enzymes Different Influence of Male and Female Humulus scandens Leaves

FENG Xua,WANG Bixiab

(a.College of Life Science,b.College of Environmental Science and Engineering,China West Normal University，Nanchong Sichuan 637009,China)

This paper studied the sex-specific differences of male and femaleHumulusscandensleaves in their antioxidative enzymes under the stress of chromium(0,50,200,and 300 mg/kg Cr3+).The results showed:1)Cr3+stress significantly affected the male and femaleH.scandensseedling in SOD,POD,CAT,Pr and MDA content(P=0.002，P=0.001，P=0.002，P=0.000， P=0.000),with the variation tendency of “l(fā)ow-promotion,high-inhibition”;2)In the control treatment (CK),companied with the males,the superoxide dismutase (SOD) activity of the females was higher,but the malondialdehyed (MDA) content,catalase (CAT),peroxidase (POD) and the soluble protein (Pr) content of the females was lower;3)the antioxidant enzyme activity of male and femaleH.scandensseedling was promoted in low concentration of Cr3+stress(200～300 mg/kg),and inhibited in moderate Cr3+stress(200～300 mg/kg),as well as a significant imbalance in high concentration of Cr3+stress(500 mg/kg),and the changes of their antioxidant enzymes were different. With increase of Cr3+stress,the activities of SOD,POD and Pr content of male and femaleH.scandensseedling showed the “first high and then low” variation tendency,CAT downward trend,but MDA upward trend.The females ofH.scandensseedling has a more positive response strategy than males,and stronger resistance mechanism to Cr3+stress.

Humulusscandens;chromium stress;dioecious;antioxidative enzymes

1673-5072(2016)04-0390-06

2016-01-11

四川省教育廳項目(12ZB142)

馮 旭(1992—)，男，四川巴中人，碩士研究生，主要從事分子生物學方面研究。

王碧霞(1977—)，女，四川南充人，講師，主要從事環(huán)境生態(tài)學方面研究。E-mail:696wbx@163.com

Q945.79

B

10.16246/j.issn.1673-5072.2016.04.006