新型循環(huán)腫瘤細胞計數(shù)與上皮/間質(zhì)型探針標記技術(shù)在膀胱癌中的臨床應(yīng)用

張瑞赟，金 迪，曹 明，陳海戈，薛 蔚，黃翼然

(上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院泌尿科，上海 200127)

·臨床研究·

新型循環(huán)腫瘤細胞計數(shù)與上皮/間質(zhì)型探針標記技術(shù)在膀胱癌中的臨床應(yīng)用

張瑞赟，金 迪，曹 明，陳海戈，薛 蔚，黃翼然

(上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院泌尿科，上海 200127)

目的 本研究旨在探索在膀胱腫瘤中，新型循環(huán)腫瘤細胞(CTC)計數(shù)技術(shù)與基于RNA原位雜交的上皮/間質(zhì)型探針標記技術(shù)的臨床應(yīng)用價值，初步探索上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化在循環(huán)腫瘤細胞的作用與膀胱腫瘤肌層浸潤的關(guān)系。方法 本研究納入2015年5月至10月我院診治的膀胱癌患者(cT1～4aN0M0)115名，同時納入25名健康志愿者作為對照組。采用改良的CanPatrolTM法分離富集CTC，應(yīng)用上皮型(Epi)探針(EpCAM、CK8/18/19)和間質(zhì)型(Mes)探針(Twist、Vimentin)通過RNA原位雜交(RNA-ISH)對分離得到的CTC細胞進行EMT標記。結(jié)果 115名膀胱癌患者中93例(81%)患者為CTC陽性，健康志愿者共檢測到CTC 0個(P<0.001)。對CTC進行RNA-ISH，發(fā)現(xiàn)肌層浸潤型膀胱癌患者外周血CTC(P=0.049)、混合型CTC(P=0.018)及間質(zhì)型CTC(P<0.001)的檢出陽性率顯著高于非肌層浸潤性膀胱癌。pT1患者外周血CTC(P<0.001)、上皮型CTC(P=0.001)與混合型CTC(P<0.001)顯著高于pTa患者。結(jié)論 新型循環(huán)腫瘤細胞(CTC)計數(shù)與基于RNA原位雜交的上皮/間質(zhì)型探針標記技術(shù)可較敏感的檢測出膀胱癌患者循環(huán)腫瘤細胞。間質(zhì)表型CTC可能與腫瘤肌層浸潤相關(guān)，提示EMT與膀胱腫瘤肌層浸潤可能存在相關(guān)性。

膀胱癌；循環(huán)腫瘤細胞；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；腫瘤浸潤； RNA原位雜交

膀胱癌(bladder carcinoma，BC)是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，位居世界范圍內(nèi)惡性腫瘤發(fā)病率第五位，每年全球新發(fā)病例約336 000例，死亡132 000例[1]。在我國，男性膀胱癌發(fā)病率位于全國惡性腫瘤的第七位且發(fā)病率逐年上升。70%的患者在初診時為非肌層浸潤性膀胱癌(nonmuscle invasive bladder cancer，NMIBC)，預(yù)后較好，但30%的患者為肌層浸潤性膀胱癌(muscle invasive bladder cancer，MIBC)，50%肌層浸潤性膀胱癌的接受根治手術(shù)前既已發(fā)生微轉(zhuǎn)移灶，即使接受積極治療亦不可避免地在2年內(nèi)發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移[2]。

研究表明實體瘤在最初的轉(zhuǎn)移進程中，腫瘤細胞從原發(fā)病灶脫落，突破一系列屏障，進而趨化性移動進入淋巴管和血液循環(huán)形成循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)[3]。CTCs從原發(fā)病灶或轉(zhuǎn)移病灶脫落進入血液循環(huán)的過程中，由于血液中機械剪切力、免疫監(jiān)視或其他監(jiān)管機制的作用，大部分腫瘤細胞會發(fā)生凋亡或被吞噬，有極小部分腫瘤細胞在血液循環(huán)中能夠抵御凋亡存活下來，形成微小轉(zhuǎn)移病灶，進一步發(fā)展成為臨床轉(zhuǎn)移灶[4-5]。腫瘤細胞脫落、侵襲并進入血液循環(huán)可能是腫瘤轉(zhuǎn)移的最初階段[4]。有研究表明對于轉(zhuǎn)移性膀胱癌，CTC陽性的患者預(yù)后差于CTC陰性的患者，而對于局部進展期膀胱癌，根治手術(shù)前CTC陽性的患者預(yù)后要差于陰性的患者，但與腫瘤分期的關(guān)系仍然不明確[6-7]。

近期的研究表明，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在CTCs侵襲中具有重要作用：CTCs具有上皮細胞表型、間質(zhì)細胞表型和上皮-間質(zhì)混合細胞表型以及循環(huán)微小瘤栓(Circulating tumor microemoli，CTM)等不同類型，其中間質(zhì)型CTCs能夠抵御失巢凋亡和耐受細胞毒性藥物，比單個腫瘤細胞具有更強的侵襲轉(zhuǎn)移潛能和耐藥能力[4,7-9]。本研究基于應(yīng)用CanPatrolTM，在CTCs計數(shù)技術(shù)上應(yīng)用RNA原位雜交的上皮/間質(zhì)型探針標記技術(shù)，探索上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化在循環(huán)腫瘤細胞細胞中的作用與膀胱腫瘤肌層浸潤的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 本研究納入標準：初發(fā)高危膀胱腫瘤，臨床分期為cT1～4aN0M0，病理類型為尿路上皮癌。排除標準為：復(fù)發(fā)的膀胱腫瘤，臨床分期為cTa，影像學顯示腫瘤臨近臟器侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠處轉(zhuǎn)移，有TURBT術(shù)或根治性全膀胱切除術(shù)禁忌證，病理類型為非尿路上皮癌，合并其他惡性腫瘤。

研究納入2015年5月至2015年10月在我院診治的115例膀胱腫瘤患者，在行首次TURBT術(shù)前采10 mL外周血。研究同時納入25例健康志愿者作為對照組。

1.2 CTCs檢測 膀胱腫瘤患者在TURBT術(shù)前使用EDTA抗凝采血管采集10 mL外周血。對照組健康志愿者使用相同EDTA抗凝采血管采集10 mL外周血。血樣在4 h內(nèi)進行按改良的CanPatrolTM進行預(yù)處理[9]。CTC細胞分離采用改良的CanPatrolTM分離技術(shù)，技術(shù)細節(jié)如CanPatrolTM報道文獻，嚴格按照產(chǎn)品說明書操作[9]。通過8 μm直徑納米膜篩孔過濾后，獲得分離的CTC細胞。針對分離所得CTC細胞，使用多重RNA-原位雜交技術(shù)進行標記鑒定。使用的特異性捕獲探針包括上皮型探針(EpCAM，CK8/18/19)、間質(zhì)型探針(Twist,Vimentin)與CD45。多重RNA-原位雜交具體流程為：①使用特異性捕獲探針與目標mRNA進行雜交；②使用擴增探針與捕獲探針進行雜交，為雜交信號的放大做準備；③使用標記有熒光基團的標記探針與擴增探針進行雜交，產(chǎn)生熒光信號；④利用自動識別系統(tǒng)閱讀熒光。所使用探針序列與材料為CanPatrolTM技術(shù)標準方案，細節(jié)如文獻[9]所示。CD45陽性細胞考慮為血細胞，不計入CTC。上皮型探針陽性間質(zhì)型探針陰性CTC為上皮型CTC，上皮型探針陽性間質(zhì)型探針陽性性CTC為混合型CTC，上皮型探針陰性間質(zhì)型探針陽性性CTC為間質(zhì)型CTC，如圖1所示。

1.3 統(tǒng)計學方法 本研究采用SPSS?21.0(IBM Corp，NY，USA)軟件進行統(tǒng)計學分析。分類變量通過Fisher’sexacttest與Pearson’schi-squaredtest進行檢驗。連續(xù)變量通過Mann-WhitneyU-test進行檢驗。P<0.05差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床病理結(jié)果 115例患者均順利完成CTC檢測及TURBT術(shù)，基本情況如表1所示。其中46例患者接受保留膀胱治療，69例患者TUR術(shù)后接受即刻根治性全膀胱切除術(shù)。術(shù)后病理根據(jù)WHO2004年分級標準，低級別尿路上皮癌6例(5%)，高級別尿路上皮癌109例(95%)。根據(jù)腫瘤是否侵犯膀胱肌層分類，NMIBC 62例(54%)，MIBC 53例(46%)。根據(jù)2009年UICC膀胱癌TNM分期標準，pTa 17例(15%)，pT1 37例(32%)，pTis 8例(7%)，pT2 29例(25%)，pT3 20例(17%)，pT4 4例(3%)，pN1 9例(8%)，病理合并脈管癌栓9例(8%)。

2.2 CTCs檢測結(jié)果 對照組25例健康志愿者外周血皆未檢測到CTC。115例患者10 mL外周血中檢測CTC，93例(81%)患者CTC陽性，其中68例(59%)上皮型CTC陽性，76例(66%)混合型CTC陽性，43例(37%)間質(zhì)性CTC陽性。共檢測到622個CTC，中位數(shù)為6個(范圍：1～66個)，平均數(shù)為(5.56±8.17)個，其中上皮型173個(28%)，混合型322個(52%)，間質(zhì)型127個(20%)。

2.3 CTCs與病理分期相關(guān) 對照組、NMIBC、MIBC患者CTC陽性率與數(shù)量如圖2所示。NMIBC與MIBC患者體內(nèi)CTC陽性率與數(shù)量顯著高于對照組(P<0.001)。NMIBC患者外周血中，46例(74%)CTC陽性，32例(52%)上皮型CTC陽性，35例(56%)混合型CTC陽性，14例(23%)間質(zhì)性CTC陽性。MIBC患者外周血中，47例(89%)CTC陽性，36例(68%)上皮型CTC陽性，41例(77%)混合型CTC陽性，29例(55%)間質(zhì)性CTC陽性。MIBC患者外周血總CTC(P=0.049)、混合型CTC(P=0.018)與間質(zhì)性CTC(P<0.001)陽性率較NMIBC患者顯著升高，上皮型CTC未見顯著差異(P=0.076)。MIBC患者外周血總CTC數(shù)量(P<0.001)、混合型CTC數(shù)量(P<0.001)與間質(zhì)性CTC數(shù)量(P=0.002)較非肌層浸潤性膀胱癌顯著升高，上皮型CTC數(shù)量未見顯著差異(P=0.075)。

不同病理狀態(tài)與特征的CTC檢測陽性率如圖3 所示。對于NMIBC，pT1患者外周血CTC(P<0.001)、上皮型CTC(P=0.001)與混合型CTC(P<0.001)陽性率較pTa患者顯著升高，間質(zhì)性CTC(P=0.211)未見顯著差異。對于MIBC，不同病理分期(pT2、pT3、pT4)的CTC陽性率與各亞型CTC陽性率未見顯著差異。

病理證實腫瘤侵犯脈管系統(tǒng)(LVI+)的患者與未侵犯(LVI-)的患者CTC陽性率與各亞型CTC陽性率未見顯著差異。在接受根治性全膀胱切除術(shù)患者中，術(shù)后病理證實腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(pN+)與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(pN-)患者，CTC陽性率與各亞型CTC陽性率未見顯著差異。

表1 患者臨床資料

圖1 不同EMT分型CTC鏡下照片

DAPI：4′,6-diamidino-2-phenylindole；E：上皮RNA探針EpCAM，CK8/18/19；M：間質(zhì)RNA探針Twist、Vimentin；Merge：融合照。

圖2 對照組(健康志愿者)、非肌層浸潤性膀胱癌(pT<2)、肌層浸潤性膀胱癌(pT≥2)的外周血CTC陽性率與數(shù)量

A：肌層浸潤性膀胱癌患者外周血總CTC(P=0.049)、混合型CTC(P=0.018)與間質(zhì)性CTC(P<0.001)陽性率較非肌層浸潤性膀胱癌顯著升高，上皮型CTC未見顯著差異(P=0.076)；B、C、D、E：肌層浸潤性膀胱癌患者外周血總CTC(P<0.001)、混合型CTC(P<0.001)與間質(zhì)性CTC(P=0.002)數(shù)量較非肌層浸潤性膀胱癌顯著升高，上皮型CTC數(shù)量未見顯著差異(P=0.075)。

圖3 不同病理參數(shù)與其CTC陽性率比較

A：非肌層浸潤性膀胱癌中，固有層浸潤患者(pT1)外周血CTC(P<0.001)、上皮型CTC(P=0.001)與混合型CTC(P<0.001)陽性率較腫瘤局限黏膜層患者(pTa)顯著升高，間質(zhì)性CTC(P=0.211)未見顯著差異；B：肌層浸潤性膀胱癌中，不同病理分期(pT2、pT3、pT4)CTC陽性率未見顯著差異；C：脈管系統(tǒng)侵犯(LVI+)患者與未侵犯(LVI-)患者CTC陽性率未見顯著差異；D：接受根治性全膀胱切除患者，術(shù)后病理證實腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(pN+)與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(pN-)患者，CTC陽性率未見顯著差異。

3 討 論

約50%的肌層浸潤性膀胱癌在術(shù)前即發(fā)生微轉(zhuǎn)移，利用精準檢測技術(shù)提前預(yù)判微轉(zhuǎn)移灶，為臨床干預(yù)提供指導(dǎo)是目前研究的熱點[3]。CTC檢測技術(shù)被廣泛應(yīng)用于各種實體瘤的診斷、治療監(jiān)測及轉(zhuǎn)移預(yù)測中。然而在膀胱癌中，有關(guān)CTC的研究較少，應(yīng)用較局限，結(jié)論仍有爭議。MSAOUEL和KOUTSILIERIS[10]對于膀胱癌中CTC的研究進行薈萃分析，發(fā)現(xiàn)膀胱癌患者外周血可以較敏感的檢測到CTC，而晚期膀癌患者體內(nèi)可檢出CTC數(shù)量顯著較高。目前對于膀胱癌中CTC的研究主要局限于應(yīng)用CellSearch?系統(tǒng)。在NMIBC中，GAZZANIGA等[11]報道了對44例NMIBC進行外周血CTC檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CTC陽性的患者術(shù)后復(fù)發(fā)間隔時間顯著較短，且與病理混合原位癌及較高T分期相關(guān)。GRADILONE等[12]發(fā)現(xiàn)對于T1G3的膀胱腫瘤，外周血所檢測到的CTC多表達Survivin，且CTC陽性的患者無疾病生存期顯著較短。對于非轉(zhuǎn)移性MIBC，RINK等[13]研究表明在全膀胱術(shù)前CTC陽性的患者預(yù)后顯著較差，然而CTC數(shù)量與病理分期無顯著相關(guān)。FLAIG等[6]研究證明對于轉(zhuǎn)移性膀胱癌，CTC陽性的患者預(yù)后顯著較差，而對于局限性MIBC，CTC與預(yù)后及病理分期無顯著關(guān)聯(lián)。以上研究都旨在探索CTC對于膀胱癌的分期與預(yù)后的指導(dǎo)作用，然而收到樣本量、隊列設(shè)計等限制，未證明腫瘤肌層浸潤與CTC的相關(guān)性。

在膀胱腫瘤中，EMT被認為是腫瘤轉(zhuǎn)移重要的環(huán)節(jié)[4-6]。如何通過評價CTC的EMT表型成為了目前研究的熱點。TODENH?FER等[15]通過對CTC分離并提取mRNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA，并通過PCR檢測cDNA中EMT相關(guān)基因(PI3Kα、Twist1和AKT2)發(fā)現(xiàn)，EMT相關(guān)基因表達與臨床分期相關(guān)，且常表達于上皮類標記物陰性患者。此結(jié)果提示在CTC中，EMT相關(guān)基因有表達，且表達具有一定特征性，為后續(xù)在CTC單細胞水平進行EMT表達檢測提供了基礎(chǔ)。

本研究立足于改良的CanPatrolTM技術(shù)，將上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)通路相關(guān)基因RNA探針整合入CTC檢測中，在前期其他實體瘤檢測中取得了良好的效果[9,16]。本研究首次在膀胱腫瘤患者外周血內(nèi)檢測分離CTC，并在CTC單細胞水平進行EMT相關(guān)基因表達進行檢測。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過CanPatrolTM法分離并進行EMT分型可較敏感的分離出膀胱腫瘤患者外周血內(nèi)的CTC細胞。對照組健康志愿者無一例檢出CTC，符合實驗預(yù)期，無假陽性結(jié)果。

本研究旨在探討外周血CTC與EMT表型對于膀胱腫瘤分期，尤其是腫瘤肌層浸潤的相關(guān)性與指導(dǎo)作用。因此本研究隊列納入臨床診斷為高危的膀胱腫瘤，臨床分期cT1～4aN0M0。115例患者術(shù)后病理為pTa～4aN0～1M0，95%為高級別尿路上皮癌，符合實驗隊列設(shè)計預(yù)期。所有患者CTC檢測的總陽性率為81%，高于其他研究報道，可能的原因為CellSearch?系統(tǒng)利用上皮標記物EpCAM作為CTC標記物，導(dǎo)致一部分高表達間質(zhì)標記物而低或無表達EpCAM的CTC細胞將不被CellSearch?系統(tǒng)識別，而CanPatrolTM系統(tǒng)可將此類CTC細胞標記識別，并引起CTC檢測陽性率升高。YU等[5]在乳腺癌中報道了CTC存在EMT動態(tài)變化的現(xiàn)象，并發(fā)現(xiàn)存在部分CTC細胞僅表達間質(zhì)相關(guān)基因，證明了僅將上皮標記物EpCAM陽性作為CTC的篩選標記物是不足的。TODENH?FER等[15]的研究結(jié)果揭示了存在一部分高表達PI3Kα、TWIST1和AKT2的CTC細胞，且這部分細胞常低或無表達上皮標記物，佐證了我們的觀點。

對CTC進行EMT分型后，上皮型CTC陽性率為59%，混合型CTC陽性率為66%，與通過CellSearch?系統(tǒng)檢測的結(jié)果相接近。在檢測出的622個CTC細胞中，上皮標記物陽性(上皮型和混合型)的CTC占80%。結(jié)果表明在CTC中，大多數(shù)細胞呈上皮表型或表達上皮相關(guān)基因，結(jié)果符合腫瘤轉(zhuǎn)移EMT理論[5-6]。37%的患者間質(zhì)性CTC陽性，間質(zhì)型CTC占所有檢出CTC的20%，結(jié)果證明了在膀胱腫瘤患者外周血中，存在其他研究中報道的僅表達間質(zhì)標記物的CTC細胞。

根據(jù)最終病理結(jié)果中腫瘤是否侵犯肌層，研究隊列中54%為NMIBC，46%為MIBC。結(jié)果提示MIBC外周血CTC陽性率與數(shù)量顯著高于NMIBC，其中間質(zhì)標記物陽性(混合型與間質(zhì)型)CTC陽性率與數(shù)量較NMIBC患者顯著升高，結(jié)果提示對于高病理分期的腫瘤，其CTC在EMT表型上也有不同。有文獻報導(dǎo)，在乳腺癌、胃癌等其他實體腫瘤中，間質(zhì)表達陽性的CTC與腫瘤高分期、預(yù)后較差相關(guān)。在膀胱腫瘤中，EMT通路的激活與腫瘤細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化與腫瘤浸潤肌層密切相關(guān)。在臨床上，MIBC的預(yù)后顯著較NMIBC差，MIBC的患者常發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，而90%的NMIBC的患者不會發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果在CTC層面驗證了膀胱腫瘤浸潤肌層后，其微轉(zhuǎn)移病灶陽性比率與數(shù)量顯著升高，為后續(xù)研究提供了方向。

本研究結(jié)果表明對于NMIBC的患者，pT1期患者外周血CTC與上皮標記物陽性(上皮型與混合型)CTC檢出陽性率顯著高于pTa期患者。pT1期膀胱癌有10%～20%會復(fù)發(fā)、進展為浸潤性癌，此類患者易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，而pTa期患者進展率較低，極少發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，研究結(jié)果在CTC層面解釋了不同分期的預(yù)后差別。而對于MIBC患者，研究未發(fā)現(xiàn)不同病理分期的CTC陽性率差異，可能的原因為：對于MIBC患者，CTC陽性率較高，在樣本量限制條件下，難以獲得統(tǒng)計學上顯著差異。

對于病理發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤侵犯脈管的患者，本研究未發(fā)現(xiàn)CTC陽性率升高，其可能的原因為：腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機制與血性轉(zhuǎn)移機制不同，無法應(yīng)用CTC來評估淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。

本研究通過對于較大樣本的CTC檢測與EMT分型，驗證了通過CanPatrolTM系統(tǒng)可較敏感的檢測出膀胱癌患者循環(huán)腫瘤細胞。CTC細胞數(shù)量與表達間質(zhì)型表型RNA陽性的細胞數(shù)量可能與腫瘤肌層浸潤相關(guān)，提示EMT與膀胱腫瘤肌層浸潤可能存在相關(guān)性。本研究僅為單中心回顧性研究，循證證據(jù)級別有限，且因隨訪時間限制未獲得生存相關(guān)數(shù)據(jù)。但我們認為研究結(jié)果為進一步探索CTC單細胞層面EMT表型與膀胱腫瘤預(yù)后，以及研究腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移機制奠定了基礎(chǔ)，有重要的臨床與研究意義。研究組已開展前瞻性研究，針對患者預(yù)后判斷、治療監(jiān)測等進行進一步研究。

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(編輯 王 瑋)

Novelcirculating tumor cells enumeration and epithelial/mesenchymal probe marking technique in the treatment of bladder cancer

ZHANG Rui-yun，JIN Di，CAO Ming，CHEN Hai-ge，XUE Wei，HUANG Yi-ran

(Department of Urology，Renji Hospital,School of Medicine,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200127，China)

Objective To explore the diagnostic use of novel circulating tumor cells (CTCs) enumeration and epithelial/mesenchymal probe marking technique in bladder urothelial cancer (BCa)，and to analyze the correlation between CTCs and pathological outcomes.Methods A total of 115 patients with primary diagnosed bladder carcinoma (cT1～4aN0M0) treated during May 2015 and Oct. 2015 were included，and another 25 healthy volunteers served as controls. CTCs were separated with modified CanPatrolTMSystem. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) was performed with epithelial tumor cells (Epi+) specific probes (EpCAM，CK8/18/19) and mesenchymal tumor cells (Mes+) specific probe (Twist，Vimentin) on isolated CTCs.Results CTCs were positive in 93 patients (81%) with BCa，while all negative (0%，0) in healthy controls (P<0.001). In RNA-ISH assay，we observed that patients with muscle invasive bladder cancer had significantly higher positive rates of CTCs (P=0.049)，Epi+Mes+ CTCs (P=0.018) and Epi-Mes+ CTCs (P<0.001) compared with non-muscle invasive bladder cancer. Further analysis showed that the pT1 patients had significantly higher positive rate of CTCs (P<0.001)，Epi+Mes-CTCs (P=0.001) and Epi+Mes+ CTCs (P<0.001) than pTa patients.Conclusion The novel CTCs enumeration and RNA-ISH based epithelial/mesenchymal probe marking technique could be a sensitive detection method for patients with bladder cancer. The increase of Mes+CTCs might be associated with muscle invasion，which suggested EMT could be related with invasion and metastasis in muscle invasive bladder cancer.

bladder cancer; circulating tumor cell; epithelial mesenchymal transition; tumor invasion; RNA-ISH

2016-09-18

2016-10-18

上海市自然科學基金(No.16ZR1420300)，國家自然科學基金(No.81402084，81472378，81272841)

黃翼然，教授.E-mail：hyrrenji2@aliyun.com

張瑞赟(1990-)，男(漢族)，博士在讀.研究方向為泌尿系腫瘤.E-mail：zhangruiyun4337@163.com

R737

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2016.12.003