產(chǎn)β-葡萄糖苷酶芽孢桿菌降解豆粕的發(fā)酵條件優(yōu)化及抗?fàn)I養(yǎng)因子測定

■姜婷婷 王奕丁 王 全* 朱寶成

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定071001；2.新疆師范大學(xué)地理科學(xué)與旅游學(xué)院，新疆烏魯木齊830045）

豆粕是畜牧養(yǎng)殖業(yè)中使用最為廣泛的一種優(yōu)質(zhì)植物性蛋白源。豆粕的營養(yǎng)成分主要有蛋白質(zhì)(40%～44%)、脂肪(1%～2%)、碳水化合物(10%～15%)；另外，豆粕中含有多種礦物質(zhì)、維生素和必需氨基酸，營養(yǎng)成分比較齊全且種類均衡；此外，豆粕中還含有異黃酮、磷脂等生物活性物質(zhì)，是飼料業(yè)中應(yīng)用最為廣泛的植物性蛋白原料。然而，和眾多植物型蛋白源的性質(zhì)一樣，豆粕中也存在多種抗?fàn)I養(yǎng)因子(如大豆球蛋白、β-聚球蛋白、胰蛋白酶抑制因子、糜蛋白酶抑制因子、熱穩(wěn)定大豆寡糖等)。他們的存在一方面使得豆粕的消化率和動物的吸收率下降；另一方面，對動物體內(nèi)的某些器官造成了損傷。

豆粕經(jīng)過微生物發(fā)酵，產(chǎn)品中含有大量的有益微生物，而發(fā)酵過程產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物以及對發(fā)酵底物的降解作用，使得發(fā)酵豆粕的成分非常復(fù)雜，改善了大豆蛋白的品質(zhì)。一般情況下，采用生物活性較強(qiáng)的有益菌進(jìn)行豆粕的發(fā)酵，因為這些有益菌在代謝過程中產(chǎn)生的多種活性物質(zhì)可改善豆粕的飼用特性，進(jìn)而提高動物對飼料的利用率。

β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase），是纖維素分解酶系中的重要組成成分之一。研究表明，微生物發(fā)酵法是去除豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子（如大豆球蛋白、β-聚球蛋白、胰蛋白酶抑制因子、糜蛋白酶抑制因子、熱穩(wěn)定大豆寡糖等）的有效方法之一，而且發(fā)酵產(chǎn)品中含有蛋白酶、益生菌、有機(jī)酸及小分子肽等未知生長因子。本試驗通過單因素試驗選定了產(chǎn)β-葡萄糖苷酶芽孢桿菌菌株的最適培養(yǎng)基，從而用產(chǎn)β-葡萄糖苷酶芽孢桿菌菌株發(fā)酵液發(fā)酵豆粕，對豆粕發(fā)酵產(chǎn)物的多項指標(biāo)進(jìn)行了對比，以期為更好地開發(fā)利用豆粕這種優(yōu)質(zhì)植物蛋白提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

具有較高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活性的菌株Z-1作為目的菌株，進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2 培養(yǎng)基及配制

1.2.1 斜面培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）

稱量去皮馬鈴薯200 g，將土豆切成小塊，放入鍋中，加水1.00 L，煮沸30 min。用紗布濾去土豆殘渣。將土豆濾液放回鍋中，加入瓊脂20.00 g，加熱溶化，加入葡萄糖20.00 g。葡萄糖溶解后，加入適量的水以補(bǔ)充加熱過程中損失的水分，定容至1.00 L（115℃蒸氣滅菌20 min）。

1.2.2 種子培養(yǎng)基

稱取牛肉膏3.00 g、蛋白胨10.00 g、氯化鈉5.00 g，加入蒸餾水定容至1.00 L，調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4（115℃蒸氣滅菌20 min）。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

根據(jù)試驗需要配制培養(yǎng)基或在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加C源、N源或無機(jī)鹽配制培養(yǎng)基。

1.3 試驗方法

1.3.1 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株斜面的制作

將PDA培養(yǎng)基融化分裝試管，在實驗臺上放1支長0.5～1 m左右的木條，厚度為1 cm左右。將試管頭部枕在木條上，使管內(nèi)培養(yǎng)基自然傾斜，凝固后即成斜面培養(yǎng)基。將產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株接種到斜面上，37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。

1.3.2 種子培養(yǎng)

① 將配制的種子培養(yǎng)基，裝入250 ml三角瓶中。濕熱滅菌，121℃、20 min。

②取適量無菌水（5 ml）倒入菌斜面并用接種針刮取菌種接種于裝有種子培養(yǎng)基的三角瓶中，振蕩均勻制成菌懸液。200 r/min、36～37℃，搖床培養(yǎng)14 h后使用。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)

①配制發(fā)酵培養(yǎng)基。根據(jù)試驗需要配制培養(yǎng)基，單因素改變C源、N源、無機(jī)鹽等條件。

②將配制好的發(fā)酵培養(yǎng)基裝入250 ml三角瓶中，裝量為50 ml，調(diào)節(jié)pH值至7.2，濕熱滅菌，121℃、20 min。

③用滅菌的移液管將培養(yǎng)好的液體菌種按6%的接種量接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中。振蕩均勻制成菌懸液。在200 r/min、30℃條件下，搖床培養(yǎng)48 h。

1.3.4 最適碳源的測定

配制7種不同碳源的發(fā)酵液：分別以1.0%的可溶性淀粉、麥芽糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、糊精、玉米粉作為發(fā)酵液的不同碳源；1%的蛋白胨作為氮源；0.05%MgSO4·7H2O，0.02%CaCl2作為無機(jī)鹽；0.4%NaH2PO4·2H2O，0.2%Na2HPO4·2H2O。

1.3.5 最適氮源的測定

配制7種不同氮源的發(fā)酵液：分別以1.0%的尿素、黃豆餅粉、大豆蛋白胨、蛋白胨、酪蛋白胨、酵母浸粉、硫酸銨作為發(fā)酵液的不同氮源，碳源為上述試驗測出的最適碳源，含量為1.0%；0.05%MgSO4·7H2O和0.02%CaCl2作為無機(jī)鹽；0.4%NaH2PO4·2H2O，0.2%Na2HPO4·2H2O。

1.3.6 最適無機(jī)鹽的測定

配制6種不同無機(jī)鹽的發(fā)酵液：分別以0.05%ZnSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、NaCl、MgSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、CaCl2作為發(fā)酵液的不同無機(jī)鹽，使用前兩步測定出的最適碳源和最適氮源，且含量均為1.0%。

1.3.7 正交試驗Ⅰ

配制16種不同濃度的發(fā)酵液：使用上述試驗所測定出的最適碳源、氮源、無機(jī)鹽配制不同濃度的發(fā)酵液，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)（具體配方如表1所示）。

表1 正交試驗設(shè)計Ⅰ(%)

1.3.8 正交試驗Ⅱ

配制9種相同的發(fā)酵液，以最適碳源、氮源、無機(jī)鹽，按照正交試驗Ⅰ所得結(jié)果配制培養(yǎng)基，滅菌前用pH計調(diào)整起始pH值分別為6.0、7.0、8.0，然后接種不同量的種子液，接種量分別為3%、6%、9%，最后進(jìn)行不同的搖床培養(yǎng)時間測定，培養(yǎng)時間分別為48、72、96 h（具體配方如表2所示）。

表2 正交試驗設(shè)計Ⅱ

1.3.9 酶活性測定

①水楊苷檸檬酸緩沖液：取檸檬酸2.10 g，溶解，定容至100 ml；稱取檸檬酸鈉1.47 g，定容至50 ml，取檸檬酸溶液57 ml，檸檬酸鈉溶液43 ml，混溶。再向混合溶液中加入0.50 g水楊苷，混勻，得到水楊苷檸檬酸緩沖液。

② DNS法測定酶活力(5.00 ml體系)：在EP管加入1.50 ml 0.500%水楊苷檸檬酸緩沖液（pH值為4.5），并向另一管中加入1.50 ml的DNS鈍化酶的活性作為空白對照。各管同時在50℃水浴中預(yù)熱5～10 min，再加入0.50 ml酶液（粗酶液），50℃水浴保溫30 min。取出各管（除空白外）加入1.50 ml DNS以終止酶反應(yīng)，充分搖勻后沸水浴5 min，取出后定容至5.00 ml，充分混勻，在OD540波長下測吸光光度值。參照所測得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=3.384 8x+0.082 2(R2=0.994 4)。酶活定義：一定條件下，每分鐘每毫升酶液由底物產(chǎn)生1.00 μmol葡萄糖所需要的酶量定義為一個酶活單位(IU)，用U/ml表示。

式中：A——樣品的吸光度對應(yīng)的葡萄糖的數(shù)值；

V——反應(yīng)溶液的總體積(ml)；

n——粗酶液的稀釋倍數(shù)；

t——反應(yīng)時間（min）；

m——酶體積（ml）。

1.3.10 豆粕和發(fā)酵豆粕的感官指標(biāo)

① 活菌計數(shù)：將發(fā)酵液進(jìn)行10-5、10-6、10-7梯度稀釋，涂平板，37℃恒溫培養(yǎng)48 h，計數(shù)。

②選擇顏色正常，質(zhì)量較好的豆粕，用上述正交試驗中最優(yōu)的培養(yǎng)基進(jìn)行種子發(fā)酵，將10 ml發(fā)酵液接入到豆粕中發(fā)酵豆粕，進(jìn)行發(fā)酵處理。將發(fā)酵好的豆粕作為試驗材料，進(jìn)行營養(yǎng)成分分析。

1.3.11 豆粕發(fā)酵前后產(chǎn)物分析

抗?fàn)I養(yǎng)因子通過尿素酶活性進(jìn)行考察。

①試樣的制備。用粉碎機(jī)將10 g試樣粉碎，使之全部通過樣品篩（孔徑100 μm）。

② 試劑的制備。0.1 mol/l鹽酸：取0.90 ml濃鹽酸稀釋到1 000 ml。棉籽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：取0.04 g棉籽糖用水溶解并定容至4.00 ml。

③測定步驟。將取約0.20 g已粉碎的試樣，精確至0.10 mg，轉(zhuǎn)入試管中，移入10.00 ml尿素緩沖液，立即蓋好試管并劇烈搖動，馬上至于(50±0.5)℃恒溫水浴中，準(zhǔn)確計時保持30 min，即刻移入10.00 ml HCl溶液迅速冷卻至20℃，將試管內(nèi)容物全部轉(zhuǎn)入燒杯中，用5.00 ml水沖洗試管兩次，方可用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH值4.7。

另取試管作空白試驗，移入10.00 ml尿素緩沖液，10.00 ml HCl溶液，稱取與上述試樣量相當(dāng)?shù)脑嚇?，精確至0.10 mg，迅速加入試管中，其余操作步驟同上。

④計算結(jié)果

以每分鐘每克大豆制品釋放氨的毫克量表示的尿素酶活力(U)。

式中：C——NaOH標(biāo)液的摩爾濃度(mol/l)；

V0——空白NaOH的體積(L)；

V——試樣消耗NaOH的體積(L)；

m——試樣質(zhì)量(g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適碳源測定

不同碳源對產(chǎn)β-葡萄糖苷酶芽孢桿菌菌株的生長具有一定影響，如表3所示。

表3 不同碳源對產(chǎn)β-葡萄糖苷酶芽孢桿菌生長的影響

由表3可以看出：發(fā)酵液中的碳源為乳糖和玉米粉時培養(yǎng)效果較好，尤以糊精最好?？赡苁怯捎谠摼鷮Σ煌荚吹睦们闆r不同。考慮到成本問題，還有酶活力大小的問題，故最終確定以糊精作為最佳碳源。

2.2 最適氮源測定

不同氮源對產(chǎn)β-葡萄糖苷酶芽孢桿菌菌株的生長具有一定影響，如表4所示。

由表4可以看出：不同的氮源對產(chǎn)β-葡萄糖苷酶芽孢桿菌影響較大，不同氮源對酶活影響差異較大。其中，當(dāng)發(fā)酵液中氮源為尿素和硫酸銨時培養(yǎng)效果較好，氮源為蛋白胨時效果最好，而且比其他氮源培養(yǎng)出的酶活明顯高出很多，故選擇蛋白胨作為最佳氮源。

表4 不同氮源對產(chǎn)β-葡萄糖苷酶芽孢桿菌生長的影響

2.3 最適無機(jī)鹽測定

不同無機(jī)鹽對產(chǎn)β-葡萄糖苷酶芽孢桿菌菌株的生長具有一定影響，如表5所示。

表5 不同無機(jī)鹽對產(chǎn)β-葡萄糖苷酶芽孢桿菌生長的影響

從表5中數(shù)據(jù)我們可以看出，無機(jī)鹽為CuSO4·5H2O和FeSO4·7H2O時酶活力較大。說明Cu2+和Fe2+對該菌生長發(fā)育更為重要，推測由于菌株產(chǎn)生的物質(zhì)為蛋白類物質(zhì)，Cu2+和Fe2+在該類蛋白質(zhì)發(fā)揮酶活性作用時充當(dāng)輔酶，起到了一定的激活作用。

2.4 培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果

不同濃度組合的培養(yǎng)基對產(chǎn)β-葡萄糖苷酶芽孢桿菌菌株的生長具有一定影響，如表6所示。

表6 不同濃度組合的培養(yǎng)基對產(chǎn)β-葡萄糖苷酶芽孢桿菌的生長的影響

由表6可以看出：最佳搭配為糊精5.0%、蛋白胨1.0%、Cu2+0.1%、Fe2+0.01%。

2.5 培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果

不同發(fā)酵條件組合的培養(yǎng)基對產(chǎn)β-葡萄糖苷酶芽孢桿菌菌株的生長具有一定影響，測定結(jié)果如表7所示。

表7 不同發(fā)酵條件組合培養(yǎng)基對產(chǎn)β-葡萄糖苷酶芽孢桿菌生長的影響

由表7可以看出：最佳搭配為培養(yǎng)時間為72 h、接種量3%、pH值為7.0。

2.6 發(fā)酵培養(yǎng)

用優(yōu)化好的發(fā)酵條件即糊精5.0%、蛋白胨1.0%、Cu2+0.1%、Fe2+0.01%，接種量為3%、pH值為7.0的情況下培養(yǎng)72 h，所得酶活力為0.721 1 U/ml，比優(yōu)化前（0.532 1 U/ml）提高了35.5%。

2.7 發(fā)酵豆粕感官指標(biāo)

用優(yōu)化好的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件對豆粕進(jìn)行發(fā)酵，從色澤上來看，未發(fā)酵的豆粕呈黃色，發(fā)酵的豆粕呈深黃褐色；從氣味來看，未發(fā)酵的豆粕有大豆香味，發(fā)酵豆粕帶有濃芳香的酸味。

2.8 抗?fàn)I養(yǎng)因子

用優(yōu)化好的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件對豆粕進(jìn)行發(fā)酵，測定發(fā)酵前后豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子即尿素酶的酶活力，結(jié)果如表8所示。

表8 發(fā)酵豆粕前后的尿素酶酶活力[mg/(g·min)]

由表8可以看出，經(jīng)過菌株Z-1發(fā)酵后的豆粕，尿素酶酶活力下降了61.6%，豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子是通過尿素酶的酶活力來考察的，因此發(fā)酵后的豆粕抗?fàn)I養(yǎng)因子明顯下降。

3 結(jié)論

本試驗得到產(chǎn)β-葡萄糖苷酶較高活性的菌株Z-1的最佳發(fā)酵條件，產(chǎn)酶活性提高了35.5%。用得到的最優(yōu)發(fā)酵條件對豆粕進(jìn)行了發(fā)酵，使得豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子減少了61.6%。研究為該菌早日進(jìn)入工業(yè)生產(chǎn)奠定了一定的理論基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步探索該菌的工業(yè)發(fā)酵條件提供了技術(shù)支持。