飼料中添加谷氨酰胺對(duì)草魚腸道形態(tài)與抗病能力的影響

■余登航 常家智 劉 軍

(武漢輕工大學(xué)，湖北武漢430023)

谷氨酰胺（glutamine，Gln）是谷氨酸的一種酰胺，具有許多重要的生理功能，如參與動(dòng)物體內(nèi)氨和氮的運(yùn)輸、提高動(dòng)物體內(nèi)消化道的生長(zhǎng)以及增強(qiáng)動(dòng)物腸道黏膜屏障等[1]。在哺乳動(dòng)物中的研究表明，飼料中添加適量的Gln可以顯著增加腸道絨毛高度、降低腸黏膜通透性等作用[2-3]。在水生動(dòng)物上的研究同樣發(fā)現(xiàn)，飼料中添加Gln可以顯著增強(qiáng)腸道抗病能力[4]。

草魚（Ctenopharyngodon idellus），因其生長(zhǎng)迅速，在全國(guó)各地被廣泛養(yǎng)殖。然而，目前為止，關(guān)于Gln對(duì)草魚腸道形態(tài)及抗病能力方面的研究鮮有報(bào)道。因此，本論文擬通過在草魚飼料中添加適量的谷氨酰胺，探討其對(duì)草魚的腸道形態(tài)與抗病能力的作用，為草魚飼料配方的優(yōu)化升級(jí)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

以魚粉、豆粕、豆油、小麥粉、維生素以及礦物質(zhì)等原料配制成粗蛋白含量為40.6%、粗脂肪含量為5.0%、粗灰分含量為8.4%的基礎(chǔ)飼料（對(duì)照組飼料），參照Lin等[5]的描述在基礎(chǔ)飼料中添加1.2%的谷氨酰胺（替代等量小麥粉）配制試驗(yàn)飼料（Gln組）。手工將飼料原料混合均勻，制成直徑2.0 mm的顆粒飼料，45℃恒溫干燥，使飼料水分含量小于10%，然后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)魚與飼養(yǎng)

試驗(yàn)草魚購(gòu)于武漢市柏泉農(nóng)場(chǎng)草魚養(yǎng)殖基地，并在武漢市水產(chǎn)科學(xué)研究所的養(yǎng)殖基地中完成養(yǎng)殖試驗(yàn)。在養(yǎng)殖基地暫養(yǎng)2周后，將規(guī)格一致的草魚（7 g/尾左右）隨機(jī)分配到6個(gè)網(wǎng)箱中（1 m×1 m×1 m），試驗(yàn)設(shè)置為兩個(gè)組（對(duì)照組和Gln組），對(duì)照組投喂基礎(chǔ)飼料，Gln組投喂試驗(yàn)組飼料，每組飼料設(shè)置三個(gè)重復(fù)，每個(gè)網(wǎng)箱30尾，每日投喂兩次，每餐飽食投喂。養(yǎng)殖周期為35 d，養(yǎng)殖周期內(nèi)，水溫為25～30℃，pH值約為8，溶氧約為7.7 mg/l。

1.3 樣品采集

于養(yǎng)殖周期第28 d在每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)選取6尾草魚稱重并分離腸道，將腸道分段（前腸、中腸、后腸），固定于多聚甲醛固定液中，經(jīng)脫水、浸蠟、包埋以及切片等處理，蘇木精-伊紅染色,在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察、取圖和拍照，測(cè)量草魚腸道黏膜的絨毛高度、皺褶深度和肌層厚度，其平均數(shù)作為測(cè)定數(shù)據(jù)。然后將余下的草魚在MS-222溶液（濃度為60 mg/l）中浸泡10 min麻醉后，根據(jù)趙杰等[6]的描述肛門注射0.05 ml TNBS乙醇混合溶液（濃度為2.5%）誘導(dǎo)草魚腸道炎癥，于注射后第1、3、7 d觀察、解剖并記錄魚體運(yùn)動(dòng)，體表?yè)p傷以及腸道損傷情況，每次每個(gè)網(wǎng)箱隨機(jī)選取6尾魚，具體評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 肛門灌注TNBS乙醇混合液后草魚大體形態(tài)與組織損傷評(píng)分[6]

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS16.0軟件包(SPSS，Michigan Av?enue，Chicago，IL，USA)進(jìn)行方差分析，用Tukey’s單因素方差分析法檢驗(yàn)組間差異，P＜0.05表示有顯著性差異，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

經(jīng)過28 d的喂養(yǎng)，對(duì)照組草魚增重為6.06 g/尾，Gln組草魚魚體增重6.45 g/尾，兩組之間沒有顯著差異(見表 2)。

表2 Gln對(duì)草魚生長(zhǎng)的影響（g/尾）

2.1 飼料中添加谷氨酰胺對(duì)草魚腸道形態(tài)的影響（見表3～表5）

表3 Gln對(duì)草魚前腸形態(tài)的影響（μm）

表4 Gln對(duì)草魚中腸形態(tài)的影響（μm）

表5 Gln對(duì)草魚后腸形態(tài)的影響（μm）

由表3可見，Gln組草魚前腸的絨毛高度（525.72 μm）與皺褶深度（388.90 μm）要高于對(duì)照組草魚前腸絨毛高度（458.94 μm）與皺褶深度（317.91 μm），且差異顯著（P＜0.05），而肌層厚度沒有顯著增加。

由表4、5可見，Gln組草魚中腸絨毛高度(340.00 μm)和后腸絨毛高度（290.02 μm）顯著高于對(duì)照組草魚（P＜0.05），而皺褶深度和肌層厚度有所增加但與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 飼料中添加谷氨酰胺對(duì)TNBS誘導(dǎo)的草魚炎性損傷臨床癥狀的影響（見表6）

表6 Gln對(duì)TNBS誘導(dǎo)的草魚炎性損傷臨床癥狀影響（評(píng)分）

由表6可見，肛門注射TNBS乙醇混合溶液后各組草魚均出現(xiàn)臨床癥狀，癥狀于第3 d最為嚴(yán)重，隨后于第7 d緩解。與對(duì)照組相比，飼料中添加Gln可以緩解TNBS誘導(dǎo)的草魚損傷的臨床癥狀。

3 討論

魚類腸道不僅是消化、吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要器官，而且是魚體抵抗疾病的第一道防線，其生長(zhǎng)發(fā)育的主要能量不是葡萄糖而是主要靠Gln提供，并且Gln的利用消耗主要在腸道中完成[7-8]。已有研究表明，Gln對(duì)魚類腸道形態(tài)具有積極作用。葉沙舟等[4]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加Gln可顯著增加黃顙魚幼魚腸道的絨毛高度和褶皺深度，對(duì)維持黃顙魚幼魚的腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性具有重要意義。Lin等[5]發(fā)現(xiàn)飼料中添Gln不僅可以增加建鯉幼魚腸絨毛高度而且可以提高鈉鉀ATP酶和堿性磷酸酶的活性。本試驗(yàn)結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)，飼料中添加Gln可維持腸道形態(tài)，增加腸道絨毛高度和褶皺深。

本研究采用肛門注射TNBS乙醇混合溶液誘導(dǎo)草魚腸道炎性損傷，并通過觀察臨床癥狀來探討飼料中添加Gln對(duì)草魚腸道抗病能力的影響。研究發(fā)現(xiàn)，TNBS作為一種半抗原需要進(jìn)入腸道組織與組織蛋白結(jié)合才能形成抗原物質(zhì)，刺激免疫細(xì)胞，觸發(fā)肌體免疫反應(yīng)，引起機(jī)體炎癥反應(yīng)[9]，而使用乙醇來提高腸道通透性是TNBS進(jìn)入腸道與組織蛋白結(jié)合的重要條件[10]，可以增強(qiáng)TNBS的致炎作用[11]。趙杰等[6]研究發(fā)現(xiàn)對(duì)草魚肛門注射TNBS可以誘導(dǎo)草魚出現(xiàn)游動(dòng)有緩慢、體表充血、腸道充血以及腸道末端糜爛等臨床癥狀。而在本研究中也發(fā)現(xiàn)，草魚肛門注射TNBS乙醇混合溶液后，各組草魚都出現(xiàn)一定的上述癥狀。但是對(duì)照組草魚臨床癥狀明顯比Gln組草魚嚴(yán)重。這可能與Gln可以維持腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性，降低了TNBS進(jìn)入腸道與組織蛋白結(jié)合發(fā)揮抗原作用有關(guān)。已有大量研究報(bào)道，飼料中添加適量的Gln可以通過維持腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性，來防止腸腔內(nèi)的細(xì)菌和毒素等有害物質(zhì)通過腸黏膜進(jìn)入腸道及血液循環(huán)到達(dá)其他器官[12-13]。

4 結(jié)論

飼料中添加谷氨酰胺在不影響草魚生長(zhǎng)的前提下，可顯著增加前、中和后腸絨毛高度、皺褶深度和肌層厚度并且可有效緩解TNBS誘導(dǎo)的草魚損傷臨床癥狀。