蛋白包覆微晶固定化脂肪酶的制備及催化合成生物柴油的研究

馬 麗，魏佳奧，周麗亞，馮 凱，趙東磊

（1.河北工業(yè)大學(xué) 化工學(xué)院，天津 300130；2.伯明翰大學(xué) 化學(xué)院，英國 伯明翰 B152TT；3.河北工業(yè)大學(xué) 城市學(xué)院，天津 300130）

蛋白包覆微晶固定化脂肪酶的制備及催化合成生物柴油的研究

馬 麗1，魏佳奧2，周麗亞1，馮 凱1，趙東磊3

（1.河北工業(yè)大學(xué) 化工學(xué)院，天津 300130；2.伯明翰大學(xué) 化學(xué)院，英國 伯明翰 B152TT；3.河北工業(yè)大學(xué) 城市學(xué)院，天津 300130）

研究了蛋白包覆微晶固定化脂肪酶（PCMC）的制備和性質(zhì)，并用于催化麻瘋樹油合成生物柴油．研究表明：以K2SO4為賦形劑、丙酮為脫水劑制備固定化脂肪酶PCMC，在40℃異辛烷中浸泡72 h后，PCMC活性可保持初始活性的70%；在80℃的異辛烷中浸泡4 h后，PCMC活性為初始活性的81%；通過催化月桂酸與正辛醇的酯化反應(yīng)，考察了脂肪酶PCMC的酯化性能，重復(fù)使用9次后，月桂酸轉(zhuǎn)化率可保持在61%以上．并進一步優(yōu)化了脂肪酶PCMC催化麻瘋樹油制備生物柴油的反應(yīng)條件，正己烷為溶劑，麻瘋樹油與正己烷物質(zhì)的量之比為1∶2，醇油比為4∶1，酶用量為20%（基于麻瘋樹油質(zhì)量），反應(yīng)溫度為50℃，反應(yīng)時間12 h．在該條件下，生物柴油的最高產(chǎn)率為94%．

蛋白包覆微晶；固定化；脂肪酶；麻瘋樹油；生物柴油

酶作為一種高效、綠色的生物催化劑受到越來越多的關(guān)注，而固定化酶技術(shù)可以提高酶的活性和穩(wěn)定性，增加酶的重復(fù)使用穩(wěn)定性，提高底物和產(chǎn)物的傳質(zhì)效率[1-2]．但載體的使用，增加了固定化酶的成本；同時，載體的制備時間長、操作復(fù)雜，對實驗設(shè)備要求較高，這些原因都影響了固定化酶在工業(yè)生產(chǎn)中的進一步應(yīng)用[3-5]．因此，研究一種高效、廉價、快速的固定化酶方法至關(guān)重要．蛋白包覆微晶技術(shù)利用酶分子與可結(jié)晶物質(zhì)脫水析出，得到固定化酶，既保留了酶的高活性，同時制備方法更為簡便，展現(xiàn)了巨大的應(yīng)用前景[6]．近年來，越來越多的文獻(xiàn)報道了利用蛋白包覆微晶技術(shù)制備固定化酶，特別是固定化脂肪酶，并將其用于酯化、轉(zhuǎn)酯等反應(yīng)，取得了良好的效果[7-10]．

本文利用蛋白包覆微晶技術(shù)制備固定化脂肪酶（Protein-coatedm icro-crystals technology，PCMC），優(yōu)化了制備條件，并利用其催化麻瘋樹油和乙醇的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)合成生物柴油．

1 實驗部分

1.1 主要試劑

脂肪酶CALB購于諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；月桂酸、四氫呋喃、叔丁醇、正辛醇、硫酸鉀、酚酞、丙酮、正丙醇、異丙醇、異辛烷、乙醇（95%）、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等均為分析純，購于天津市江天化工技術(shù)有限公司．所有化學(xué)試劑未進行純化．

1.2 實驗方法

1.2.1 PCMC的制備

PCMC的制備參考了Parke課題組[6]的工作，以K2SO4為賦形劑、丙酮為脫水劑，脂肪酶Candidaantarctica lipaseB（CALB）為模型酶，制備固定化酶，具體步驟如下：將1m LCALB酶液（30mg/m L）加入2m L飽和的K2SO4溶液中，振蕩混合均勻；磁力攪拌下，將上述混合液逐滴加入到30m L丙酮中；將混合物置于離心管中離心（7500 r/m in）得到白色沉淀，用5m L丙酮洗滌并離心，重復(fù)操作3次，得到白色沉淀；空氣中干燥，得到固定化脂肪酶，并命名為脂肪酶PCMC．

1.2.2 PCMC活性測定方法

酯化反應(yīng)：在20 m L密封瓶中，加入0.2 m L正辛醇、100 mg月桂酸、5 m L異辛烷和30 mg PCMC，40℃下反應(yīng)30m in（磁力攪拌速度為200 r/m in），通過堿滴定法檢測剩余的月桂酸的量，并計算轉(zhuǎn)化率．

轉(zhuǎn)化率測定：將上步反應(yīng)液離心分離，取1 m L上清液，加入到裝有50 m L乙醇和1 m L酚酞指示劑（10 g/L）的錐形瓶中，振蕩混勻，加熱至沸騰，用NaOH（0.05 mol/L）滴定至變色，15 s不褪色時視為終點．通過NaOH消耗的體積，計算出月桂酸的轉(zhuǎn)化率．對照組以反應(yīng)0 s的體系為空白樣本，用上述方法滴定，記錄滴定體積．

1.2.3 PCMC制備條件優(yōu)化

1.2.3.1 脫水劑對酶活的影響

將1m L酶液與2m LK2SO4飽和溶液混合均勻，磁力攪拌下，將混合溶液逐滴加入30m L不同的脫水劑（甲醇、乙醇、丙酮、正丙醇、異丙醇）中．所得混合物離心（7 500 r/m in）分離，得到白色沉淀，用5m L相應(yīng)的有機溶劑洗滌并離心，重復(fù)操作3次．將白色沉淀在空氣中干燥，得到不同脫水劑制備的PCMC．用

1.2.2中所述方法測定酶活．

1.2.3.2 賦形劑對酶活的影響

將1m L酶液與2m L不同塑性劑的飽和溶液（K2SO4、Na2SO4、KCl、NaCl、蔗糖）混合均勻．在磁力攪拌下，將混合溶液逐滴加入30 m L丙酮中．將所得混合物置于離心管中離心（7 500 r/m in）分離2 min，得到白色沉淀，用5m L丙酮洗滌并離心，重復(fù)操作3次．將沉淀在空氣中干燥，得到不同賦形劑制備的PCMC．用1.2.2中所述方法測定酶活．

1.2.4 PCMC的表征

用掃描電鏡（SEM）表征PCMC的形貌，樣品經(jīng)過噴金；用激光共聚焦顯微鏡（CLSM）表征酶分子的固載及PCMC粒徑．測試前，將脂肪酶用異硫氰酸熒光素（FITC）進行標(biāo)記．

1.2.5 PCMC穩(wěn)定性測定

有機溶劑穩(wěn)定性：取多組30mg PCMC于具塞試管中，加入到40℃的異辛烷（5m L）中浸泡．不同時間點取出，離心分離，真空干燥，用1.2.2中所述方法測定酶活．

熱穩(wěn)定性：取多組30 mg PCMC于具塞試管中，加入5 m L異辛烷．分別在不同溫度（30℃、40℃、50℃、60、70℃、80℃）中浸泡4 h，離心分離，真空干燥，用1.2.2中所述方法測定酶活．

1.2.6 PCMC的重復(fù)使用穩(wěn)定性

向密封瓶中加入30mg PCMC、0.2m L正辛醇、100mg月桂酸、5m L異辛烷和1 g 4型分子篩．40℃下磁力攪拌（200 r/m in）反應(yīng)2 h，離心分離，取上清液測定轉(zhuǎn)化率．沉淀用異辛烷洗滌多次，干燥后，將沉淀按照上述步驟重復(fù)操作，測定重復(fù)使用穩(wěn)定性．

1.2.7 生物柴油合成條件的優(yōu)化

在以麻瘋樹油和乙醇為底物的生物柴油合成反應(yīng)中，為提高生物柴油產(chǎn)率，對影響反應(yīng)的因素進行研究，包括底物濃度、反應(yīng)溫度、醇油比、酶用量等．具體操作：稱取一定量的麻瘋樹油和乙醇置于20m L密封瓶中，加入不同溶劑、一定量PCMC和4型分子篩，置于恒溫水浴下，200 r/m in振蕩反應(yīng)．反應(yīng)完成后，離心（10 000 r/m in）分離，取上清液，用氣相色譜檢測生物柴油產(chǎn)率．

合成生物柴油的重復(fù)使用穩(wěn)定性：按照實驗所得的最優(yōu)條件合成生物柴油，加入1g4型分子篩．反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液離心分離，取上清液測定其生物柴油產(chǎn)率．將沉淀用正己烷洗滌多次，離心干燥，用于下次使用．重復(fù)操作多次，測定重復(fù)使用穩(wěn)定性．

氣相色譜檢測條件：毛細(xì)色譜柱選擇非極性柱RTX-1（30m×0.25mm），色譜柱初始溫度160℃，保留時間2min，以15℃/m in的速率升溫至220℃，保留2m in．再以8℃/m in的速率升溫至280℃，保留1min．進樣器與檢測器的溫度設(shè)置為240℃和280℃，進樣量為0.5L．

產(chǎn)率計算：反應(yīng)樣品中生物柴油質(zhì)量通過保留時間及與內(nèi)標(biāo)物的峰面積之比得出．產(chǎn)率的計算公式為

2 結(jié)果與討論

2.1 PCMC制備條件優(yōu)化

由于疏水性（log P）不同，脫水劑的種類對PCMC的活性有顯著的影響．從圖1a）中可以看出，以丙酮（log P= 0.21）為脫水劑制備得到的PCMC活性最高為19.3 U/mg．這是因為丙酮合適的疏水性可以使其迅速將酶微環(huán)境內(nèi)的水脫去，同時保留維持酶分子活性結(jié)構(gòu)所必須的結(jié)合水[11]．因此，選取丙酮作為脫水劑用于后續(xù)操作．

圖1 脫水劑與賦形劑對PCMC活性的影響Fig.1 Influenceof solventsand excipientson theactivity of PCMC

由于PCMC的活性會受賦形劑種類的影響，選擇NaCl、K2SO4、KNO3、Na2SO4、蔗糖等不同晶體進行實驗．得到實驗結(jié)果如圖1b）所示，以K2SO4為賦形劑時固定化酶的酯化活性最高，為19.3 U/mg，這是由于K2SO4有合適的溶解度和晶體體積，使PCMC的結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，蛋白負(fù)載量較大．而以蔗糖為賦形劑時固定化酶活性最低，這與析出的蔗糖晶體粘度較大、PCMC發(fā)生粘連有關(guān)．在無機鹽中，以KNO3為賦形劑時得到的固定化酶活性最低，這可能是因為蛋白分子與NO3存在某種交互作用，影響酶分子的荷電荷性[12]．所以，本實驗選取K2SO4為賦形劑．

2.2 PCMC的表征

PCMC的形貌由掃描電鏡進行表征．圖2a）為K2SO4晶體掃描電鏡圖像，圖2b）為PCMC的掃描電鏡圖像．從圖2中可以看出，2種晶體的粒徑大小均為2～3m．同時，PCMC晶體表面粗糙，而K2SO4晶體表面光滑，這證明了酶分子的成功負(fù)載．

圖2 K2SO4和PCMC的掃描電鏡圖像Fig.2 SEM imagesof K2SO4and PCMC

為進一步確定晶體粒徑大小，利用激光共聚焦顯微鏡對PCMC進行表征（圖3）．圖3中的熒光點即為PCMC晶體，通過圖3可以看出，PCMC晶體的粒徑為2m，與掃描電鏡表征結(jié)果相同．圖像同時證明脂肪酶成功負(fù)載在 K2SO4晶體的表面．

圖3 PCMC激光共聚焦圖像Fig.3 Confocal imageof PCMC

2.3 PCMC的穩(wěn)定性研究

對PCMC在有機溶劑中的穩(wěn)定性進行考察，將PCMC浸泡在40℃異辛烷中，不同時間取出，考察其剩余活性，以未浸泡PCMC的酶活為100%，其結(jié)果如圖4a）所示．在浸泡8 h后，PCMC催化月桂酸和正辛醇的酯化活性有一定的提高，為初始的120%．這是由于有機溶劑中脂肪酶活性位點會被緩慢激活，同時，浸泡時間短，有機溶劑尚未對酶分子造成不利影響，因此會出現(xiàn)上述現(xiàn)象，這與Pizarro等[13]的研究結(jié)果一致．隨著浸泡時間的延長，有機溶劑會改變酶分子表面的水化層或荷電荷性，破壞酶分子的三維構(gòu)象，因此，PCMC的活性緩慢降低．當(dāng)浸泡72 h后，PCMC的活性降為初始活性的70%．

圖4 PCMC的有機溶劑穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性Fig.4 Long-term stabilityin organic solventand thermalstability of PCMC

考察PCMC的熱穩(wěn)定性，將PCMC浸泡于不同溫度的異辛烷中，并測定其剩余活性，實驗以浸泡在30℃異辛烷中PCMC的活性為100%．結(jié)果如圖4b）所示，在40℃異辛烷中浸泡4 h后，PCMC的相對活性最高為137%，說明此時的浸泡溫度有利于酶展現(xiàn)更好的催化活性．隨著溫度升高，PCMC的活性下降，在80℃異辛烷中浸泡4 h后，PCMC的相對酶活降低為81%．這是由于溫度升高導(dǎo)致酶的活性結(jié)構(gòu)改變，使活性降低[14]．

2.4 PCMC酯化反應(yīng)的重復(fù)使用穩(wěn)定性

PCMC用于催化月桂酸與正辛醇的酯化反應(yīng)，測定其重復(fù)使用穩(wěn)定性．從圖5中可以看出，在前4次反應(yīng)中，月桂酸的轉(zhuǎn)化率并沒有明顯下降．重復(fù)使用5次后，月桂酸轉(zhuǎn)化率降為90%．隨著使用次數(shù)的增加，轉(zhuǎn)化率逐漸下降，重復(fù)使用9次后，轉(zhuǎn)化率降為61%．這些結(jié)果表明，PCMC有著較好的重復(fù)使用穩(wěn)定性，而PCMC重復(fù)使用多次后催化月桂酸轉(zhuǎn)化率下降是由兩方面原因造成的：一方面，長期處于有機溶劑中，會使酶分子的三維結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，致使活性降低；另一方面，反應(yīng)中的攪拌、振蕩等操作，會導(dǎo)致酶分子脫落，造成PCMC活性的損失．

圖5 PCMC酯化反應(yīng)重復(fù)使用穩(wěn)定性Fig.5 Reusability of PCMC in esterification

2.5 PCMC催化合成生物柴油反應(yīng)條件的優(yōu)化

PCMC催化合成的生物柴油氣相色譜圖如圖6所示．

圖6 PCMC催化合成生物柴油的氣相色譜圖Fig.6 GC imageof biodieselproduction

2.5.1 溶劑對生物柴油產(chǎn)率的影響

對生物柴油合成反應(yīng)有機溶劑的種類進行了篩選，其結(jié)果如圖7所示．從圖7中可以看出，以正己烷為溶劑，反應(yīng)12 h后，生物柴油產(chǎn)率可達(dá)87%；以叔丁醇和環(huán)己烷為溶劑，產(chǎn)率分別為83%和67%．正己烷為溶劑得到生物柴油的產(chǎn)率較高，是因為正己烷可以使產(chǎn)物和底物溶解得更加均一，同時由于正己烷疏水性較大，反應(yīng)過程中不會造成維持酶分子活性結(jié)構(gòu)必須水的減少，對酶的傷害更小[15]．基于以上結(jié)果，實驗選取正己烷為溶劑進行后續(xù)操作．

2.5.2 反應(yīng)溫度對于生物柴油產(chǎn)率的影響

酶的種類和固定化方式會影響生物柴油合成反應(yīng)的適宜溫度．實驗研究了反應(yīng)溫度對生物柴油的產(chǎn)率影響．

實驗選取從30℃到70℃等不同溫度進行反應(yīng)，并測定相應(yīng)溫度下生物柴油的產(chǎn)率，得到結(jié)果如圖8所示．當(dāng)溫度從30℃升高到50℃時，生物柴油的產(chǎn)率由73%提高到87%．這是因為，溫度升高可以提高底物的溶解度，同時使底物在溶劑中的微觀活動更加劇烈，增加底物與酶分子活性位點的接觸幾率，進而提高生物柴油的產(chǎn)率[16]．隨著反應(yīng)溫度繼續(xù)升高，生物柴油的產(chǎn)率逐漸降低．70℃時，生物柴油的產(chǎn)率僅為71%．這是由于高溫使酶分子變性失活，導(dǎo)致產(chǎn)率下降．綜上所述，反應(yīng)溫度為50℃用于后續(xù)實驗．

圖7 溶劑對生物柴油產(chǎn)率的影響（反應(yīng)條件：醇油比5∶1，酶用量20%，反應(yīng)溫度30℃，溶劑與油物質(zhì)的量之比4∶1）Fig.7 Effectof solventson biodieselyield(The reaction conditions:molar ratio of ethanol/oil5∶1,20%of PCMC dosage to oil content,30℃,molar ratio of oil/n-hexane1∶4

圖8 溫度對生物柴油產(chǎn)率的影響（反應(yīng)條件：油與溶劑物質(zhì)的量之比1∶3，醇油比5∶1，酶用量20%）Fig.8 Effectof temperatureon yield of biodiesel(The reaction conditions:molar ratio of oil/n-hexane1∶3,molar ratio of ethanol/oil5∶1,20%of PCMC dosage to oilcontent)

2.5.3 麻瘋樹油與正己烷物質(zhì)的量之比對于生物柴油產(chǎn)率的影響

溶劑的用量對生物柴油合成過程有著重要的影響．從圖9中可以看出，當(dāng)麻瘋樹油與正己烷的物質(zhì)的量之比為1∶2時，得到生物柴油的產(chǎn)率最高為91%．增大或降低麻瘋樹油與正己烷的物質(zhì)的量之比，生物柴油的產(chǎn)率也隨之降低．這是因為，適量的溶劑可以使底物分散性更好，同時加速產(chǎn)物的溶解擴散，減小其抑制效應(yīng)．溶劑過少會降低底物和產(chǎn)物的溶解，增加傳質(zhì)阻力和底物的抑制效應(yīng)；而溶劑量過大則會稀釋反應(yīng)體系，造成底物濃度降低，減少底物與活性位點的接觸幾率．因此，實驗最終選取麻瘋樹油與正己烷的物質(zhì)的量之比為1∶2．

圖9 油與溶劑物質(zhì)的量之比對生物柴油產(chǎn)率的影響（反應(yīng)條件：醇油比5∶1，酶用量20%，50℃）Fig.9 Effectof themolar ratio of oil/n-hexaneon biodiesel yield(The reaction conditions:molar ratio of ethanol/oil5∶1, 20%of PCMC dosage to oilcontent,50℃)

2.5.4 醇油比對于生物柴油產(chǎn)率的影響

與甲醇相比，以乙醇為親核試劑進行生物柴油的合成反應(yīng)可以得到更高的生物柴油產(chǎn)率．這是因為乙醇對酶的鈍化失活作用更小，可以形成較溫和的催化環(huán)境[17-18]．醇油物質(zhì)的量之比是生物柴油合成工藝中一項重要的參數(shù)，理論的醇油比為3∶1．但實際反應(yīng)中適宜的醇油比往往大于理論值[19]．實驗選取不同的醇油比進行生物柴油的合成反應(yīng)，以確定最佳的反應(yīng)條件．從圖10中可以看出，當(dāng)醇油比為4∶1時，生物柴油的產(chǎn)率最高，為94%．增加或降低醇油比，產(chǎn)率均有不同程度的下降．這是因為，當(dāng)醇油比較低時，由于乙醇蒸發(fā)等原因造成底物的不足，減少其與活性位點的接觸幾率，導(dǎo)致產(chǎn)率過低．當(dāng)醇油比較高時，高濃度的乙醇對酶分子有較大的毒害作用，致使酶失活，影響產(chǎn)率[20]．因此，選取的醇油比為4∶1用于后續(xù)實驗．

2.5.5 PCMC用量對于生物柴油產(chǎn)率的影響

實驗選取PCMC的質(zhì)量為麻瘋樹油質(zhì)量的10%～25%進行催化反應(yīng)，分別測定生物柴油產(chǎn)率，選擇合適的催化劑用量，結(jié)果如圖11所示．當(dāng)PCMC用量增加時，生物柴油的產(chǎn)率也隨著提高．PCMC用量為10%，反應(yīng)12 h后，產(chǎn)率為73%，當(dāng)酶用量為20%時，產(chǎn)率提高到94%．進一步增加PCMC的用量，產(chǎn)率并沒有提高．這種現(xiàn)象可以由以下解釋：隨著 PCMC用量的增加，可以使更多的底物分子接觸到酶分子的活性位點，產(chǎn)率也隨著提高．當(dāng)固定化酶用量大于20%時，不會使產(chǎn)率提高．這種隨著酶用量增加而產(chǎn)率趨于平衡的現(xiàn)象具有普遍性，與已有研究結(jié)果相符[21-22]．綜合考慮反應(yīng)產(chǎn)率與反應(yīng)成本，實驗最終選取PCMC用量為20%（基于麻瘋樹油質(zhì)量）用于生物柴油的合成反應(yīng)．

圖10 醇油比對于生物柴油產(chǎn)率的影響（反應(yīng)條件：油與溶劑物質(zhì)的量之比1∶2，酶用量20%，50℃）Fig.10 Effectof ethanol/oilmolar ratio on the yield of biodiesel (The reaction conditions:molar ratio of oil/n-hexane1∶2, 20%of PCMC dosage to oilcontent,50℃)

圖11 PCMC用量對生物柴油產(chǎn)率的影響（反應(yīng)條件：醇油比4∶1，油與溶劑物質(zhì)的量之比1∶2，50℃）Fig.11 Effectof the dosageof PCMC on yield of biodiesel (The reaction conditions:molar ratio of ethanol/oil4∶1, molar ratio of oil/n-hexane1∶2,50℃)

2.5.6 PCMC催化合成生物柴油的重復(fù)使用穩(wěn)定性

將 PCMC在最優(yōu)條件下催化麻瘋樹油和乙醇合成生物柴油，并重復(fù)使用多次，得到結(jié)果如圖12所示．首次使用時，生物柴油的產(chǎn)率為94%，重復(fù)使用7次后，產(chǎn)率降為34%．產(chǎn)率降低是由于以下原因造成的：1）PCMC酶與晶體之間的結(jié)合力較弱，在反應(yīng)過程中攪拌和底物的共同作用導(dǎo)致酶分子流失[23]；2）反應(yīng)體系中的乙醇使酶鈍化失活[12]．

圖12 PCMC催化合成生物柴油的重復(fù)使用穩(wěn)定性Fig.12 Reusability of PCMC in biodieselproduction

3 結(jié)論

利用 K2SO4為賦形劑，丙酮為脫水劑制備了蛋白包覆微晶固定化酶（PCMC），脂肪酶PCMC具有良好的有機溶劑耐受性、熱穩(wěn)定性和重復(fù)使用穩(wěn)定性．同時將其應(yīng)用于生物柴油的合成，對反應(yīng)條件進行了優(yōu)化．最佳條件下反應(yīng)12 h，得到生物柴油的最高產(chǎn)率為94%，實驗證明了PCMC是一種制備簡便、活性較高的固定化酶，在生物柴油的催化制備等應(yīng)用中展現(xiàn)了巨大的潛力．

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[責(zé)任編輯 田 豐]

Preparation of protein coatedm icro-crystalsand its application in biodieselproduction

MA Li1，WEIJiaao2，ZHOU Liya1，F(xiàn)ENG Kai1，ZHAO Donglei3

(1.Schoolof Chemical Engineering,HebeiUniversity and Technology,Tianjin 300130,China;2.Schoolof Chem istry,University of Birmingham,Birm inghamB152TT,UK;3.City College,HebeiUniversity and Technology,Tianjin 300130,China)

The PCMCwasused to prepare immobilized lipase.The preparing conditionsand stabilitiesof immobilized lipasewere studied and thebiocatalystswereused forbiodieselproduction from Jatrophaoil.K2SO4wasused asexcipient and acetone aswaterm iscible organic solvent to prepare lipase PCMC.The obtained PCMC exhibited excellentstability and reusability.The PCMC retained 70%of its initialactivity after incubating in iso-octane for72 h,and retained 81%of the initialactivity after incubating in iso-octone at80℃for4 h.The conversion of lauric acid can be retainedmore than 61%after9 successive reaction cycles.The reaction parameterbiodieselproductionwereoptim ized and theoptimum conditionswere as follows:molar ratio of Jatropha oil to n-hexane 1∶2,temperature 50℃,molar ratio of ethanol to oil 4∶1,the dosageof PCMC 20%(w/w PCMC to oil).Under these conditions,themaximum biodieselyield could reach 94%.

protein-coatedm icro-crystals;immobilization;lipase;jatropha oil;biodiesel

Q814.2

A

1007-2373(2016)04-0037-08

10.14081/j.cnki.hgdxb.2016.04.007

2016-06-20

天津市高等學(xué)?？萍及l(fā)展基金計劃（20140513）；河北省自然科學(xué)基金（B2016202027）

馬麗（1983-），女（漢族），實驗師．

趙東磊（1981-），男（滿族），講師，tyzdl@sohu.com．