低聚果糖和低聚異麥芽糖促進斑馬魚腸道蠕動作用的研究

侯海榮，張姍姍，孫晨，陳玉峰，何秋霞，李曉彬，于濤，彭德杰，韓利文*，劉可春*

(1.山東省科學(xué)院生物研究所，山東省科學(xué)院藥物篩選技術(shù)重點實驗室，山東 濟南 250014；2.山東省科學(xué)院生物研究所，山東省科學(xué)院生物檢測技術(shù)工程實驗室，山東 濟南 250014；3.蓬萊海洋(山東)股份有限公司，山東 蓬萊 265600)

【藥理與毒理】

低聚果糖和低聚異麥芽糖促進斑馬魚腸道蠕動作用的研究

侯海榮1,2，張姍姍1,2，孫晨1,2，陳玉峰3，何秋霞1,2，李曉彬1,2，于濤3，彭德杰3，韓利文1,2*，劉可春1,2*

(1.山東省科學(xué)院生物研究所，山東省科學(xué)院藥物篩選技術(shù)重點實驗室，山東 濟南 250014；2.山東省科學(xué)院生物研究所，山東省科學(xué)院生物檢測技術(shù)工程實驗室，山東 濟南 250014；3.蓬萊海洋(山東)股份有限公司，山東 蓬萊 265600)

探討基于斑馬魚模型的低聚果糖及低聚異麥芽糖對腸道蠕動的促進作用。選用發(fā)育正常的5 d的斑馬魚幼魚，各實驗組分別加入不同濃度的低聚果糖和低聚異麥芽糖溶液，培養(yǎng)24 h后，在顯微鏡下觀察其對斑馬魚腸道蠕動次數(shù)的影響。實驗結(jié)果表明，125～500 mg/mL的低聚果糖和低聚異麥芽糖均對斑馬魚腸道蠕動有促進作用，蠕動次數(shù)與濃度成正相關(guān)性。相同濃度條件下，低聚果糖較低聚異麥芽糖促進斑馬魚腸道蠕動的作用更明顯。采用斑馬魚動物模型可實現(xiàn)促進腸蠕動藥物的早期、快速篩選。

斑馬魚；低聚果糖；低聚異麥芽糖；腸道蠕動次數(shù)

腸道是人體最大的免疫器官，也是人體最大的排毒器官[1-2]。腸道蠕動能力的強弱在一定程度上影響著腸道的生理功能，且最終影響著人體的健康。de Winter等[3]發(fā)現(xiàn)約50%的患者會因消化道問題就診，而其中約30%～40%的患者最終會被確診為腸蠕動能力障礙性疾病。該類疾病的發(fā)病機制可能與飲食、神經(jīng)激素、神經(jīng)心理、胃酸和幽門螺旋桿菌感染等多種因素相關(guān)。腸道蠕動能力障礙性疾病多屬于功能性疾病，目前尚無特效治療方法[4]。所以，采用快速高效的活體動物模型篩選能夠改善腸道蠕動的天然來源的活性物質(zhì)，對于相關(guān)藥物、功能食品的開發(fā)和腸道疾病的治療具有重要的意義。

益生元，是指可以選擇性刺激腸道中已定植的有益菌群的繁殖或活性的一種膳食補充劑，包括功能性低聚糖、菊粉、膳食纖維和糖醇等[5]，其中功能性低聚糖因其具有生產(chǎn)成本較低、功能明確且無毒副作用等優(yōu)點，現(xiàn)已成為益生元市場的主要的生力軍。國內(nèi)外市場上常見的功能性低聚糖主要包括低聚果糖(fructo oligosaccharides，F(xiàn)OS)、低聚異麥芽糖(isomaltooligosacharide，IMO)、低聚半乳糖(galactooligosaccharides，GOS)和低聚木糖(xylo-oligosaccharide，XOS)等[6]。

低聚果糖又稱蔗果低聚糖或果寡糖，是一類重要的功能性低聚糖，廣泛存在于自然界中，如菊苣、菊芋、大蒜、洋蔥、牛蒡?qū)?、香蕉、小麥、蜂蜜和蘆筍等都含有[7]，是迄今為止研究最為深入的一種低聚糖[6]。低聚異麥芽糖又稱分支低聚糖或異麥芽寡糖，廣泛存在于大麥、小麥、馬鈴薯和蜂蜜中，是當(dāng)前食品領(lǐng)域中使用最多、價格相對較低的一種功能性低聚糖[8]。

目前有關(guān)低聚果糖、低聚異麥芽糖的改善腸功能活性評價多采用傳統(tǒng)的在體動物模型(大鼠、小鼠等)，如劉曉梅等[9]通過建立Wistar 大鼠便秘模型，發(fā)現(xiàn)低聚果糖具有潤腸通便作用，且其對維持腸道菌群平衡、抑制腸球菌和腸桿菌的生長有較好的功效；姚景會等[10]報道了低聚異麥芽糖對小鼠腸道菌群菌落數(shù)量具有調(diào)節(jié)作用。目前尚無基于斑馬魚模型的低聚果糖、低聚異麥芽糖的腸功能活性方面的研究。

斑馬魚作為近年來被廣泛用于疾病模型建立和藥物研發(fā)的重要的在體模式生物[11-13]，具有個體小、易于飼養(yǎng)、胚胎透明易于觀察和操作、樣品用量少、試驗周期短和可實現(xiàn)高通量篩選等優(yōu)點，且其腸道組成與人類相似，均由內(nèi)皮細(xì)胞、結(jié)締組織、環(huán)狀肌和外縱肌組成[14]。斑馬魚胚胎發(fā)育至72 hpf時長成幼魚，在未喂食狀態(tài)下，首次出現(xiàn)腸道不穩(wěn)定的自發(fā)性收縮。發(fā)育至120～144 hpf，斑馬魚幼魚腸道會出現(xiàn)自發(fā)的蠕動，可通過觀察藥物對斑馬魚腸蠕動次數(shù)的影響而實現(xiàn)藥物對斑馬魚腸功能活性的評價。

本研究通過觀察低聚果糖及低聚異麥芽糖對處于早期發(fā)育階段的斑馬魚的腸蠕動的促進情況，探討低聚果糖及低聚異麥芽糖對腸道蠕動的促進作用以及采用斑馬魚動物模型進行藥物促進腸功能活性評價的可行性，為適用于促進腸蠕動藥物的早期、快速、高通量篩選的動物模型的研究提供依據(jù)，為斑馬魚腸功能活性評價的研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及其配制

低聚果糖和低聚異麥芽糖(保齡寶生物股份公司，低聚果糖批號20170202，低聚異麥芽糖批號20150127)利用胚胎培養(yǎng)水配成125、250、500 mg/mL備用；苯硫脲( PTU， Sigma 公司，批號037K077)配成1 mg/mL溶液備用；嗎叮啉(Toronto Research Chemicals Inc， 25 mg， 批號 1-JTN-136-1)，配成50 μg/mL備用。

1.1.2 實驗動物

實驗用AB 系斑馬魚，魚種來自山東省科學(xué)院斑馬魚藥物篩選平臺。斑馬魚的養(yǎng)殖和繁殖參照Westerfield 法[15]。取卵前一日，將雌雄魚(1∶ 2)同缸用隔離板分開，第2 天光照開始前將隔離板抽掉使雌雄魚并池，光照后獲得受精卵。受精卵用干凈培養(yǎng)水洗凈后，放入28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.3 實驗儀器

SZX16型體式熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；HPG-280BX光照培養(yǎng)箱(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)；斑馬魚養(yǎng)殖飼養(yǎng)設(shè)備(北京愛生科技公司)；6孔板(美國Costar)。

1.2 方法

1.2.1 加藥處理

將發(fā)育2 d的斑馬魚胚胎用吸管移取到6孔板上，每孔加入15個斑馬魚胚胎以及6 mL含有苯硫脲的胚胎培養(yǎng)液(每1 mL胚胎培養(yǎng)液中含有苯硫脲母液10 μL)，隔日更換3 mL新配制的苯硫脲和胚胎培養(yǎng)液混合液，連續(xù)培養(yǎng)2 d。斑馬魚發(fā)育至第5 d后，移去每孔中的苯硫脲和胚胎培養(yǎng)液的混合液，各實驗組分別加入不同濃度的受試藥物6 mL，同時設(shè)置嗎叮啉陽性對照組(50 μg/mL，6 mL)和以胚胎培養(yǎng)液為溶液的空白對照組 (6 mL)。每組平行3份。藥物處理24 h后，利用顯微鏡錄像記錄斑馬魚腸蠕動次數(shù)。

1.2.2 斑馬魚腸道蠕動計數(shù)

在顯微鏡下計時60 s，計數(shù)60 s內(nèi)斑馬魚腸蠕動次數(shù)，利用Image-Pro-Plus 軟件進行圖片分析，比較不同藥物處理組與空白對照組之間的斑馬魚腸道蠕動次數(shù)差異。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件SPSS 16.0對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，用單因素方差分析判斷組間差異，P< 0.05 則認(rèn)為所檢驗的差別有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 低聚果糖對斑馬魚腸道蠕動的影響

將發(fā)育至第5 天的斑馬魚幼魚置于不同濃度的低聚果糖溶液中，處理24 h后，將各組斑馬魚幼魚分別置于體式顯微鏡下，觀察并記錄60 s內(nèi)斑馬魚腸道蠕動次數(shù)，并將60 s內(nèi)各藥物處理組和對照組中斑馬魚腸道蠕動次數(shù)進行對比分析，實驗結(jié)果如圖1所示。從圖中可以看出，陽性對照組的斑馬魚腸道蠕動次數(shù)與空白對照組相比，呈現(xiàn)顯著性差異，表明該實驗方法可行性良好，實驗結(jié)果真實可靠。低聚果糖組的斑馬魚腸道蠕動次數(shù)與空白對照組相比，呈現(xiàn)顯著性差異，且隨著低聚果糖樣品組濃度的提高，斑馬魚腸道的蠕動次數(shù)逐漸增加，在125 ～500 mg/mL濃度范圍內(nèi)，斑馬魚腸道蠕動次數(shù)與低聚果糖的濃度呈正相關(guān)性。

*代表與空白對照相比，P<0.05圖1 不同濃度低聚果糖對斑馬魚腸道蠕動的作用比較Fig.1 Comparison of effects of ructo oligosaccharides in different concentrations on the intestinal peristalsis of zebrafish

斑馬魚經(jīng)500 mg/mL的低聚果糖溶液處理24 h后，其腸道收縮有力，蠕動明顯，如圖2所示，每間隔1 s，斑馬魚腸道蠕動起伏明顯，有波峰出現(xiàn)。圖2中所示為從一個蠕動波開始的4 s內(nèi)的結(jié)果，空白對照組斑馬魚4 s內(nèi)腸道蠕動緩慢，未見波形形成；陽性對照組完成近兩個波形，蠕動比較迅速；低聚果糖高劑量組蠕動相當(dāng)迅速，4 s內(nèi)總共完成近3個波形。以上結(jié)果表明，低聚果糖濃度在125～500 mg/mL范圍內(nèi)，對斑馬魚腸道的蠕動起促進作用。

箭頭指示為腸道蠕動波峰位置圖2 低聚果糖處理后斑馬魚的腸道蠕動情況Fig.2 The intestinal peristalsis of zebrafish after treat with ructo oligosaccharide

2.2 低聚異麥芽糖對斑馬魚腸道蠕動的影響

將發(fā)育至第5天的斑馬魚幼魚置于不同濃度的低聚異麥芽糖溶液中，處理24 h后，將各組斑馬魚幼魚分別置于體式顯微鏡下，觀察并記錄60 s內(nèi)斑馬魚腸道蠕動次數(shù)，并將60 s內(nèi)各藥物處理組和對照組中斑馬魚腸道蠕動次數(shù)進行對比分析，實驗結(jié)果如圖3所示。從圖中可以看出，陽性對照組的斑馬魚腸道蠕動次數(shù)與空白對照組相比，呈現(xiàn)顯著性差異，表明該實驗方法可行性良好，實驗結(jié)果真實可靠。低聚異麥芽糖組的斑馬魚腸道蠕動次數(shù)與空白對照組相比，呈現(xiàn)顯著性差異，且隨著低聚異麥芽糖樣品組濃度的提高，斑馬魚腸道的蠕動次數(shù)逐漸增加，在125～500 mg/mL濃度范圍內(nèi)，斑馬魚蠕動次數(shù)與低聚異麥芽糖的濃度呈正相關(guān)性。

圖3 不同濃度低聚異麥芽糖對斑馬魚腸道蠕動的作用比較Fig.3 Comparison of effects of isomaltooligosaccharides in different concentrations on the intestinal peristalsis of zebrafish

斑馬魚經(jīng)500 mg/mL的低聚異麥芽糖溶液處理24 h后，其腸道收縮有力，蠕動明顯，如圖4所示，每間隔1 s，斑馬魚腸道蠕動起伏明顯，有波峰出現(xiàn)。以上結(jié)果均表明，低聚異麥芽糖在濃度125～500 mg/mL時，對腸道的蠕動起促進作用。圖4中，空白對照組斑馬魚4 s內(nèi)腸道蠕動緩慢，未形成波形；陽性對照組完成近兩個波形，蠕動比較迅速；低聚異麥芽糖高劑量組蠕動迅速，也完成近兩個波形。

箭頭所指示為腸道蠕動波峰位置圖4 低聚異麥芽糖處理后斑馬魚的腸道蠕動情況Fig.4The intestinal peristalsis of zebrafish after treat with isomaltooligosaccharide

2.3 低聚果糖和低聚異麥芽糖促進斑馬魚腸道蠕動的差異

斑馬魚經(jīng)過低聚果糖和低聚異麥芽糖溶液處理24 h后，均能發(fā)現(xiàn)腸道起伏明顯，有波峰出現(xiàn)的情況，二者比較，低聚果糖較低聚異麥芽糖對斑馬魚腸道蠕動促進作用更加明顯。此結(jié)果與現(xiàn)有報道的低聚果糖和低聚異麥芽糖所需最低起效量的差異一致，低聚果糖每日攝取最低有效劑量為5.0 g[16]，而低聚異麥芽糖每日攝取最低有效劑量為10.0 ～ 18.0 g[17]。但是，經(jīng)過顯微鏡觀察，低聚異麥芽糖出現(xiàn)雙波峰情況比較明顯，出現(xiàn)這種差異的原因有待進一步地研究。

3 討論

腸道運動功能是消化道最主要的功能之一，適當(dāng)?shù)靥岣吣c道蠕動，可以促進消化液的分泌，增強消化道的消化、吸收能力，并最終提高機體生命活力。但是由于腸道運動的調(diào)節(jié)機制非常復(fù)雜，如何簡便、有效地加強其蠕動能力尚需研究。目前常見的治療方式仍是通過外源性藥物等提高腸道運動功能，但并不能保證根治疾病，且外源性藥物的安全性及長期服用是否會產(chǎn)生成癮性也制約此類藥物的發(fā)展，因此，采用快速高效的活體動物模型對天然來源的活性物質(zhì)進行篩選，既能有效提高藥物的篩選速度，又能保證所篩選的藥物的安全性，可謂一舉兩得。

我們以新型模式生物斑馬魚作為實驗動物，通過研究發(fā)現(xiàn)低聚果糖和低聚異麥芽糖在一定濃度內(nèi)可以有效提高早期發(fā)育的斑馬魚腸道蠕功能，低聚果糖及低聚異麥芽糖的濃度與斑馬魚腸蠕動次數(shù)呈正相關(guān)，且相同濃度條件下， 低聚果糖促進斑馬魚腸道蠕動的能力強于低聚異麥芽糖。該研究結(jié)果與傳統(tǒng)在體模式生物(大鼠、小鼠)的相關(guān)實驗結(jié)果一致，但采用斑馬魚動物模型所耗費的實驗周期更短、操作更簡便、結(jié)果更易于觀察且實驗成本低廉。

采用斑馬魚模型進行藥物促進腸功能活性評價，可彌補小型哺乳動物模型無法快速驗證其結(jié)果[18]的不足，能夠?qū)崿F(xiàn)促進腸蠕動藥物的早期、快速、高通量篩選，為斑馬魚腸功能活性評價的研究奠定理論基礎(chǔ)，對腸功能相關(guān)藥物或者保健食品產(chǎn)品的研發(fā)將具有非常重要的意義。

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The effect of fructo oligosaccharides and isomaltooligosaccharide on the intestinal peristalsis of zebrafish

HOU Hai-rong1,2, ZHANG Shan-shan1,2, SUN Chen1,2, CHEN Yu-feng3,HE Qiu-xia1,2, LI Xiao-bin1,2, YU Tao3, PENG De-jie3, HAN Li-wen1，2*, LIU Ke-chun1，2*

(1. Key Laboratory for Drug Screening Technology of Shandong Academy of Sciences, Institute of Biology, Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014， China;2. Shandong Provincial Engineering Laboratory for Biological Testing Technology, Institute of Biology, Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014 ,China; 3. Penglai Marine (Shandong)CO., LTD., Penglai 265600, China)

∶ The effect of fructo oligosaccharides and isomaltooligosaccharide in different concentration to promote the intestinal peristalsis is discussed by using zebrafish. We selected the 5 d normal growth zebrafish larvae, and then added to a series of fructo oligosaccharides or isomaltooligosaccharide with a range of concentration as experiment group. The number of intestinal peristalsis was counted in all groups including control group and oligosaccharide and oligoisomaltose treated groups with different dose under the microscope after 24 h. The result showed that fructo oligosaccharides and isomaltooligosaccharide can promote zebrafish larval intestinal peristalsis in the concentration of 125～500 mg/mL in dose-dependent manner. The effect of oligosaccharide was more obvious than oligoisomaltose under same dose. Using zebrafish can achieve early and rapid screening for drugs promoting intestinal peristalsis.

∶zebrafish; fructo oligosaccharides; isomaltooligosaccharide; number of intestinal peristalsis

10.3976/j.issn.1002-4026.2016.06.009

2016-09-30

山東省科技發(fā)展計劃(2011GHY11505)；山東省重點研發(fā)計劃(2015GSF121021)；煙臺市科技發(fā)展計劃項目(2015NC046)；山東省自主創(chuàng)新及成果轉(zhuǎn)化專項(2014ZZCX02105)

侯海榮(1979—)，女，實驗師，研究方向為藥物篩選。E-mail:caomu_1314@163.com

*通信作者，韓利文(1980—)，男，博士，研究方向為藥物篩選及代謝組學(xué)研究，E-mail:hanliwen08@126.com；劉可春(1964—)，男，博士，研究方向為藥物篩選，E-mail:hliukch@sdas.org

R965.1

A

1002-4026(2016)06-056-06