MK886對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29增殖及Ascl2表達(dá)的影響

李仕宇，朱蓉，劉梅，周本剛，趙逵

(1 遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義563000；2 遵義市第一人民醫(yī)院)

MK886對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29增殖及Ascl2表達(dá)的影響

李仕宇1，2，朱蓉1，劉梅1，周本剛1，趙逵1

(1 遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義563000；2 遵義市第一人民醫(yī)院)

目的 探討5-脂氧合酶活化蛋白(FLAP)抑制劑MK886對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29增殖的影響及其作用機(jī)制。方法 分別采用12.5、25、50、75、100、200 μmol/L的MK886干預(yù)體外培養(yǎng)的HT-29細(xì)胞，分別于干預(yù)24、48 h時(shí)采用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率，結(jié)果顯示MK886抑制HT-29細(xì)胞增殖最佳作用時(shí)間為48 h、最佳濃度為48.12 μmol/L。選擇48.12 μmol/L MK886干預(yù)HT-29細(xì)胞(MK886組)，另設(shè)對(duì)照組(不干預(yù))，干預(yù)24 h時(shí)采用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)Ascl2 mRNA表達(dá)，干預(yù)24、48、72 h時(shí)分別采用Western blotting法檢測(cè) Ascl2 mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果 經(jīng)過(guò)48.12 μmol/L MK886干預(yù)24 h時(shí)HT-29細(xì)胞中Ascl2 mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.35±0.02，對(duì)照組為0.72±0.02，兩組比較P<0.01。48.12 μmol/L MK886作用24、48、72 h時(shí)HT-29細(xì)胞中Ascl2蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.75±0.13、1.10±0.15、0.71±0.19，均較對(duì)照組降低(P均<0.05)；且隨著MK886作用時(shí)間延長(zhǎng)，Ascl2蛋白相對(duì)表達(dá)量逐漸下調(diào)(P均<0.05)。結(jié)論 FLAP抑制劑MK886能抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29增殖，其機(jī)制可能與下調(diào)Ascl2 mRNA和蛋白表達(dá)有關(guān)。

結(jié)腸癌；MK886；5-脂氧合酶活化蛋白；Ascl2

結(jié)直腸癌是發(fā)病率和病死率均較高的惡性腫瘤之一，近年來(lái)其發(fā)病呈年輕化趨勢(shì)[1,2]?；ㄉ南┧?AA)是人體必需脂肪酸，在體內(nèi)代謝后可生成多種有生物活性的物質(zhì)，如類二十烷酸等。這些代謝產(chǎn)物在腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、血管生成等方面具有重要作用[3]。AA主要通過(guò)脂氧合酶(LOX)和環(huán)氧合酶(COX)途徑代謝[4]，而非甾體類抗炎藥(NSAIDs)或其他抑制劑均能抑制這兩條代謝途徑，繼而抑制腫瘤細(xì)胞增殖并延緩腫瘤進(jìn)展[5]。5-脂氧合酶活化蛋白(FLAP)抑制劑在臨床已廣泛用于治療哮喘、關(guān)節(jié)炎等慢性炎癥性疾病[6]，但其對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用鮮見報(bào)道。2015年5～8月，本研究觀察了FLAP抑制劑MK886對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響，現(xiàn)分析結(jié)果，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。超凈臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備廠；二氧化碳培養(yǎng)箱、全波段酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo公司；倒置顯微鏡，日本Olympus公司。MK886，美國(guó)Cayman公司，DMSO溶解后配成10 mmol/L溶液，-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?，?shí)驗(yàn)時(shí)用完全培養(yǎng)基稀釋；胰蛋白酶、雙抗、RPMI 1640培養(yǎng)基，美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司；CCK-8試劑盒，日本同仁化學(xué)研究所；Ascl2引物設(shè)計(jì)及合成，上海生工生物工程股份有限公司；TRIzol逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司；Ascl2兔多克隆抗體，美國(guó)Abcam公司；山羊抗兔、鼠IgG-HRP，上海Abmart公司。

1.2 細(xì)胞傳代培養(yǎng) 取HT-29細(xì)胞置于含12%胎牛血清和1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化傳代，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 MK886抑制HT-29細(xì)胞增殖的最佳濃度確定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HT-29細(xì)胞接種于96孔板中，細(xì)胞密度為8×103個(gè)/孔，每孔加入100 μL的細(xì)胞懸液。隨機(jī)分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組及試驗(yàn)組，試驗(yàn)組分別加入6個(gè)濃度的MK886(分別為200、100、75、50、25、12.5 μmol/L)干預(yù)，每個(gè)濃度均設(shè)5個(gè)復(fù)孔?？瞻讓?duì)照組加入不含細(xì)胞的完全培養(yǎng)基；陰性對(duì)照組加入含細(xì)胞的完全培養(yǎng)基，不加MK886；試驗(yàn)組分別加入含細(xì)胞及相應(yīng)濃度MK886的完全培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)24、48 h。每孔分別加入CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度(A)值，計(jì)算不同濃度MK886作用24、48 h時(shí)HT-29細(xì)胞的增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(陰性對(duì)照組A-試驗(yàn)組A)/(陰性對(duì)照組A-空白組A)×100%。試驗(yàn)至少重復(fù)3次，取平均值。結(jié)果見表1。根據(jù)半數(shù)抑制濃度(IC50)軟件，不同濃度MK886作用24、48 h時(shí)的IC50分別為44.21、48.12 μmol/L，選取48.12 μmol/L為最佳作用濃度。

表1 不同濃度MK886作用24、48 h時(shí)HT-29細(xì)胞增殖抑制率比較

注：與12.5 μmol/L比較，*P<0.05；與25 μmol/L比較，△P<0.05；與50 μmol/L比較，▲P<0.05；與75 μmol/L比較，▽P<0.05；與100 μmol/L比較，▼P<0.05；與同濃度作用48 h比較，#P<0.05。

1.4 MK886對(duì)HT-29 細(xì)胞Ascl2 mRNA表達(dá)影響的觀察 采用RT-PCR法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HT-29細(xì)胞，以2×105個(gè)/mL密度接種于6孔板中常規(guī)培養(yǎng)。設(shè)對(duì)照組及觀察組，對(duì)照組不加MK886，觀察組加入48.12 μmol/L MK886，均培養(yǎng)24 h。采用TRIzol法提取各組總RNA，按說(shuō)明書操作。采用酶標(biāo)儀行定量檢測(cè)，RNA母液濃度=光密度(OD)260×0.04 μg/mL×50倍，OD260/OD280行純度評(píng)估(比值為1.8～2.2提示無(wú)RNA水解及蛋白污染)。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄cDNA，反應(yīng)條件：25 ℃ 10 min、42 ℃ 30 min、85 ℃ 5 min、4 ℃ 5 min。按擴(kuò)增試劑盒說(shuō)明書以cDNA為擴(kuò)增模板。引物序列：Ascl2上游引物：5′-GGATGTACTCCACGGCTGAG-3′，下游引物：5′-CGTGAAGCTGGTGAACTTGG-3′，片段長(zhǎng)度113 bp；β-actin內(nèi)參上游引物：5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′，下游引物：5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，片段長(zhǎng)度186 bp。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 10 s，共40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳在凝膠成像系統(tǒng)下觀察目標(biāo)條帶，結(jié)合擴(kuò)增曲線及溶解曲線綜合分析有無(wú)非特異性擴(kuò)增，以及結(jié)果是否可靠。采用2-ΔΔCT法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。試驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.5 MK886對(duì)HT-29細(xì)胞Ascl2蛋白表達(dá)影響的觀察 采用Western blotting法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HT-29細(xì)胞，4×105個(gè)/mL密度接種于培養(yǎng)瓶中常規(guī)培養(yǎng)，并設(shè)對(duì)照組及觀察組。對(duì)照組加完全培養(yǎng)基，觀察組加入48.12 μmol/L MK886，分別作用24、48、72 h。收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液RIPA勻漿使其冰上充分裂解；4 ℃ 12 000 g/min離心30 min，收集上清液，BCA蛋白定量法檢測(cè)蛋白含量；加入等量的上樣緩沖液，沸水煮5 min至蛋白變性。以40 μg/μL的蛋白量上樣，常規(guī)電泳，轉(zhuǎn)膜，用5% BSA封閉；Ascl2多克隆抗體(1∶1 000)、小鼠抗人β-actin抗體(1∶1 000)作為一抗孵育4 ℃冰箱過(guò)夜，山羊抗兔、鼠IgG-HRP(1∶5 000)作為二抗孵育1 h，發(fā)光液發(fā)光，X線膠片感光，手動(dòng)洗片機(jī)洗片。用全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)掃描膠片并測(cè)定各組蛋白電泳帶OD值，以Ascl2的OD值/β-actin的OD值計(jì)算Ascl2蛋白相對(duì)表達(dá)量。試驗(yàn)至少重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1MK886對(duì)HT-29 細(xì)胞Ascl2mRNA表達(dá)的影響Ascl2擴(kuò)增曲線光滑，溶解曲線呈單峰，PCR凝膠電泳顯示條帶單一，無(wú)雜帶及非特異性擴(kuò)增，說(shuō)明qRT-PCR結(jié)果特異性好，結(jié)果可靠。觀察組Ascl2mRNA的相對(duì)表達(dá)量為0.35±0.02，對(duì)照組為0.72±0.02，兩組比較P<0.01。

2.2MK886對(duì)HT-29 細(xì)胞Ascl2蛋白表達(dá)的影響 對(duì)照組Ascl2蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.98±0.16，觀察組MK886作用24、48、72h時(shí)Ascl2蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.75±0.13、1.10±0.15、0.71±0.19，與對(duì)照組比較均明顯降低(P均<0.05)；且隨著MK886作用時(shí)間的延長(zhǎng)，Ascl2蛋白相對(duì)表達(dá)量逐漸下調(diào)，存在時(shí)間依賴性(P均<0.05)。

3 討論

結(jié)直腸癌發(fā)病是多因素、多步驟、多階段共同作用的結(jié)果，但具體發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚。大量研究證實(shí)，炎癥介質(zhì)在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具有重要作用[7～10]。當(dāng)炎癥因子刺激機(jī)體時(shí)，被激活的胞質(zhì)型磷脂酶A2促使膜磷脂釋放AA，此時(shí)前體化合物AA經(jīng)5-LOX途徑代謝最終產(chǎn)生白三烯類。其中5-LOX是AA生成白三烯類的關(guān)鍵限速酶，其數(shù)量和活性可調(diào)節(jié)下游產(chǎn)物的合成。有研究表明，5-LOX代謝通路中的蛋白在正常組織中不表達(dá)或低表達(dá)，在腫瘤組織中高表達(dá)，5-LOX與腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲相關(guān)，并通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)破壞、轉(zhuǎn)移、激活抗凋亡信號(hào)通路等促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖并抗凋亡，抑制該通路可以抑制腫瘤生長(zhǎng)[11]。MK886是FLAP抑制劑，可阻止5-LOX的活化，抑制LOX途徑下游產(chǎn)物的形成從而發(fā)揮抑癌作用。近年來(lái)FLAP抑制劑已用于支氣管哮喘、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等炎癥性疾病的治療[12]，但目前其用于結(jié)腸癌的報(bào)道少見。

Ascl2是一種基本的螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，在維持胚胎發(fā)展過(guò)程中滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖方面發(fā)揮重要作用[13]。Jubb等[14]研究發(fā)現(xiàn)，Ascl2在結(jié)直腸腺癌中高表達(dá)，在正常組織中低表達(dá)甚至不表達(dá)；Ascl2的表達(dá)還具有部位特異性，只表達(dá)在胎盤和腸黏膜隱窩基底部Lgr5陽(yáng)性的細(xì)胞中[13,14]。Ascl2是Wnt信號(hào)通路的靶基因，其轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)基因的過(guò)表達(dá)可誘導(dǎo)隱窩細(xì)胞的過(guò)度增殖和絨毛中異常隱窩的形成，敲除Ascl2基因可導(dǎo)致Lgr5陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)消失，故Ascl2基因功能的獲得或缺失可能控制著腸干細(xì)胞的“命運(yùn)”[15]。Ziskin等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌組織中Lgr5/Ascl2表達(dá)為74%～85%，且隱窩干細(xì)胞來(lái)源于Lgr5+/Ascl2+的細(xì)胞，主要依賴于Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展[17]。腸黏膜上皮是哺乳動(dòng)物中自我更新速度最快的上皮細(xì)胞，隱窩是細(xì)胞增殖最主要的場(chǎng)所，而干細(xì)胞循環(huán)池中的干細(xì)胞主要存在于隱窩基底部Lgr5陽(yáng)性細(xì)胞中。研究表明，結(jié)直腸腫瘤干細(xì)胞來(lái)源于隱窩干細(xì)胞的異常增殖[18]。Ascl2基因能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制其凋亡、促進(jìn)其耐藥，具有腫瘤干細(xì)胞的特性；還可作為抑制結(jié)腸癌起始細(xì)胞的一個(gè)潛在靶點(diǎn)，其功能與miR-302b調(diào)控的相關(guān)機(jī)制有關(guān)，干擾Ascl2基因的表達(dá)可降低結(jié)腸癌細(xì)胞在體內(nèi)外的成瘤能力。因此，Ascl2可作為結(jié)腸癌干細(xì)胞特異性的標(biāo)志物之一，抑制Ascl2的表達(dá)可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移。

本研究結(jié)果顯示，MK886不但可以抑制HT-29細(xì)胞增殖，還可下調(diào)Ascl2基因及其蛋白表達(dá)；說(shuō)明MK886能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，此為其應(yīng)用于結(jié)直腸癌放化療的輔助靶向治療提供了理論基礎(chǔ)。腫瘤干細(xì)胞靶向治療是最近研究的熱點(diǎn)，但目前尚處于試驗(yàn)階段，具體作用機(jī)制不清楚，有待后期進(jìn)一步研究。

綜上所述，5-LOX活化蛋白抑制劑MK886能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與下調(diào)Ascl2mRNA及其蛋白表達(dá)有關(guān)。

[1]DeSantisCE,LinCC,MariottoAB,etal.Cancertreatmentandsurvivorshipstatistics, 2014[J].CACancerJClin, 2014,64(4):252-271.

[2]RoyS,MajumdarAP.Signalingincoloncancerstemcells[J].JMolSignal, 2012,7(1):11.

[3]SteinhilberD,FischerAS,MetznerJ,etal. 5-lipoxygenase:underappreciatedroleofapro-inflammatoryenzymeintumorigenesis[J].FrontPharmacol, 2010(1):143.

[4]BrashAR.Arachidonicacidasabioactivemolecule[J].JClinInvest, 2001,107(11):1339-1345.

[5]AugustEM,NguyenT,MalinowskiNM,etal.Non-steroidalantiinflammatorydrugsandtumorprogression:inhibitionoffibroblasthyaluronicacidproductionbyindomethacinandmefenamicacid[J].CancerLett, 1994,82(1):49-54.

[6]DattaK,BiswalSS,KehrerJP.The5-lipoxygenase-activatingprotein(FLAP)inhibitor,MK886,inducesapoptosisindependentlyofFLAP[J].BiochemicalJ, 1999,340(Pt2):371-375.

[7]GrivennikovSI,GretenFR,KarinM.Immunity,inflammation,andcancer[J].Cell, 2010,140(6):883-899.

[8]RaoCV,JanakiramNB,MohammedA.Lipoxygenaseandcyclooxygenasepathwaysandcolorectalcancerprevention[J].CurrColorectalCancerRep, 2012,8(4):316-324.

[9]UllmanTA,ItzkowitzSH.Intestinalinflammationandcancer[J].Gastroenterology, 2011,140(6):1807-1816.

[10]RaoCV,ReddyBS.NSAIDsandchemoprevention[J].CurrCancerDrugTargets, 2004,4(1):29-42.

[11]GhoshJ.Inhibitionofarachidonate5-lipoxygenasetriggersprostatecancercelldeaththroughrapidactivationofc-JunN-terminalkinase[J].BiochemBiophysResCommun, 2003,307(2):342-349.

[12]Martel-PelletierJ,LajeunesseD,ReboulP,etal.Therapeuticroleofdualinhibitorsof5-LOXandCOX,selectiveandnon-selectivenonsteroidalanti-inflammatorydrugs[J].AnnRheumDis, 2003,62(6):501-509.

[13]MassariME,MurreC.Helix-loop-helixproteins:regulatorsoftranscriptionineucaryoticorganisms[J].MolCellBiol, 2000,20(2):429-440.

[14]JubbAM,ChalasaniS,FrantzGD,etal.Aehaete-scutelike2 (ascL2)isatargetofWntsignallingandisupregulatedinintestinalneoplasia[J].Oncogene, 2006,25(24):3445-3457.

[15]vanderFlierLG,vanGijnME,HatzisP,etal.Transcriptionfactorachaetescute-like2controlsintestinalstemcellfate[J].Cell, 2009,136(5):903-912.

[16]ZiskinJL,DunlapD,YaylaogluM,etal.Insituvalidationofanintestinalstemcellsignatureincolorectalcancer[J].Gut, 2013,62(7):1012-1023.

[17]CadiganKM,WatermanML.TCF/LEFsandWntsignalinginthenucleus[J].ColdSpringHarbPerspectBiol, 2012,4(11):a007906.

[18]FanaliC,LucchettiD,FarinaM,etal.Cancerstemcellsincolorectalcancerfrompathogenesistotherapy:controversiesandperspectives[J].WorldJGastroenterol, 2014,20(4):923-942.

貴州省高層次人才科研條件特助基金資助項(xiàng)目(TZJF-2011-32)；貴州省科技計(jì)劃(黔科合S字[2007]1031)。

趙逵(E-mail： kuizhao95868@msn.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.44.014

R735.3

A

1002-266X(2016)44-0043-03

2016-01-20)