局部植入神經(jīng)干細胞/膠原支架復合體對大鼠脊髓損傷的修復作用觀察

孫慶治，周成福，李瑩

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江佳木斯154003)

局部植入神經(jīng)干細胞/膠原支架復合體對大鼠脊髓損傷的修復作用觀察

孫慶治，周成福，李瑩

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江佳木斯154003)

目的 觀察局部植入神經(jīng)干細胞/膠原支架復合體對大鼠脊髓損傷的修復作用。方法 分離、培養(yǎng)、鑒定SD大鼠神經(jīng)干細胞，將其植入膠原支架中，制備神經(jīng)干細胞/膠原支架復合體。取90只6周齡SD大鼠，隨機分為A、B、C組，各30只，均常規(guī)行左側脊髓半切術，制備T10脊髓半橫斷損傷模型;A組脊髓切除后于缺損區(qū)植入神經(jīng)干細胞/膠原支架復合體，B組脊髓切除后于缺損區(qū)植入膠原支架，C組脊髓切除后不作特殊處理。術后1～8周，每周分別對三組大鼠進行BBB評分(評價其左后肢運動功能)；術后第4、8周時，三組各處死大鼠15只，進行脊髓組織結構及病理形態(tài)觀察。結果 ①術后第4～8周時，A組大鼠的左下肢BBB評分明顯高于B、C組(P均<0.05)。②術后第4周時，A組大鼠脊髓內(nèi)支架與周圍組織連接緊密，有少量空洞形成；B組大鼠脊髓內(nèi)支架與周圍神經(jīng)組織形成纖維蛋白連接，并有較多空洞形成；C組大鼠脊髓缺損較大，缺損區(qū)周邊有較多神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞死亡。術后第8周時，A組大鼠脊髓內(nèi)有較多的神經(jīng)纖維生成，支架與周圍神經(jīng)組織形成一體，連接緊密，無空洞形成；B組大鼠脊髓內(nèi)衣支架與周圍神經(jīng)組織連接較緊密，有一定量的空洞形成；C組大鼠脊髓缺損區(qū)有島狀神經(jīng)組織形成，細胞排列不整，仍有大面積缺損區(qū)存在。③術后第4周時，A組大鼠脊髓缺損區(qū)的神經(jīng)纖維排列較規(guī)律，B組與C組脊髓缺損區(qū)排列雜亂。術后第8周時，A組脊髓缺損區(qū)神經(jīng)纖維排列有序，彼此間連接緊密；B組與C組脊髓缺損區(qū)神經(jīng)纖維，但仍雜亂，纖維之間不能形成突觸連接。結論 局部植入神經(jīng)干細胞/膠原支架復合體可以較好修復損傷的大鼠脊髓，并促進大鼠肢體運動功能的恢復。

脊髓損傷；神經(jīng)干細胞；膠原支架；神經(jīng)干細胞/膠原支架復合體；BBB評分

脊髓損傷患者會出現(xiàn)損傷平面以下的肢體感覺、運動喪失及大小便障礙[1]。目前，脊髓損傷的治療主要是通過手術對脊髓進行減壓及內(nèi)固定，但療效并不理想。近年來，有關干細胞移植治療脊髓損傷的研究較多，但效果不一。膠原蛋白可以引導神經(jīng)再生，具有免疫原性低、組織相容性好的特點[2,3]。2015年10月8日～2016年3月1日，我們將SD大鼠的神經(jīng)干細胞植入膠原支架中，制備神經(jīng)干細胞/膠原支架復合體，將其用于大鼠脊髓損傷的修復，并進行了觀察?，F(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、材料、主要試劑及儀器 SPF級6周齡SD大鼠共120只，體質(zhì)優(yōu)良，平均體質(zhì)量270 g，雌雄不限。膠原支架由佳木斯大學材料工程學院王晶教授課題組惠贈(新鮮牛筋膜剔除脂肪及肌肉成分后通過化學方法去除可溶性蛋白，干燥后就是有序的可用膠原蛋白，將其制備成2 mm3塊狀，即膠原支架)。DMEM/F12培養(yǎng)基，表皮生長因子(EGF)，無血清培養(yǎng)添加劑B27，堿性成纖維生長因子(bFGF)，多聚賴氨酸，巢蛋白(Nestin)溶液，核因子抗體。TC2323二氧化碳培養(yǎng)箱。

1.2 神經(jīng)干細胞/膠原支架復合體的制備 取6周齡SPF級SD大鼠30只，雌雄配對后隔離飼養(yǎng)，待乳鼠出生后24 h內(nèi)分離其海馬組織，切成1 mm×1 mm×1 mm組織塊，吸管反復吹打，使其呈懸液狀，200目濾網(wǎng)過濾懸液，制成均勻一致的細胞懸液，臺盼藍染色細胞懸液并觀察細胞存活情況。調(diào)整細胞密度為5×105/mL，接種于培養(yǎng)瓶中，加入20 ng/mL 的bFGF、20 ng/mL 的EGF和含2% B27的DMEM/F12培養(yǎng)液。將培養(yǎng)瓶放入 培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2、80%濕度)培養(yǎng)，3 d換液(半量換液)1次。細胞原代培養(yǎng)7 d后，高速離心細胞懸液得到神經(jīng)干細胞球，用吸管輕輕吹打細胞球后將其移入高速離心管內(nèi)離心，去除上清液后用小尖頭吸管繼續(xù)吹打，將神經(jīng)干細胞球制成單細胞懸液，臺盼藍染色，計算細胞存活率，細胞分瓶繼續(xù)傳代，7～10 d傳代1次。取第4代神經(jīng)干細胞球，制成單細胞懸液，種植在培養(yǎng)基上附片、固定，加入條件培養(yǎng)基24 h后，進行免疫組化染色鑒定,細胞表達Nestin作為神經(jīng)干細胞的標志。將提前備好的膠原支架進行消毒，在無菌環(huán)境下將神經(jīng)干細胞種植于膠原支架上。

1.3 SD大鼠脊髓損傷模型制作及神經(jīng)干細胞/膠原支架復合體植入 90只SD大鼠隨機分為A、B、C組，各30只。三組均常規(guī)行左側脊髓半切術，切除脊髓2 mm×3 mm×4 mm。A組脊髓切除后于缺損區(qū)植入神經(jīng)干細胞/膠原支架復合體，B組脊髓切除后于缺損區(qū)植入膠原支架，C組脊髓切除后不作特殊處理；三組常規(guī)縫合手術切口。術后輔助大鼠大小便，同時防止大鼠自食。

1.4 神經(jīng)干細胞/膠原支架復合體對SD大鼠脊髓損傷修復作用的觀察 術后每周1次(每次觀察5 min)對三組大鼠進行BBB評分[8](評價其左后肢運動功能)，共8次。術后4周、8周時每組各處死大鼠15只，切取其T6～T12節(jié)段脊髓，固定24 h，制成薄切片，HE染色，鏡下觀察脊髓組織結構。采用免疫組化SP法對大鼠脊髓切片進行染色，觀察脊髓病理改變。

2 結果

2.1 術后三組大鼠左下肢BBB評分比較 術后第1～8周三組大鼠左下肢BBB評分比較見表1。

2.2 術后三組大鼠脊髓組織結構及病理改變 ①術后第4、8周時三組大鼠脊髓組織結構(見圖1)：術后第4周時，A組大鼠脊髓內(nèi)支架與周圍組織連接緊密，有少量空洞形成；B組大鼠脊髓內(nèi)支架與周圍神經(jīng)組織形成纖維蛋白連接，并有較多空洞形成；C組大鼠脊髓缺損較大，缺損區(qū)周邊有較多神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞死亡。術后第8周時，A組大鼠脊髓內(nèi)有較多的神經(jīng)纖維生成，支架與周圍神經(jīng)組織形成一體，連接緊密，無空洞形成；B組大鼠脊髓內(nèi)衣支架與周圍神經(jīng)組織連接較緊密，有一定量的空洞形成；C組大鼠脊髓缺損區(qū)有島狀神經(jīng)組織形成，細胞排列不整齊，仍有大面積缺損區(qū)存在。②術后第4、8周時三組大鼠脊髓病理改變(見圖2)：術后第4周時，A組大鼠脊髓缺損區(qū)的神經(jīng)纖維排列較規(guī)律，B組與C組脊髓缺損區(qū)神經(jīng)纖維排列雜亂。術后第8周時，A組脊髓缺損區(qū)神經(jīng)纖維排列有序，彼此間連接緊密；B組與C組脊髓缺損區(qū)神經(jīng)纖維仍雜亂，纖維之間不能形成突觸連接。

表1 術后第1～8周三組大鼠左下肢BBB評分比較(分，

注：與C組相比，*P<0.05；與B組相比，P<0.05。

3 討論

近年來，多數(shù)醫(yī)學研究人員提出通過材料學、分子生物學途徑來修復損傷的脊髓，但相關研究都沒有取得突破。本實驗利用神經(jīng)干細胞與組織工程材料有機結合形成的復合植入材料，誘導神經(jīng)干細胞修復受損的脊髓神經(jīng)，期望能為脊髓損傷的臨床治療提供新的研究方向。

注：a、b、c分別為術后第4周時A、B、C組大鼠脊髓組織結構，d、e、f分別為術后第8周時A、B、C組大鼠脊髓組織結構。

圖1 術后第4、8周時三組大鼠脊髓組織結構(HE染色，200×)

注：a、b、c分別為術后第4周時A、B、C組大鼠脊髓病理形態(tài)；d、e、f別為術后第8周時A、B、C組大鼠脊髓病理形態(tài)。

圖2 術后第4、8周時三組大鼠脊髓病理形態(tài)(免疫組化染色，200×)

脊髓損傷的動物實驗研究大多以SD大鼠作為實驗對象[4]。造成脊髓損傷的實驗方法較多，如Allen重物打擊法及改良方法、脊髓壓迫法、脊髓牽拉法、脊髓切割法等。無論選擇哪種方法，其目的就是要創(chuàng)造一個理想化、更接近臨床的脊髓損傷模型。理想的模型要具有操控性、重復性、穩(wěn)定性等特點[5～7]。脊髓切割法更符合這一要求，所以在本研究中選擇此種方法制備脊髓損傷模型。在脊髓損傷模型制備中，以T10為中心，造成脊髓損傷，原因是大鼠胸段脊髓損傷椎板咬除便利，且可以避開排便神經(jīng)，更便于術后護理[8]。要保證術后大鼠存活率，要求用同一方法制備脊髓損傷模型[9,10]，并做到以下幾點：①術后的大鼠分開飼養(yǎng)，避免擁擠及踩踏事件的發(fā)生；②手術操作過程中要細心、輕柔，造成的創(chuàng)傷不能太大，避免損傷硬脊膜；③因隨著脊髓損傷節(jié)段的增高，實驗動物的死亡率增高，故損傷的脊髓節(jié)段不要太高，一般選擇T9或T10節(jié)段[11,12]，本研究選擇的是T10節(jié)段；④造成脊髓損傷后，用抗生素反復沖洗傷口，持續(xù)肌注抗生素至術后第3天，通過觀察大鼠尿路感染情況及大鼠的狀態(tài)來決定是否停用抗生素；⑤術后給予大鼠皮下注射生理鹽水2 mL，保證大鼠水分充足；⑥術后每天給大鼠擠尿，5 min/次，2次/d，1周后恢復大鼠的自主排尿；⑦保持大鼠籠舍干爽，每2天換1次窩內(nèi)墊料；⑧每天用白熾燈照射鼠舍2 h,保證大鼠舍內(nèi)溫度適宜[13,14]。

在本研究中，BBB評分結果表明，在術后前4周三組大鼠左下肢運動功能恢復較快，第5～8周左下肢功能恢復較慢，其中A、B組比C組左后肢運動功能恢復快，A組大鼠左后肢運動功能恢復最好。組織學觀察可見，術后第4周時A組大鼠脊髓內(nèi)支架與周圍組織連接緊密、有少量空洞形成，術后第8周時大鼠脊髓內(nèi)有較多的神經(jīng)纖維生成、支架與周圍神經(jīng)組織形成一體且連接緊密、無空洞形成；術后第4周時B組大鼠脊髓內(nèi)支架與周圍神經(jīng)組織形成纖維蛋白連接、有較多空洞形成，術后第8周時大鼠脊髓內(nèi)支架與周圍神經(jīng)組織連接較緊密、有一定量的空洞形成；術后第4周時C組脊髓缺損較大、缺損周邊有較多神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞死亡，術后第8周時脊髓缺損面積減少、缺損區(qū)有散在神經(jīng)組織形成、細胞排列不整、仍有大面積缺損存在。無論術后第4周時還是第8周時，A組大鼠脊髓的恢復均優(yōu)于B、C組，第8周時其支架與周圍神經(jīng)組織形成一體，更能促進神經(jīng)的恢復。病理觀察可見，A組脊髓損傷處有較多的新生神經(jīng)纖維，能更好地與原有周圍神經(jīng)組織形成連接，而B組與C組脊髓損傷處僅有較少的神經(jīng)纖維生長，更能說明A組的處置方法可以為神經(jīng)纖維的生成提供良好的生物環(huán)境。

綜上所述，局部植入神經(jīng)干細胞/膠原支架復合體可以較好修復損傷的大鼠脊髓，并促進大鼠肢體運動功能的恢復。

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黑龍江省教育廳科學技術研究項目(12531717)。

李瑩(E-mail： sqz_sun@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.43.013

R744

A

1002-266X(2016)43-0044-03

2016-04-01)