2個煙草品種體內(nèi)毒性差異的比較

李佳美，魏克強，馮迎航

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006）

2個煙草品種體內(nèi)毒性差異的比較

李佳美，魏克強，馮迎航

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006）

以2個不同基因型煙草品種（NDY-1和NDY-2）卷制的單料煙，分別持續(xù)煙熏SD大鼠56 d，檢測其脾組織中活性氧自由基（ROS）、丙二醛（MDA）、蛋白質(zhì)羰基（PC）的含量和DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)（DPC）系數(shù)以及病理變化。結(jié)果表明，與健康對照組（新鮮空氣暴露）相比，隨著暴露時間的延長，試驗大鼠脾組織的ROS，MDA，PC和DPC水平均顯著升高，脾組織呈現(xiàn)明顯的病理變化；與NDY-1組相比，NDY-2組脾組織的氧化損傷、病理損傷較輕。說明NDY-2煙樣較NDY-1煙樣的體內(nèi)毒性效應(yīng)較小。

煙草品種；煙霧暴露；脾組織；氧化損傷

不同基因型煙草品種的化學(xué)成分差異顯著，進而影響了卷煙制品的品質(zhì)和安全性[1-6]。煙絲燃燒后，固有化學(xué)成分的差異會造成釋放的煙霧化學(xué)成分在組成和含量上發(fā)生變化[7]，最終導(dǎo)致不同的毒理學(xué)效應(yīng)[8]。因此，比較不同煙草材料的體內(nèi)毒性差異對優(yōu)良煙草品種的選育具有重要的意義。研究表明，香煙煙霧的成分極其復(fù)雜，富含ROS和其他氧化劑，進入血液會引起全身的氧化應(yīng)激效應(yīng)，這些氧化應(yīng)激最終造成機體多種靶器官的嚴重損傷[9]。脾臟作為人體最大的免疫器官，含有多種免疫細胞和因子，是免疫應(yīng)答發(fā)生的重要場所。蛋白質(zhì)是抗體、補體等重要免疫成員的主要組成成分，蛋白質(zhì)的氧化損傷會影響其免疫功能。核酸的氧化損傷產(chǎn)物（DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)）會對DNA的構(gòu)象和功能產(chǎn)生影響，也會影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能。另外，煙氣中的自由基和其他氧化劑會氧化生物膜上的多不飽和脂肪酸，使脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，進而影響免疫細胞膜受體、膜蛋白酶和離子通道的功能。

本試驗利用煙霧熏吸法染毒SD大鼠[10]，通過檢測其脾組織的ROS含量、氧化損傷效應(yīng)（MDA和PC含量、DPC系數(shù)）以及病理變化，比較2個煙草品種的體內(nèi)毒性效應(yīng)，旨在為卷煙工業(yè)篩選優(yōu)質(zhì)的原料提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗動物

健康清潔級SD大鼠（雄性，6周齡，體質(zhì)量約150 g），購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。飼養(yǎng)于恒溫恒濕（（24±2）℃，40%～60%）清潔室內(nèi)，晝夜自然采光，動物自由取食和飲水，適應(yīng)環(huán)境7 d后開始試驗。2個測試用煙草品種由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草育種研究室提供；單料煙NDY-1和NDY-2由山西昆明煙草有限責(zé)任公司卷制。

1.2 染毒與采樣

參考Hidir Pekmez等[11]的方法，將試驗動物分為1個空白對照組和2個煙熏處理組，每組9只，同時設(shè)3個平行。對照組大鼠吸入新鮮空氣；處理組大鼠分別用NDY-1，NDY-2煙樣進行暴露染毒：將試驗動物放入自制玻璃吸煙箱（100 cm×80 cm× 60 cm）內(nèi)，每天煙熏2次，上午、下午各1次，每次10支香煙，2次間隔4 h，一周內(nèi)暴露6 d。各組試驗動物分別于暴露14，28，56 d隨機取3只大鼠采樣，腹腔注射3%戊巴比妥鈉（4.5 mL/kg）麻醉大鼠，解剖取脾組織。生理鹽水置于冰上預(yù)冷后清洗組織，用濾紙吸干，取其中的一部分稱質(zhì)量，按照質(zhì)量（g）與體積（mL）比為1∶9的比例加入預(yù)冷生理鹽水，制備成10%組織勻漿，然后低溫3 000 r/min離心15 min，上清保存在液氮中。另一部分用甲醛固定，進行組織病理學(xué)觀察。

1.3 測定項目及方法

按照Curtin等[12]的方法檢測脾組織中的ROS含量。將190 μL的5%脾組織勻漿液與10 μL的0.1 mmol/L DCFH-DA溶液充分混勻后，加入酶標(biāo)板中。將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀（Spectra MaxM5）中，設(shè)置為37℃，30 min后測其熒光強度（FI）值（485，538 nm），單位表示為每毫克蛋白的熒光強度值（A.U./mg）。利用考馬斯亮藍蛋白試劑盒測定脾組織中的蛋白質(zhì)含量。按照試劑盒的說明書測定脾組織中的MDA含量。

按照Levine等[13]的方法測定脾組織PC含量。將900 μL 10%脾組織勻漿液和100 μL 10%硫酸鏈霉素溶液混勻后放置10 min，然后11 000 r/min 4℃離心10 min。上清液用于測定羰基含量，即利用2，4-二硝基苯肼（DNPH）比色法，羰基含量表示為：蛋白羰基含量＝（A/C）×稀釋倍數(shù)。單位表示為每毫克蛋白質(zhì)中羰基的納摩爾（nmol）數(shù)。其中，A為吸光值，C為消光系數(shù)。

組織DPC系數(shù)的測定按照Merk等[14]的技術(shù)：取10%脾組織勻漿上清液500 μL，加2%SDS溶液500 μL，振蕩，65℃水浴鍋中放置10 min。再加入100 μL 1 mol/L KCl，用移液槍吹打6次，置于冰上5 min，白色沉淀形成，低溫10 000 r/min下離心10 min后分離沉淀和上清液。沉淀中加入1 mL清洗緩沖液，65℃水浴鍋中放置10 min，再放在冰上5 min，然后于10 000 r/min離心10 min，這樣清洗3次。最后沉淀加0.5 mL清洗緩沖液和0.5 mL蛋白酶K，50℃消化3 h后，置于冰上5 min，最后12 000 r/min 4℃離心10 min。分別取自由DNA上清和交聯(lián)DNA上清0.4 mL，加入等量的熒光染料（Hoechst 33258，400 ng/mL），于暗室中放置30 min。分別檢測交聯(lián)DNA與自由DNA的熒光強度（350，460 nm）。DPC系數(shù)＝交聯(lián)DNA/（交聯(lián)DNA＋自由DNA）。

1.4 脾組織病理觀察

固定的脾組織按照常規(guī)方法切片，H.E.染色后，在光學(xué)顯微鏡（Olympus BX51，日本）下觀察并拍照。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析和差異顯著性檢驗。試驗結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙霧暴露對脾組織的氧化損傷效應(yīng)

煙霧暴露后各組試驗動物脾組織中的ROS，MDA，PC含量以及DPC系數(shù)如圖1所示。

從圖1可以看出，與健康大鼠相比，隨著暴露時間的延長，各處理組的ROS含量顯著升高，且在暴露56 d時，NDY-1和NDY-2組分別較對照組提高了182.17%和85.05%（P＜0.05）；與NDY-1組相比，NDY-2組的ROS含量在暴露14，56 d時顯著降低（P＜0.05）。

MDA，PC含量和DPC系數(shù)是表征組織細胞氧化損傷的典型生物標(biāo)志物。

從圖1還可以看出，與健康大鼠相比，56 d的暴露期間NDY-1，NDY-2組的MDA，PC含量以及DPC系數(shù)均顯著增加，在暴露56 d時NDY-1組分別較對照組提高了181.04%，153.46%和73.68%（P＜0.05）；NDY-2組分別較對照組提高了54.49%，70.25%和47.26%（P＜0.05）。與NDY-1組相比，在暴露56 d時，NDY-2組的MDA，PC含量以及DPC系數(shù)均顯著降低（P＜0.05），分別為NDY-1組的54.97%，67.17%和84.79%。這表明煙霧暴露造成了SD大鼠脾組織的氧化損傷；而且NDY-1組對于 SD大鼠脾組織的損傷程度較NDY-2組嚴重。

2.2 煙霧暴露對脾組織的病理損傷效應(yīng)

煙霧暴露56 d后各處理組大鼠脾組織的顯微結(jié)構(gòu)變化如圖2所示。對照組健康SD大鼠的脾組織結(jié)構(gòu)完整，紅髓、白髓分布清晰可見，紅髓由脾索和脾竇組成，白髓內(nèi)可見清晰的中央動脈和動脈周圍淋巴鞘，脾小結(jié)內(nèi)有明顯的生發(fā)中心，淋巴細胞排列緊密、結(jié)構(gòu)完整（圖2-1，4）。NDY-1組大鼠脾組織切片可見紅髓、白髓分布混亂，紅髓分布變得松散，脾索、脾竇分布混亂，白髓中中央動脈管壁增厚，管腔明顯變窄，脾小結(jié)和淋巴細胞排列松散，脾組織結(jié)構(gòu)遭到嚴重破壞（圖2-2，5）。與NDY-1組相比，NDY-2組大鼠脾組織的病理損傷較輕，紅髓、白髓分布較為清晰，脾索、脾竇結(jié)構(gòu)大致完整，部分脾小結(jié)可見排列松散，中央動脈管壁稍微增厚，動脈周圍淋巴鞘結(jié)構(gòu)完整，淋巴細胞排列稍有松散（圖2-3，6）。表明煙霧暴露后大鼠脾組織發(fā)生了明顯的病理變化，且2種煙樣的損傷程度具有一定差異，這與生化指標(biāo)所反映的結(jié)果基本一致。

3 討論

本研究以SD大鼠脾組織的氧化損傷和病理變化為切入點，比較了2個煙草品種的體內(nèi)毒性差異，為卷煙工業(yè)篩選優(yōu)質(zhì)原料提供理論依據(jù)。結(jié)果顯示，2個基因型煙草的香煙煙霧暴露均能誘發(fā)SD大鼠脾組織發(fā)生氧化損傷和病理變化。Yilmaz等[15]研究表明，煙霧暴露后脾組織中MDA含量顯著上升，病理損傷明顯[16]，與本試驗結(jié)果一致。香煙煙霧含有大量的自由基，進入機體后大量消耗抗氧化物；當(dāng)ROS的積累超過抗氧化系統(tǒng)的防御能力時，就會導(dǎo)致生物大分子的氧化損傷。MDA，PC和DPC是反映機體氧化損傷的敏感標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，隨著煙霧暴露時間的延長，SD大鼠的MDA，PC含量以及DPC系數(shù)均顯著上升，說明持續(xù)煙熏導(dǎo)致機體的抗氧化防御系統(tǒng)受損，過量的ROS造成脾組織生物大分子的氧化損傷，最終導(dǎo)致病理變化。

本試驗還發(fā)現(xiàn)，與NDY-1組相比，NDY-2組的ROS，MDA，PC含量以及DPC系數(shù)較小，且在暴露56 d時差異顯著（P＜0.05）；NDY-2組的脾組織病理損傷程度比較輕微。說明NDY-2煙霧暴露對機體造成的危害較小，這可能與其基因型和化學(xué)成分組成等因素密切相關(guān)[8]。通過育種措施進一步降低煙草的有害化學(xué)成分可能是減緩或降低煙氣毒害作用的有效措施[17-20]。

志謝：感謝山西農(nóng)業(yè)大學(xué)魏治中教授、山西昆明煙草有限責(zé)任公司總經(jīng)理陳景云及技術(shù)中心總監(jiān)樊杰先生為本研究提供的幫助！

［1］程昌新，盧秀萍，許自成，等.基因型和生態(tài)因素對煙草香氣物質(zhì)含量的影響[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2005（11）：137-139，182.

［2］潘義宏，周麗娟，王娟，等.煙葉安全性影響因素及其關(guān)鍵農(nóng)業(yè)控制技術(shù)研究進展[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，42（5）：5-11.

［3］林躍平，周清明，王業(yè)建.影響煙草生長、產(chǎn)量和品質(zhì)的因子的研究進展[J].作物研究，2006（5）：490-493.

［4］趙曉丹，史宏志，錢華，等.不同類型煙草常規(guī)化學(xué)成分與中性致香物質(zhì)含量分析[J].華北農(nóng)學(xué)報，2012，27（3）：234-238.

［5］王欣英，李文慶，張興海，等.前茬作物營養(yǎng)對煙草生長和品質(zhì)的影響[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006（2）：42-46.

［6］丁燕芳，楊鐵釗，李亞培，等.生態(tài)與品種及其互作對烤煙多酚類物質(zhì)的影響[J].中國煙草科學(xué)，2013（1）：17-21.

［7］耿召良，張婕，葛永輝，等.烤煙主流煙氣內(nèi)源有害成分與煙葉化學(xué)成分相關(guān)性[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2015，26（5）：1447-1453.

［8］曹易懿，欒洋，鄭賽晶，等.烤煙和白肋煙的致突變作用和細胞毒性的對比研究[J].職業(yè)與健康，2012，28（16）：1937-1940.

［9］趙保路.吸煙、自由基與健康 [J].生物物理學(xué)報，2012，28（4）：332-340.

［10］寧維，陳利平，李瑜，等.卷煙煙氣體內(nèi)安全評價方法研究[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，42（9）：152-156.

［11］Hidir P，Ilter K，Neriman C，et al.The protective effects of caffeic acid phenethyl ester（CAPE）against liver damage induced by cigarette smoke inhalation in rats[J].Cell Biochemistryand Function，2007，25：395-400.

［12］Curtin J，Donovan M，Cotter T G.Regulation and measurement of oxidative stress in apoptosis[J].Journal of Immunological Methods，2002，265（1/2）：49-72.

［13］Levine R L，Garland D，Oliver CN，et al.Determination ofcarbonyl content in oxidatively modified proteins[J].Methods in Enzymology，1990，186：464-478.

［14］ MerkO，ReiserK，SpeitG.Analysisof chromate-induced DNA-protein crosslinks with the comet assay[J].Mutation Research，2000，471（1/2）：71-80.

［15］Yilmaz S，Benzer F，Ozan S，et al.Oxidative damage and arginase activity in tissues of rats exposed to cigarette smoke[J].Revue De Medecine Veterinaire，2008，159（2）：79-86.

［16］張永芳.被動吸煙對小白鼠部分器官組織形態(tài)學(xué)上的影響[D].大連：遼寧師范大學(xué)，2009.

［17］潘武寧，李復(fù)新，首安發(fā)，等.先曬后烤調(diào)制方式對賀州曬黃煙質(zhì)量的影響[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，21（12）：122-125.

［18］劉世亮，杜君，化黨領(lǐng)，等.不同有機酸對烤煙不同成熟度煙葉香氣質(zhì)量的影響[J].華北農(nóng)學(xué)報，2010，25（1）：131-135.

［19］黃天輝，張靜，田兆福，等.中草藥添加劑降低卷煙有害物質(zhì)研究進展[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，44（4）：4-8.

［20］趙銘欽，蘇長濤，姬小明，等.不同成熟度對烤后煙葉物理性狀、化學(xué)成分和中性香氣成分的影響[J].華北農(nóng)學(xué)報，2008，23（3）：146-150.

Comparative Studies of Two Different Tobaccosin vivoToxicity

LI Jiamei，WEI Keqiang，F(xiàn)ENGYinghang
（College ofLife Sciences，Shanxi University，Taiyuan 030006，China）

This study analyzed the toxicity effect of two genotypes tobacco to provide theoretical basis for the choice of high quality tobacco.The SDrats were exposed todifferent cigarette smoke（NDY-1 and NDY-2）for 56 d.The spleen tissue ofeach group was measured,including the contents of reactive oxygen species（ROS）,malondialdehyde（MDA）and protein carbonyl（PC）,the coefficient of DNA-protein crosslinks（DPC）and histopathological examination.The results showed that the levels of ROS,MDA,PC and DPC were significantly increased（P＜0.05）in spleen ofthe experimental groups when compared with the control group.Histopathological examination showed that smoke exposure could induce pathological injury in spleen.Compared with the NDY-1 group,oxidative damage and pathological injuryin NDY-2 group were significantlyreduced.The results indicated that NDY-2 tobaccowas relativelyless toxicitythan the NDY-1 tobacco.

tobaccovariety;cigarette smoke exposure;spleen tissue;oxidative damage

S572

A

1002-2481（2016）06-0746-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.06.07

2016-03-07

國家煙草專賣局重點科技項目（110199901005）；山西省回國留學(xué)人員科研資助項目（2013-024）

李佳美（1990-），女，山西介休人，在讀碩士，研究方向：動物分子細胞生物學(xué)。魏克強為通信作者。