替米考星明膠微囊含量測定方法研究

張李琦，鄭明學(xué)，蘇曉晴，吉明霞，史晨婕，白瑞，貢鑫，席柔，張黎，徐之勇

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801）

替米考星明膠微囊含量測定方法研究

張李琦，鄭明學(xué)，蘇曉晴，吉明霞，史晨婕，白瑞，貢鑫，席柔，張黎，徐之勇

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801）

為了建立起科學(xué)、準(zhǔn)確的替米考星明膠微囊含量測定方法，試驗(yàn)分別建立了紫外分光光度法（UV）及高效液相色譜法（HPLC）2種方法，同時(shí)對2種分析方法的專屬性、線性、準(zhǔn)確度、精密度進(jìn)行比較驗(yàn)證。結(jié)果表明，UV測得替米考星對照品與替米考星微囊均在（291±1）nm波長處有最大吸收峰，且HPLC測得二者的順反異構(gòu)體的保留時(shí)間基本一致，2種方法輔料均無干擾；線性關(guān)系試驗(yàn)中，替米考星對照品溶液在質(zhì)量濃度為30.0～90.0 μg/mL范圍內(nèi)，2種方法均表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，且R2紫外＝0.999 4＜R2液相＝0.999 5；準(zhǔn)確度試驗(yàn)中，2種方法的平均回收率均在98.0%～102.0%，RSD均小于2%，但紫外法測得質(zhì)量濃度45 μg/mL的供試品平均回收率為97.98%，沒有達(dá)到規(guī)定要求；精密度試驗(yàn)中，2種方法的RSD均小于2%。因此，UV法與HPLC法都基本滿足測定替米考星明膠微囊含量的要求，而采用HPLC法測定則更為準(zhǔn)確，其可以用作對替米考星明膠微囊進(jìn)行質(zhì)量控制的測定方法。

替米考星明膠微囊；含量測定；高效液相色譜法；紫外分光光度法

替米考星是由英國Elanco公司于20世紀(jì)80年代開發(fā)研制的一種畜禽專用抗生素，其對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌活性的抑制顯著，同時(shí)對多種螺旋體和支原體的生長具有較強(qiáng)的抑制作用[1-2]。替米考星明膠微囊是山西農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)病理實(shí)驗(yàn)室以B型明膠為囊材、替米考星為芯材，通過單凝聚法制備而成。目前，測量替米考星含量最常用的分析方法有HPLC法和UV法；而用于替米考星明膠微囊含量測定的分析方法國內(nèi)外尚未見報(bào)道。

本試驗(yàn)分別建立了UV法和HPLC法2種測定方法，且依據(jù)《獸用化學(xué)藥物質(zhì)量控制分析方法驗(yàn)證技術(shù)指導(dǎo)原則》[3]和《中華人民共和國獸藥典》[4]中相關(guān)規(guī)定對2種方法的專屬性、線性、準(zhǔn)確度、精密度等進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，并對所采用分析方法的科學(xué)性、準(zhǔn)確性和可行性進(jìn)行驗(yàn)證，以比較分析方法是否符合測試項(xiàng)目的目的和要求，從而建立替米考星明膠微囊的測定方法，以保證所用的分析方法確實(shí)能夠用于替米考星明膠微囊的質(zhì)量控制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑替米考星對照品（含量99.8%），北京索萊寶科技有限公司（ST9180）；替米考星原料藥（含量99%），寧夏泰瑞制藥股份有限公司（G8141235）；替米考星明膠微囊，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)病理實(shí)驗(yàn)室自制（201512）；胰酶，北京索萊寶科技有限公司（T8150）；四氫呋喃（色譜純），天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所（20150405）；二丁胺（色譜純），天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所（20150302）；乙腈（色譜純），飛世爾實(shí)驗(yàn)器材（上海）有限公司（A998-4）。1.1.2主要儀器UV-5200型紫外可見光分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；ThermoU3000高效液相色譜儀（戴安中國有限公司）。

1.2 試劑的配制

1.2.1 胰酶液的配制[4]其參照《中華人民共和國獸藥典》（2010版）進(jìn)行。

1.2.2 UV法所需試劑的配制

1.2.2.1 替米考星對照品系列質(zhì)量濃度的配制精密稱取實(shí)際含量50 mg的替米考星對照品，用0.1 mol/L的鹽酸溶液分別配制30.0，40.0，50.0，60.0，70.0，80.0，90.0 μg/mL系列濃度的替米考星對照品溶液[5]。

1.2.2.2 替米考星明膠微囊及空白明膠微囊溶液的配制[6-7]精密稱取經(jīng)研磨的替米考星明膠微囊0.1 g，置于100 mL燒杯中，加50 mL胰酶液，放于45℃超聲波清洗器內(nèi)超聲6 h，期間每隔0.5 h超聲（28 Hz，40 W）一次，每次15 min，于6 h后加入0.1 mol/L鹽酸溶液定容至100 mL容量瓶內(nèi)，搖勻，用0.5 μm濾膜過濾，即得1 mg/mL的替米考星明膠微囊母液。用同樣方法配制空白明膠微囊溶液。

1.2.3HPLC法所需試劑的配制

1.2.3.1 磷酸稀釋液、磷酸二丁胺緩沖溶液配制其參照《中華人民共和國獸藥典》（2010版）進(jìn)行[4]。

1.2.3.2 替米考星對照品系列濃度配制[15]其參照

1.2.2.1 替米考星對照品溶液的配制，注意改用磷酸稀釋液稀釋定容各濃度替米考星對照品溶液。

1.2.3.3 替米考星明膠微囊溶液的配制[9-10]參照

1.2.2.2 替米考星明膠微囊及空白明膠微囊溶液的配制，注意將0.1 mol/L鹽酸改用磷酸稀釋液稀釋，定容替米考星明膠微囊母液。用同樣方法配制空白明膠微囊溶液。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 UV法專屬性測定取替米考星對照品溶液、替米考星明膠微囊溶液及空白明膠微囊溶液，利用紫外分光光度計(jì)在200～400 nm范圍內(nèi)掃描，根據(jù)紫外吸收圖譜確定替米考星的最大吸收波長[11]。

1.3.2 UV法標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立配制30.0，40.0，50.0，60.0，70.0，80.0，90.0 μg/mL的替米考星系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在確定的最大波長處測定對照品系列溶液的吸光度值（OD值），以對照品濃度（C）對OD值進(jìn)行線性回歸，建立替米考星微囊含量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得出回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性圖[12-13]。

1.3.3 UV法測定的準(zhǔn)確度取3份30 μg/mL的空白明膠微囊溶液于3個(gè)燒杯中，每份10 mL，分別添加10 mL質(zhì)量濃度為30，60，90 μg/mL的替米考星標(biāo)準(zhǔn)溶液，最終制備成15，30，45 μg/mL這3個(gè)質(zhì)量濃度的供試液，在最大波長處測定吸光度，重復(fù)3次。以空白明膠微囊為參比，計(jì)算3個(gè)不同添加質(zhì)量濃度的回收率、平均回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），各濃度下的平均回收率均應(yīng)在98.0%～102.0%，9個(gè)回收率數(shù)據(jù)的RSD應(yīng)不大于2.0%（表1）[14]。

1.3.4 UV法測定的精密度

1.3.4.1 重復(fù)性取同一批號的替米考星明膠微囊制成140，160，180 μg/mL這3種不同質(zhì)量濃度供試品溶液，以空白微囊為參比，在最大波長處測定吸光度，重復(fù)測定3次，進(jìn)行精密度測定，計(jì)算RSD，其RSD應(yīng)不大于2%[14]。

1.3.4.2 中間精密度按照重復(fù)性試驗(yàn)方法在另一時(shí)間換另一試驗(yàn)員再進(jìn)行一次試驗(yàn)，計(jì)算出RSD，其RSD應(yīng)不大于2%（表2）[14]。

1.3.5 HPLC法專屬性的測定色譜條件參考《中華人民共和國獸藥典》（2010版）[4]。精密量取10 μL替米考星對照品溶液和替米考星明膠微囊溶液、空白明膠微囊溶液進(jìn)樣，記錄替米考星對照品溶液與替米考星明膠微囊溶液的保留時(shí)間是否相同，及空白明膠微囊溶液在此保留時(shí)間處有無吸收，并比較記錄替米考星色譜峰分離度，替米考星順反異構(gòu)體分離度（R）不得小于2.0%[14-15]，且理論板數(shù)按替米考星順式峰計(jì)算，不低于3 000[4]。

1.3.6 HPLC法線性關(guān)系的測定配制同1.3.2替米考星對照品系列濃度溶液，進(jìn)樣記錄色譜圖，對每個(gè)濃度樣品測定3次，以測得的峰面積（A）對被測樣品濃度進(jìn)行線性回歸[16]。

1.3.7 HPLC法準(zhǔn)確度的測定按照1.3.3方法制備15，30，45 μg/mL這3個(gè)質(zhì)量濃度的供試液，各取10 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖。重復(fù)3次[17-18]，試驗(yàn)結(jié)果評定標(biāo)準(zhǔn)同1.3.3[9-10]（表3）。

1.3.8 HPLC法測定的精密度[19]

1.3.8.1 重復(fù)性取同一批號的替米考星明膠微囊制成140，160，180 μg/mL這3種質(zhì)量濃度供試品溶液，重復(fù)測定3次，每次取10 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算RSD，其RSD應(yīng)不大于2%[14-15]。

1.3.8.2 中間精密度按照重復(fù)性試驗(yàn)方法在另一時(shí)間換另一試驗(yàn)員再進(jìn)行一次試驗(yàn)，計(jì)算出RSD，其RSD應(yīng)不大于2%（表4）[14-15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 UV法專屬性試驗(yàn)結(jié)果

由圖1可知，替米考星對照品與替米考星微囊在200～400 nm處紫外掃描的最大吸收波長相同，均為（291±1）nm；干擾輔料空白明膠微囊在（291± 1）nm處幾乎無吸收，可見，UV法測定的替米考星明膠微囊專屬性良好。

2.2 UV法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線以對照品濃度（C）對OD（A）值進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為C＝41.322A－0.407 29（R2＝0.999 4），線性關(guān)系如圖2所示。由圖2可知，替米考星對照品在濃度在30.0～90.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 UV法準(zhǔn)確度測定結(jié)果

3種不同濃度的替米考星平均回收率為98.64%，其中，質(zhì)量濃度為45 μg/mL的平均回收率不在98.0%～102.0%之內(nèi)，RSD＜2%，說明UV法準(zhǔn)確度基本良好（表1）。

表1 UV法測定替米考星溶液準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

2.4UV法精密度測定結(jié)果

表2 UV法測不同濃度替米考星微囊溶液的精密度

UV法的重復(fù)性、中間精密度試驗(yàn)中，RSD值均小于2%，符合要求，說明UV測替米考星含量精密度良好（表2）。

2.5 HPLC法專屬性試驗(yàn)結(jié)果

從圖3可以看出，替米考星對照品與替米考星明膠微囊的順反異構(gòu)體保留時(shí)間基本一致，并且空白明膠微囊在此保留時(shí)間內(nèi)沒有色譜峰；替米考星樣品的順反異構(gòu)體分離度及塔板數(shù)符合要求；替米考星對照品的順反異構(gòu)體分離度及其塔板數(shù)符合要求。表明HPLC法測替米考星明膠微囊專屬性良好。

2.6 HPLC法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

以測得的峰面積（M）作被測樣品濃度（C）的函數(shù)作圖進(jìn)行線性回歸，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為C＝7.872 5M－1.055 8（R2＝0.999 5），線性關(guān)系如圖4所示。從圖4可以看出，替米考星對照品在30.0～90.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7 HPLC測準(zhǔn)確度結(jié)果

3種不同濃度的替米考星平均回收率為99.49%，RSD＜2%，說明HPLC法具有較高的準(zhǔn)確度（表3）。

2.8 HPLC法精密度測定結(jié)果

HPLC法的重復(fù)性、中間精密度試驗(yàn)中，RSD值均小于2%，符合要求，說明HPLC法測替米考星含量精密度良好（表4）。

表3 HPLC法測定替米考星溶液準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

表4 HPLC法測不同濃度替米考星微囊溶液的精密度

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，UV法與HPLC法都基本滿足測定替米考星明膠微囊含量的要求，在準(zhǔn)確度測定試驗(yàn)中，HPLC法與UV法相比，HPLC法回收率更高，RSD較低，說明其準(zhǔn)確度更高一些。宋艷紅等[5]在利用UV法測量替米考星含量的準(zhǔn)確度試驗(yàn)中得出，RSD為3.7%，不符合RSD值應(yīng)不大于2%的要求；而閆春芝等[15]、張旭東等[8]在利用HPLC法測量替米考星含量的準(zhǔn)確度試驗(yàn)中得出，其準(zhǔn)確度的各項(xiàng)指標(biāo)均滿足要求。綜上可以看出，UV法準(zhǔn)確度較差，HPLC法的準(zhǔn)確度更為精準(zhǔn)。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在利用2種不同分析方法測量替米考星線性關(guān)系的試驗(yàn)中得出，利用HPLC法測定替米考星標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系比UV法測定的線性關(guān)系結(jié)果更好（R2紫外＝0.9994＜R2液相＝0.9995）。證明HPLC法的準(zhǔn)確度要高于UV法。

有研究表明，UV法的專屬性不高，其主要誤差來源于共存物的譜線重疊而引起的光譜干擾；而HPLC法之所以有很高的準(zhǔn)確度，是因?yàn)槠涑Ｓ玫纳V柱具有很高的分離效能，可分離并分析高極性、高分子量和離子型等各種物質(zhì)，柱效非常高，每米可達(dá)3萬塊以上，而且分析速度很快，具有高精度、高穩(wěn)定性的特點(diǎn)[20]。

綜上所述，UV法和HPLC法均可用于測定替米考星明膠微囊含量，但后者的準(zhǔn)確度更高一些。

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Study on the Methods for Determination of the Content
of Timicosin Gelatin Microcapsules

ZHANGLiqi，ZHENGMingxue，SUXiaoqing，JI Mingxia，SHI Chenjie，BAI Rui，GONGXin，XI Rou，ZHANGLi，XUZhiyong
（College ofAnimal Science and VeterinaryMedicine，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

Toestablish a scientific and accurate methods for determination ofthe content oftimicosin gelatin microcapsules,this test compared UV and HPLC two kinds ofanalysis methods ofspecificity,linearity,accuracy and precision ofverification.The results showed that UVmeasured timicosin（reference substances）and timicosin gelatin microcapsules had the maximumabsorption peak at（291±1）nm, and the retention time of cis-trans-isomer measured by HPLC was basically the same,two methods of complementary makings were no interference.In linearitytests,the linear range oftimicosin solution was obtained within 30.0～90.0 μg/mL,and R2UV＝0.999 4＜R2HPLC＝0.999 5.In accuracytests,the average recoveryofthe twomethods was all between 98.0%-102.0%,and RSDofthe twomethods was less than 2%,but UV was not consistent with the request in the recoveryrate ofarticle in the 45 μg/mL.In precision tests,the RSD ofthe two methods was all less than 2%.Therefore,the UV and HPLC methods can meet the requirement of determination of timicosin gelatin microcapsules,and HPLCis more accurate,which can be used todetermine the timicosin gelatin microcapsules.

timicosin gelatin microcapsules;content determination;HPLC;UV

S816.73

A

1002-2481（2016）12-1848-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.12.27

2016-10-12

山西省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)雞產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（2013-11-03）

張李琦（1991-），男，山西定襄人，在讀碩士，研究方向：動(dòng)物傳染病診斷與防治。鄭明學(xué)為通信作者。