甘肅省某奶牛場腸桿菌性乳房炎主要病原菌的分離鑒定與耐藥性分析

王海瑞，王旭榮，張景艷，王 磊，曹明澤，李建喜，王學智

(中國農業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所,甘肅省新獸藥工程重點實驗室，甘肅蘭州 730050)

甘肅省某奶牛場腸桿菌性乳房炎主要病原菌的分離鑒定與耐藥性分析

王海瑞，王旭榮，張景艷，王 磊，曹明澤，李建喜*，王學智*

(中國農業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所,甘肅省新獸藥工程重點實驗室，甘肅蘭州 730050)

為查明甘肅省某奶牛場發(fā)生臨床型奶牛乳房炎的主要病原菌并選擇治療用敏感藥物，隨機無菌采集了6份臨床型病牛乳樣和1份大罐乳樣，采用劃線分離、菌落形態(tài)觀察、革蘭染色鏡檢、生化鑒定及16S rDNA序列分析等方法進行細菌分離鑒定，同時采用K-B法測定主要分離菌株對抗菌藥物的敏感性。結果表明，從臨床型乳房炎乳樣中分離鑒定出大腸埃希菌、芽胞桿菌、凝固酶陰性葡萄球菌(腐生葡萄球菌)3種細菌，其中大腸埃希菌的分離率最高，為66.67%；從大罐奶樣中也分離出大腸埃希菌。藥敏試驗結果表明，大腸埃希菌對氨芐青霉素、阿莫西林、頭孢噻吩、桿菌肽、紅霉素均存在不同程度的耐藥，耐藥率為29%～100%；對諾氟沙星、恩諾沙星、氟苯尼考、頭孢哌酮等藥物敏感。說明此次牛場臨床型乳房炎的主要病原菌是大腸埃希菌、葡萄球菌和芽胞桿菌，而且分離的大腸埃希菌具有多重耐藥性。根據檢測分析結果，給奶牛場提出針對性的防控措施，臨床型乳房炎的發(fā)病率下降，病情得以控制。

奶牛；腸桿菌；乳房炎；病原菌；藥敏試驗；耐藥

奶牛乳房炎是奶牛養(yǎng)殖中的常見臨床疾病之一，特別是在管理較差的牛場，臨床型乳房炎的發(fā)病率較高，可達33.41%，造成的經濟損失嚴重。細菌感染是引起奶牛乳房炎的主要原因，不同的細菌感染，造成的奶牛臨床表現和乳汁性狀不同，而且現在牛場病原菌的耐藥性不斷增強，因此確定臨床型乳房炎的致病菌種類并且進行藥物敏感性試驗是科學治療奶牛乳房炎的關鍵。

2015年5月，甘肅省某奶牛場發(fā)生臨床型乳房炎，主要表現為乳房紅腫、溫熱，乳汁性狀為淡黃色水樣乳汁，內混有絮狀物(呈豆腐渣樣)，產奶量嚴重下降。牛場對病牛采用藥物治療，治療效果不佳。本實驗室先進行疾病和牛場管理情況調查，隨機采集了6份臨床型病牛乳樣和1份大罐乳樣，進行細菌的分離鑒定，并分析主要分離菌對16種常用抗菌藥物的敏感性，為臨床治療合理選藥提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基與主要試劑 50 mL/L綿羊鮮血平板(簡稱血平板)購自江門市凱林貿易有限公司；麥康凱瓊脂、水解酪蛋白瓊脂MH培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯均購自廣東環(huán)凱生物科技有限公司；革蘭染液購自南京建成科技有限公司；Bacterial DNA Kit購自OMEGA BIO-TEK公司；16 S rDNA Bacterial Identification PCR Kit 購自寶生物工程(大連)有限公司；細菌微量生化鑒定管(兔血漿)購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司；VITEK 2 Compact全自動微生物分析專用的革蘭陽性細菌鑒定卡和革蘭陰性細菌鑒定卡購自bioMerieux,Inc；30 mL/L H2O2由實驗室自配。

1.1.2 OXOID藥敏紙片 選用氨芐西林(10 μg/片)、阿莫西林(10 μg/片)、頭孢噻吩(30 μg/片)、慶大霉素(10 μg/片)、卡那霉素(30 μg/片)、四環(huán)素(30 μg/片)、強力霉素(30 μg/片)、環(huán)丙沙星(5 μg/片)、諾氟沙星(10 μg/片)、桿菌肽(0.04 μ/片)、恩諾沙星(5 μg/片)、氟苯尼考 (30 μg/片)、紅霉素(15 μg/片)、替米考星(15 μg/片)、林可霉素 (2 μg/片)和復方新諾明 (25 μg/片)，直徑為5 mm，均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 疾病調查與樣品采集 對牛場的發(fā)病情況和飼養(yǎng)管理情況進行了詳細調查，主要表現為乳房紅腫、溫熱，乳汁性狀為淡黃色水樣乳汁，內混有絮狀物(呈豆腐渣樣)，產奶量嚴重下降。隨機無菌采集臨床型乳房炎病牛奶樣6份，大罐奶1份。

1.2.2 細菌的分離純化 將無菌采集到的乳樣搖勻，無菌環(huán)境下取10μL乳樣，間斷劃線接種于血平板上，有氧條件下，37 ℃培養(yǎng)18 h～20 h，觀察細菌的生長情況及菌落特征。對于18 h～20 h無菌生長的平板繼續(xù)培養(yǎng)至48 h。挑取典型單菌落進行涂片、革蘭染色、鏡檢，然后挑取典型菌落進行純化培養(yǎng)。純凈后的菌株用于下一步鑒定，否則繼續(xù)純化直到純凈為止。

1.2.3 生化鑒定 根據菌落形態(tài)和染色特性，初步判定細菌的屬別，然后分別進行生化鑒定。生化鑒定內容包括是VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)檢測、接觸酶試驗、血漿凝固酶試驗等。

1.2.4 16 S rDNA序列分析 按照試劑盒操作說明提取被檢細菌的DNA并以此為模板，按16 S rDNA bacterial Identification PCR kit說明擴增16 S rDNA片段，后進行核酸凝膠電泳。符合預期大小的擴增片段由北京六合華大基因科技股份有限公司測序，通過NCBI(http://ncbi.nlm.nih.gov/)的在線Blast軟件對獲取序列進行搜索比對，確定細菌種屬。

1.2.5 藥敏試驗 根據CLSI推薦的K-B法，游標卡尺測定抑菌圈的大小，重復3次計算其平均值。根據《CLSI的抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標準2014》判定該菌對藥物的敏感性。

2 結果

2.1 細菌鑒定結果

2.1.1 細菌菌落生長特性及染色特征 6份臨床型乳房炎乳樣和1份大罐奶樣均檢測出細菌，細菌檢出率為100%。經分離純化和革蘭染色鏡檢，共分離到10株3類形態(tài)特征不同的細菌。其中，2株G+長桿菌，菌體特征為單個或鏈狀排列，有芽胞(圖1A)，編號為L1、L9，在血平板上的菌落形態(tài)均為灰白色、略圓、邊緣比較整齊、表面光滑、濕潤、隆起的單個菌落；1株G+球菌，菌體特征為單個或葡萄串狀(圖1B)，編號為L2，在血平板上的菌落形態(tài)為灰白色、略小、表面光滑、濕潤、隆起的單個菌落；7株G-短桿菌，菌體特征為單個散在排列(圖1C)，編號為L3～L8、L10，在血平板上的菌落形態(tài)均為灰白色、圓形、邊緣整齊、表面光滑、濕潤、隆起、半透明的單個菌落，接種于麥康凱培養(yǎng)基上的菌落呈紅色、圓形隆起、邊緣整齊、表面光滑。

圖1 革蘭染色鏡檢(100×)

2.1.2 生化鑒定 L1和L9經VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定為放射根瘤菌；L2經VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定為人葡萄球菌人亞種；分離菌L3～L8、L10經VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定為大腸埃希菌。分離菌的培養(yǎng)特性、接觸酶試驗結果及兔血漿凝固酶試驗結果見表1，VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)結果見表2。

2.1.3 16 S rDNA序列分析 以提取的細菌DNA為模板，用16 S rDNA細菌鑒定PCR試劑盒擴增16 S rDNA片段，片段長度500 bp左右(圖2)。獲得片段序列通過NCBI的在線Blast軟件對獲取的序列進行搜索比對，菌株L1、L9與環(huán)狀芽胞桿菌(基因登錄號為NR-112632.1)的16S rDNA同源性為99%以上，故分離株L1、L9的鑒定結果為環(huán)狀芽胞桿菌；L2與腐生葡萄球菌(基因登錄號為NR-115607.1)的16S rDNA同源性為99%以上，確定L2為腐生葡萄球菌；L3～L8、L10均與大腸埃希菌(基因登錄號為(NR-102804.1)16S rDNA同源性為98%以上，故L3～L8、L10鑒定為大腸埃希菌，結果見表1。

表1 革蘭染色及生化分析結果

Table 1 Gram staining and biochemical analysis

編號№革蘭染色Gramstaining接觸酶試驗Catalase凝固酶試驗Coagulase麥康凱培養(yǎng)MacConkeyVITEK2鑒定結果IdentificationresultofVITEK216SrDNA鑒定Identificationof16SrDNAL1、L9++//放射根瘤菌(表2A)Rhizobiumradiobacter(Table2A)環(huán)狀芽胞桿菌BacilluscirculansL2++-/人葡萄球菌人亞種(表2A)Staphylococcushominissspho-monis(Table2A)腐生葡萄球菌Staphylococcussaprophytic-usL3～L8、L10-+/紅色菌落Redcolony大腸埃希菌(表2B)Escherichiacoli(Table2B)大腸埃希菌Escherichiacoli

注：“+”表示“陽性”；“-”表示陰性；“/”表示“未測定”。

Note：“+”means“posetive”；“-”means “negative”；“/”means “no test”.

表2 VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)檢測結果

Table 2 Biochemical analysis of VITEK 2 Compact

A L1、L9 L2 L1、L9 L2 L1、L9 L2苦杏仁苷AMY--磷脂酰磷脂酶CPIPLC--D-木糖dXYL--精氨酸雙水解酶1ADH1(-)-β-D-半乳糖苷酶BGAL--α-葡萄糖苷酶AGLU--丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶APPA--環(huán)式糊精CDEX--L-天冬氨酸芳胺酶AspA--β-半乳糖吡喃糖苷酶BGAR--α-甘露糖苷酶AMAN--磷酸酶PHOS--亮氨酸芳胺酶LeuA--L-脯氨酸芳胺酶ProA--β-葡萄糖醛酸酶BGURr--α-半乳糖苷酶AGAL--焦谷氨酸芳胺酶PyrA--β-D葡萄糖醛酸酶BGUR--丙氨酸芳胺酶AlaA--酪氨酸芳胺酶TyrA--D-山梨醇dSOR--尿素酶URE-+多粘菌素B耐受POLYB--D-半乳糖dGAL--D-核糖dRIB--L-乳酸鹽產堿ILATK--乳糖LAC-+N-乙酰-D-氨基葡萄糖NAG--D-麥芽糖dMAL--桿菌肽耐受BACI+-新生霉素耐受NOVO--6.5%NaCl生長NC6.5--D-甘露醇dMAN+-D-甘露糖dMNE+-甲烷-B-D-葡萄糖吡喃苷MB-dG+-支鏈淀粉PUL--D-棉子糖dRAF--0/129耐受O129R--水楊素SAL+-蔗糖SAC++D-海藻糖dTRE++精氨酸雙水解酶2ADH2s--奧普托辛耐受OPTO++BL3～L8、L10L3～L8、L10L3～L8、L10丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶APPA-側金盞花醇ADO+吡咯烷基芳胺酶PyrA-L-阿拉伯醇IARL-D-纖維二糖dCEL-β-半乳糖苷酶BGAL+H2S-β-N-乙酰葡萄糖苷酶BNAG-谷氨酰芳胺酶AGLTp-D-葡萄糖dGLU+γ-谷氨酰轉移酶GGT-葡萄糖發(fā)酵OFF+β-葡萄糖苷酶BGLU-D-麥芽糖dMAL+D-甘露醇dMAN+D-甘露糖dMNE+β-木糖苷酶BXYL-β-丙氨酸芳胺酶BAlap-L-脯氨酸芳胺酶ProA-酯酶LIP-古老塘糖LE-酪氨酸芳胺酶TyrA+尿素酶URE-D-山梨醇dSOR+蔗糖SAC-D-塔格糖dTAG-D-海藻糖dTRE+檸檬酸鹽(鈉)CIT-丙二酸鹽MNT-5-酮-葡萄糖苷5KG-乳酸鹽產堿ILATk+α-葡萄糖AGLU-琥珀酸鹽產堿SUCT+N-乙酰-β-半乳糖氨酶NA-GA-α-半乳糖苷酶AGAL+磷酸酶PHOS+氨基乙酸芳胺酶GlyA+鳥氨酸脫羧酶ODC-懶氨酸脫羧酶LDC+組氨酸同化IHISa-COURMARATECMT+β-葡萄糖苷酸酶BGUR+0/129耐受O129R-谷氨酸-甘氨酸-精氨酸芳胺酶GGAA-L-蘋果酸鹽同化IMLTa-ELLMANELLM+L-乳酸鹽同化ILATa-

注：“+”表示“陽性”；“-”表示陰性。

Note：“+”means“positive”；“-”means “negative”.

2.1.4 細菌鑒定結果分析 通過本實驗室對細菌進行的分離純化、革蘭染色、鏡檢、生化鑒定和16S rDNA序列分析，從病牛中分離到的L1、L9是環(huán)狀芽胞桿菌，L2是腐生葡萄球菌，L3～L8是大腸埃希菌。此外，從大罐奶中分離到的細菌L10是大腸埃希菌(表1)。由此認為造成此次發(fā)病的主要病原菌為大腸埃希菌。

2.2 藥敏試驗

以CLSI標準為參考，選擇藥敏片對大腸埃希菌進行藥敏試驗。大腸埃希菌對阿莫西林、慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、氟苯尼考以及復方新諾明敏感，對頭孢噻吩、桿菌肽、紅霉素、替米考星和林可霉素耐藥率分別為29%、100%、43%、43%和100%(圖3)。

圖2 分離菌的16 S rDNA PCR擴增

Fig.2 PCR amplication of 16 S rDNA of isolates

圖3 大腸埃希菌體外抑菌試驗結果

3 討論

3.1 致病菌分析

本次臨床型奶牛乳房炎乳樣檢測結果顯示，從臨床型乳房炎乳樣中分離到大腸埃希菌、環(huán)狀芽胞桿菌和腐生葡萄球菌3類細菌，分離率分別為66.67%、22.22%和11.11%；而且從大罐乳樣中也分離到大腸埃希菌。結合清水樣的乳汁性狀特征和牛場管理情況的實際調研，由此判定造成本場此次臨床型乳房炎發(fā)生的主要病原菌是大腸埃希菌，腐生葡萄球菌和芽胞桿菌是造成混合感染的條件致病菌。此結果遠高于之前國內文獻報道，袁永隆等[1]對23個省、市、自治區(qū)的40個大中型奶牛場進行乳房炎的流行病學調查發(fā)現，大腸埃希菌的感染率為17.14%；周慶國等[2]對佛山地區(qū)奶牛臨床型乳房炎大腸埃希菌分離率為50%；李宏勝等[3]對蘭州當地奶牛乳房炎大腸埃希菌分離率為24.44%；徐志光等[4]對新疆地區(qū)奶牛乳房炎大腸埃希菌分離率為29.64%；鄧海平等[5]對內蒙古地區(qū)奶牛臨床型乳房炎大腸埃希菌分離率為12.9%；郭海軍等[6]對無錫地區(qū)奶牛臨床型乳房炎大腸埃希菌分離率為15.7%；王娜等[7]對哈爾濱地區(qū)奶牛臨床型乳房炎大腸埃希菌分離率為19.6%。這種分離率的地域差異性可能與牛場的飼養(yǎng)條件和管理水平有關。結合牛場實際調研情況，該牛場環(huán)境衛(wèi)生控制相對較差，整體飼養(yǎng)管理也相對落后一些，感染腸桿菌機率較高。常見腸桿菌性乳房炎臨床表現為乳房腫脹，外軟內硬，乳汁呈水樣、迅速停止泌乳。有學者認為那些未被其他細菌感染的奶牛更容易感染上大腸埃希菌[8-9]。

3.2 VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)與16 S rDNA序列分析比較

VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)的檢測原理是將生化反應智能化和機械化，優(yōu)點是試驗操作人員的勞動力下降，缺點是單獨使用本方法對某些細菌的鑒定結果不準確。本試驗中，使用這兩種方法對分離菌L3～L8、L10鑒定結果一致，均為大腸埃希菌；L1和L9經VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定為放射根瘤菌，而16 S rDNA序列分析鑒定為環(huán)狀芽胞桿菌；L2經VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定為人葡萄球菌人亞種，而16 S rDNA序列分析鑒定為腐生葡萄球菌。國內之前也有報道VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)對凝固酶陰性葡萄球菌的鑒定存在一定的局限性[10]。根據本實驗室多年對細菌的檢測經驗，VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)結合菌落形態(tài)、顏色、溶血性等的觀察，涂片革蘭染色細菌形態(tài)和染色性的觀察，上機前或后加做補充試驗等，將有助于提高該系統(tǒng)的鑒定率和準確率[11]。16 S rDNA是編碼原核生物16 S rRNA的基因，長度約1 500 bp，存在于所有細菌、衣原體、支原體、立克次體、螺旋體和放線菌等原核生物的基因組中，有多個保守區(qū)和與之相間的多個可變區(qū)組成。保守區(qū)為所有細菌共有，細菌之間無顯著差異；可變區(qū)在不同細菌之間存在一定程度的差異，具有細菌屬或種特異性。因此，16 S rDNA已成為細菌鑒別與分類研究中較理想的靶序列[12]。由于這兩種檢測方法技術原理的不同，16 S rDNA比VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)更為準確，建議有條件的單位通過16 S rDNA序列分析對細菌進行鑒定。

3.3 藥物敏感性

根據藥敏試驗檢測結果，發(fā)現分離的大腸埃希菌對不同藥物的敏感性不同，對阿莫西林、慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、氟苯尼考以及復方新諾明敏感，而對頭孢噻吩、桿菌肽、紅霉素、替米考星和林可霉素均存在不同程度的耐藥現象。根據檢測分析結果，給奶牛場提出針對性的疾病感控措施，乳房炎的發(fā)病率下降，病情得以控制。國內外在針對奶牛乳房炎的治療上仍以抗菌藥物為主?？咕幬锏膹V泛使用，導致病原菌的耐藥性越來越強，耐藥譜也越來越廣，這給奶牛乳房炎的防治帶來了新的難題[13]。倪春霞等[14]研究表明，四川、甘肅和內蒙古地區(qū)乳樣中分離出的大腸埃希菌對喹諾酮類藥物高度敏感，對大環(huán)內酯類出現嚴重耐藥性；Sumathi B R等[15]報道，乳樣中分離到的大腸埃希菌對氨芐西林、新霉素等藥物產生耐藥性。由此可見，奶牛乳房炎大腸埃希菌在大量、長期頻繁使用抗菌藥的情況下已經產生了多重耐藥性。細菌耐藥性與抗菌藥物長期使用有關，在臨床治療過程中，如選擇幾種比較敏感的藥物合用或交替使用，減少單個藥物的使用劑量或使用時間，可減緩耐藥菌株的產生。目前已有大量報道表明，中藥在奶牛乳房炎防治中起到重要作用。除藥物防治外，更應保持環(huán)境的清潔、通風、干燥，貫徹“預防為主”的方針，建立合理的飼養(yǎng)管理制度，從根本上降低奶牛乳房炎的發(fā)病率[16-17]。

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Isolation，Identification and Drug Resistance Analysis of Main Pathogens from a Farm of Dairy Cows with Mastitis in Gansu Province

WANG Hai-rui,WANG Xu-rong,ZHANG Jing-yan,WANG Lei,CAO Ming-ze,LI Jian-xi,WANG Xue-zhi

(LanzhouInstituteofAnimalHusbandryandPharmaceuticalScienceofCAAS,MinistryofAgriculture,KeyLaboratoryofNewAnimalDrugProjectofGansuProvince,Lanzhou,Gansu,730050,China)

A clinical type of cow mastitis occurred in one dairy farm of Gansu.In order to find out the main pathogens and select effective drugs for clinic treatment, six milk samples from sick cows and one sample from miltank were collected randomly.The plate culture method,colonial morphology observation,Gram staining and microscopy detection,biochemical identification and 16 S rDNA sequence analysis were used to isolate and identify the bacteria.At the same time,K-B method was used to measure the sensitivity of the main isolated bacteria to antibacterials.The results showed that,Escherichiacoli,Bacillus, coagulase negativeStaphylococcus(Staphylococcussaprophytic) were isolated and identified from the clinical mastitis milk samples.The isolation rate ofE.coliwas the highest, 66.67%.E.coliwas also isolated from miltank. Susceptibility test result showed thatE.coliwas resistant to some drugs in varying degrees, such as ampicillin, amoxicillin, cephalothin, bacitracin and erythromycin,and drug resistance rate from 29% to 100%,and had the higher susceptibility to norfloxacin, enrofloxacin, florfenicol, cefoperazone. According to the results, the main pathogen of the clinical mastitis isE.coli,and opportunistic pathogens of mixed infection wereStaphylococcusandBacillus.The isolatedE.colihad strong multiple drug resistance. According to the assay results,specific control measures were proposed to the dairy farm to help to control the infection and decrease the incidence of clinical mastitis.

dairy cow; enterobacterium;mastitis; pathogen; susceptibility test; drug resistance

2015-10-16

國家奶牛產業(yè)技術體系科學家崗位項目(CARS37);公益性行業(yè)(農業(yè))專項(201303040-14)

王海瑞(1991-)，男，山東人，碩士研究生，主要從事動物疾病預防與控制工作。*通訊作者

S857.26

A

1007-5038(2016)05-0063-06