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    維生素C對(duì)紅細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用研究

    2017-01-06 09:05:17李嘉欣錢多解彩霞蘇燕
    關(guān)鍵詞:吸光溶解度細(xì)胞膜

    李嘉欣,錢多,解彩霞,蘇燕*

    (1.包頭醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,內(nèi)蒙古包頭 014060;2.包頭市第四醫(yī)院檢驗(yàn)科,內(nèi)蒙古包頭 014030)

    維生素C對(duì)紅細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用研究

    李嘉欣1,錢 多2,解彩霞1,蘇 燕1*

    (1.包頭醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,內(nèi)蒙古包頭 014060;2.包頭市第四醫(yī)院檢驗(yàn)科,內(nèi)蒙古包頭 014030)

    為了利用血紅蛋白釋放試驗(yàn)(HRT)檢測生理濃度維生素C(VC)對(duì)生理濃度過氧化氫(H2O2)氧化損傷后紅細(xì)胞的保護(hù)作用,用終濃度為0、0.15、0.3、0.4、0.6、0.7、0.85 mmol/L的VC溶液處理紅細(xì)胞懸液并進(jìn)行HRT。再分別用0、1.25、2.50、3.75、5.00 mL/L的H2O2溶液處理0.4 mmol/L VC作用后紅細(xì)胞懸液(VC保護(hù)組)和VC未作用的紅細(xì)胞懸液(對(duì)照組),測定紅細(xì)胞相對(duì)溶解度。結(jié)果表明,VC達(dá)到生理濃度時(shí),血紅蛋白再釋放量逐漸減弱;VC保護(hù)組紅細(xì)胞相對(duì)溶解度與對(duì)照組差別不大。說明生理濃度的VC能減弱HRT的血紅蛋白再釋放,降低紅細(xì)胞破膜率,但不能顯著降低H2O2對(duì)細(xì)胞膜的氧化損傷。

    維生素C;血紅蛋白釋放試驗(yàn);過氧化氫;氧化損傷

    維生素C(vitamin C, VC)是水溶性抗氧化物。已有研究表明,高濃度VC能夠有效維持紅細(xì)胞的功能和膜的完整性[1],避免氧化劑對(duì)紅細(xì)胞的損傷。過氧化氫(H2O2)是體內(nèi)產(chǎn)生的一種活性氧,如果不被及時(shí)清除,可以引發(fā)紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化,導(dǎo)致紅細(xì)胞膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和血紅蛋白(hemoglobin,Hb)的結(jié)構(gòu)改變,繼而引起紅細(xì)胞氧化溶血[2]。2007年,本研究組在進(jìn)行1例輕型β-地中海貧血患者的紅細(xì)胞電泳過程中偶然發(fā)現(xiàn)了Hb再釋放現(xiàn)象,依此創(chuàng)建了血紅蛋白釋放試驗(yàn)(hemoglobin releasing test,HRT)[3-5],并證實(shí)再釋放的Hb是與膜結(jié)合的Hb[6]。本研究旨在通過HRT檢測生理濃度VC作用后Hb再釋放變化,探討生理濃度VC對(duì)紅細(xì)胞膜的保護(hù)作用。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 血液標(biāo)本 60份正常成人新鮮肝素抗凝靜脈血,取自包頭市第四醫(yī)院檢驗(yàn)科的年輕體檢者。4℃保存,24 h內(nèi)檢測。

    1.1.2 主要儀器與試劑 高速離心機(jī),德國Eppendorf公司產(chǎn)品;全波長多功能酶標(biāo)儀,美國Thermo公司產(chǎn)品;水平電泳槽(DYY-III型)、穩(wěn)壓穩(wěn)流電源(DYY-2C),北京市六一儀器廠產(chǎn)品;17 cm×17 cm玻璃板等。EDTA、30%過氧化氫、硼酸、乙醇、四氯化碳、Tris、淀粉、氨基黑、冰醋酸等均為國產(chǎn)分析純;瓊脂糖,西班牙進(jìn)口分裝;維生素C注射液,0.25 g/mL,瑞陽制藥有限公司產(chǎn)品。

    1.2 方法

    1.2.1 紅細(xì)胞懸液和溶血液的制備 按照本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法制備紅細(xì)胞懸液和溶血液[7],分別用終濃度為0、0.15、0.3、0.4、0.6、0.7、0.85 mmol/L的VC溶液處理紅細(xì)胞懸液并進(jìn)行HRT。再將紅細(xì)胞懸液分為2組,每組5份。VC保護(hù)組加入等體積VC至終濃度為0.4 mmol/L,作用2 h后,兩組分別加入0,1.25、2.50、3.75、5.00 mL/L的等體積H2O2作用2 h。

    1.2.2 血紅蛋白釋放試驗(yàn) 按照本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法配制淀粉瓊脂糖混合凝膠[7],分別吸取各樣品紅細(xì)胞懸液10 μL加在1 cm×0.2 mm 濾紙條上,再依次插入凝膠,第1次電泳120 V,65 min,斷電5 min,120 V再次電泳60 min。泳畢,將膠板浸入氨基黑10 B中染色過夜,次日用50 g/L冰醋酸溶液反復(fù)漂洗至背景無色,觀察結(jié)果并拍照留圖。

    1.2.3 紅細(xì)胞相對(duì)溶解度 經(jīng)H2O2處理2 h后的樣品以3 000 r/min離心5 min,各取50 μL上清液,用生理鹽水稀釋6倍,測定540 nm處的吸光度,以溶血液50倍稀釋液的吸光度作為參照吸光值,計(jì)算各樣品的相對(duì)溶解度。

    1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用Graphpad Prism 5.0軟件處理,用Two-way Anova檢驗(yàn)分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 不同濃度VC作用后紅細(xì)胞懸液的血紅蛋白釋放比較

    隨著VC濃度逐漸升高,到達(dá)生理濃度(0.3、0.4、0.5 mmol/L)后,紅細(xì)胞再釋放量逐漸減弱,當(dāng)VC濃度超過生理濃度,達(dá)到0.6 mmol/L時(shí),再釋放量增多,VC濃度繼續(xù)升高時(shí),再釋放量又呈現(xiàn)降低趨勢(圖1、圖2)。

    1~7.0、0.15、0.3、0.4、0.6、0.7、0.85 mmol/L維生素C

    1-7.0,0.15,0.3,0.4,0.6,0.7,0.85 mmol/L vitamin C

    圖1 不同濃度VC作用后紅細(xì)胞懸液的Hb再釋放

    Fig.1 Hb release of erythrocytes suspension treated by different concentrations of VC

    圖2 凝膠電泳圖譜中釋放Hb的半定量分析

    2.2 紅細(xì)胞相對(duì)溶解度

    2.2.1 參照吸光值 溶血液的50倍稀釋液在540 nm處4次測得的吸光值平均值為0.626,以此為參照吸光值。相對(duì)溶解度=吸光值/參照吸光值×100%。

    2.2.2 不同濃度過氧化氫處理后對(duì)紅細(xì)胞膜的作用 用等體積0、1.25、2.50、3.75、5.00 mL/L的H2O2處理VC保護(hù)組和對(duì)照組紅細(xì)胞懸液,結(jié)果顯示,無H2O2處理時(shí),VC保護(hù)組破膜程度低于對(duì)照組(P<0.05),差異顯著。隨H2O2濃度增大,對(duì)照組破膜率雖有增強(qiáng),但變化不明顯;VC保護(hù)組破膜率較無H2O2處理時(shí)增強(qiáng)(P<0.05),差異顯著,但變化并不隨H2O2濃度的增大而改變,也沒有明顯低于對(duì)照組,兩組破膜率均在8.5%左右(圖3)。

    圖3 不同濃度H2O2處理紅細(xì)胞對(duì)細(xì)胞膜的相對(duì)溶解度

    3 討論

    紅細(xì)胞血紅蛋白釋放試驗(yàn)(HRT)是將未裂解的完整紅細(xì)胞懸液借助濾紙片加在淀粉-瓊脂糖混合凝膠中進(jìn)行電泳,電泳過程中進(jìn)行“通電-斷電-再通電”,就會(huì)出現(xiàn)Hb的再釋放區(qū)帶。在前期試驗(yàn)中,研究了高濃度VC對(duì)氧化損傷紅細(xì)胞的保護(hù)作用,結(jié)果顯示,高濃度VC對(duì)紅細(xì)胞膜氧化損傷具有保護(hù)作用,并能減弱Hb再釋放,降低氧化損傷后紅細(xì)胞的破膜率,發(fā)揮了VC對(duì)紅細(xì)胞膜的保護(hù)作用[8]。本研究進(jìn)一步將HRT應(yīng)用于觀察生理濃度VC對(duì)紅細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。HRT結(jié)果表明,當(dāng)無H2O2存在時(shí),VC濃度到達(dá)生理濃度時(shí),能夠降低Hb再釋放量;生理濃度VC作用后的紅細(xì)胞懸液的相對(duì)溶解度也低于對(duì)照組,說明缺乏VC會(huì)降低紅細(xì)胞膜的穩(wěn)定性,增大破膜率。當(dāng)VC濃度超過生理濃度繼續(xù)升高時(shí),Hb再釋放量呈現(xiàn)不穩(wěn)定增高或降低,原因尚不明確,有待于進(jìn)一步增加樣本量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

    機(jī)體氧化代謝產(chǎn)生的活性氧包括超氧陰離子(O2-)、H2O2、羥自由基(OH·)、單線態(tài)氧(1O2)等[9]。適量的活性氧是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的通路,而過量的活性氧則可導(dǎo)致DNA突變,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的改變,細(xì)胞膜脂質(zhì)的過氧化損害,以致造成機(jī)體免疫損傷[10-11]。紅細(xì)胞內(nèi)有多種抗氧化成分,包括NADH、NADPH、谷胱甘肽等,它們與VC一起對(duì)抗細(xì)胞的各種活性氧,保護(hù)細(xì)胞膜蛋白、Hb和酶蛋白的巰基等不被氧化,從而維持紅細(xì)胞的正常功能。本研究表明,向紅細(xì)胞懸液中加入生理濃度范圍內(nèi)的H2O2作用時(shí),VC保護(hù)組破膜率與對(duì)照組相比并沒有明顯差別,且與H2O2濃度沒有相關(guān)性,說明在生理濃度條件下,單純的添加VC不能明顯改變氧化劑對(duì)紅細(xì)胞膜的氧化損傷作用。在紅細(xì)胞的抗氧化體系中,VC是否與其他抗氧化成分相互作用,提高紅細(xì)胞自身的抗氧化能力,值得進(jìn)一步研究。

    [1] 詹 彤,陶 靖,唐榮才,等.維生素C對(duì)人全血紅細(xì)胞的抗氧化保護(hù)作用[J].中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志,2005,13(6):1106-1108.

    [2] 劉慧明,丁 航,侯 敢.槲皮素對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的人紅細(xì)胞過氧化損傷的抑制作用[J].廣東醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2003,21(4):317-318.

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    [6] 魏春華,蘇 燕,李曉晶,等.不同濃度過氧化氫處理紅細(xì)胞對(duì)血紅蛋白釋放的影響[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2014,35(3):64-67.

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    Protective Effect of Vitamin C on Oxidative Damage of Erythrocytes

    LI Jia-xin1, QIAN Duo2, XIE Cai-xia1, SU Yan1

    (1.DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,BaotouMedicalCollege,Baotou,InnerMongolia,014060,China; 2.ClinicalLaboratoryofTheFourthHospitalofBaotou,Baotou,InnerMongolia,014030,China)

    In order to use hemoglobin releasing test (HRT) to detect the protective effect of physiological concentration of vitamin C on erythrocytes treated by physiological concentration of hydrogen peroxide (H2O2), The final concentrations of 0, 0.15, 0.3, 0.4, 0.6, 0.7, 0.85 mmol/L vitamin C solution, were used to treat erythrocyte suspensions and HRT was conducted.Then 0, 1.25,2.50,3.75,5.00 mL/L H2O2solutions were used to treat 0.4mmol/L vitamin C treated erythrocyte suspension (vitamin C protection groups) and vitamin C untreated erythrocyte suspension (control groups) respectively,and the relative solubility of erythrocytes was measured.The results showed that the release of hemoglobin decreased gradually when the concentration of vitamin C reached to the physiological level.The relative solubility of erythrocytes in vitamin C protection groups had no significant difference from that of the control groups.It showed that the physiological concentration of vitamin C can decrease the release of hemoglobin by HRT,and decrease the rate of erythrocyte membrane breaking rate,but it can not significantly reduce the oxidative damage of H2O2on the cell membrane.

    vitamin C;hemoglobin releasing test;hydrogen peroxide;oxidative damage

    2015-10-13

    國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81160214);內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2010BS1101);內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)校科學(xué)研究項(xiàng)目(NJZY14265);秦文斌科技教育基金項(xiàng)目(201309);內(nèi)蒙古衛(wèi)生廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(2010056)

    李嘉欣(1982-),女,遼寧鞍山人,講師,碩士,主要從事血液保護(hù)研究。*通訊作者

    S852.21

    A

    1007-5038(2016)05-0060-03

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