雞MHCⅠα和β2m的原核表達(dá)與多克隆抗體的制備

戴 銀，王承志，劉生杰，沈?qū)W懷，趙瑞宏，胡曉苗，張丹俊*

(1.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽合肥 230031；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，安徽合肥 230036；3.阜陽師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽阜陽 236041)

雞MHCⅠα和β2m的原核表達(dá)與多克隆抗體的制備

戴 銀1，王承志2，劉生杰3*，沈?qū)W懷1，趙瑞宏1，胡曉苗1，張丹俊1*

(1.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽合肥 230031；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，安徽合肥 230036；3.阜陽師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽阜陽 236041)

為制備MHCⅠ基因工程疫苗的基礎(chǔ)材料，構(gòu)建了雞MHCⅠ分子重組質(zhì)粒并進(jìn)行原核表達(dá)，進(jìn)而制備雞MHCⅠ分子的多克隆抗體。應(yīng)用PCR方法，克隆雞MHCⅠα和β2m基因，構(gòu)建重組載體pET-MHCⅠα和pET-MHCⅠβ2m，經(jīng)PCR、雙酶切和測序鑒定后，將重組質(zhì)粒在大腸埃希菌Rosetta中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，融合蛋白純化后，接種昆明小鼠制備多克隆抗體，血清稀釋后用免疫印跡法(Western blot)分析。結(jié)果表明，雞MHCⅠα和β2m基因在大腸埃希菌中成功表達(dá)，融合蛋白分子質(zhì)量分別約為52.1 ku和33.0 ku；制備的鼠抗雞MHCⅠα和β2m鏈多克隆抗體，經(jīng)Western blot檢測證實(shí)抗體特異性較強(qiáng)，可進(jìn)一步用于雞MHCⅠ分子的研究。

雞MHCⅠ類分子；原核表達(dá)；多克隆抗體

主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)是一組緊密連鎖、高度多態(tài)的基因群，具有辨別自身與非己的獨(dú)特功能，同時(shí)又直接參與抵抗病原體入侵以及自身穩(wěn)定過程，因此在脊椎動物的移植排斥反應(yīng)、機(jī)體抗病力和免疫應(yīng)答等相關(guān)方面起極其重要的作用[1-4]。雖然不同個(gè)體、不同種屬的MHC分子結(jié)構(gòu)不同，但其編碼的分子在化學(xué)結(jié)構(gòu)、組織分布及功能上均十分相近，分為MHCⅠ類、MHCⅡ類和MHC Ⅲ類分子。其中MHCⅠ類分子主要識別并結(jié)合內(nèi)源性肽段，而外源性抗原的呈遞則由MHCⅡ類分子啟動。MHCⅠ類分子是一種由重鏈(α)和輕鏈(β2m)微球蛋白兩部分以非共價(jià)鍵結(jié)合組成的膜結(jié)合糖蛋白，在細(xì)胞介導(dǎo)的機(jī)體免疫應(yīng)答中起重要作用[5]。成熟的α鏈由胞外區(qū)域(α1、α2、α3)、以及跨膜區(qū)和胞質(zhì)尾區(qū)組成，其中α1和α2區(qū)是MHCⅠ類分子抗原抗原結(jié)合區(qū)域，具有高度的多態(tài)性[6-9]。β2m不直接參與MHCⅠ類分子的抗原遞呈過程，基因也較為保守，但能促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中新合成的MHCⅠ類分子向細(xì)胞表面運(yùn)輸，并對穩(wěn)定MHCⅠ類分子的結(jié)構(gòu)具有一定作用，使其發(fā)揮生物學(xué)功能具有重要意義[10-11]。為進(jìn)一步研究MHCⅠα和β2m分子特征，以及MHCⅠ類分子作為疫苗載體的可能性，本研究構(gòu)建了雞MHCⅠα和β2m基因原核表達(dá)載體，并將表達(dá)的融合蛋白免疫小鼠，獲得了具有特異性的多克隆抗體。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 8周齡～10周齡SPF級昆明鼠雌鼠12只，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.1.2 菌株、質(zhì)粒和主要試劑 淮南麻黃雞MHCⅠα、β2m鏈重組質(zhì)粒pMD18-T-MHCⅠα、pMD18-T-MHCⅠβ2m，原核表達(dá)載體pET-32a，Rosetta(DE3)菌株均由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所提供；Premix ExTaqDNA聚合酶、DNA Marker DL 2 000、T4 DNA連接酶、SalⅠ、EcoR V 、EcoRⅠ均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；IPTG、DTT、弗氏完全和不完全佐劑、小牛血清白蛋白(BSA)等為Sigma公司產(chǎn)品；羊抗鼠IgG為博士德生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 參照GenBank數(shù)據(jù)庫中已公布的雞MHCⅠα、β2m鏈cDNA序列(GenBank登陸號分別為：S78682、M84767)，用SingnalP 3.0 Serv 軟件分析蛋白信號肽，MEGA4軟件比對序列保守性，DNA Star軟件包分析雞MHCⅠα、β2m鏈基因抗原性、親疏水性及表面暴露性，同時(shí)參考原核表達(dá)載體pET-32a序列特征，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)2對特異性引物。pET-α-F，5′-ATGAATTCGCCGAGCTCCATACCCTG-3′(EcoR I)；pET-α-R，5′-ATGTCGACTGGCGGCTCCCACGAGTAGA -3′(SalI)。pET-β-F，5′-ATGGATATC AAGGCCGACCTGACGC-3′(EcoR V)；pET-β-R，5′-ATGAATTCGAACTCGGGATCCCACT-3′(EcoR I)。兩對引物分別擴(kuò)增882 bp和300 bp的雞MHCⅠα的3個(gè)胞外區(qū)域(α1、α2、α3)和成熟的β2m鏈基因。

1.2.2 雞MHCⅠα、β2m基因片段的擴(kuò)增 分別以重組質(zhì)粒pMD18-T-MHCⅠα、pMD18-T-MHCⅠβ2m為模板，擴(kuò)增MHCⅠα、β2m基因片段。反應(yīng)體系：10× PCR buffer 5.0 μL，dNTP Mixture 3.0 μL， 上、下游引物各1.0 μL，質(zhì)粒DNA 1.0 μL，TaqDNA 聚合酶0.5μL，加雙蒸水補(bǔ)足60μL。按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：95℃ 5 min；94℃ 1min，60℃(56 ℃) 1 min，72 ℃ 2 min，30 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸8 min。

1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用DNA凝膠回收試劑盒回收，酶切后連入pET-32a載體，16℃水浴過夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌Rosetta，涂布于含氨芐青霉素(Amp)的LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)過夜，初步篩選陽性克隆，用小量堿法提取質(zhì)粒。分別用EcoR I和SalI，EcoR I和EcoR V雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，同時(shí)用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR鑒定。重組質(zhì)粒分別命名為pET-MHCⅠα和pET-MHCⅠβ2m。陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行測序，用Blast軟件與已報(bào)道的相應(yīng)基因序列比對。

1.2.4 重組質(zhì)粒的原核表達(dá)與純化 分別挑取重組單菌落，按比例接入含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液，37℃靜置過夜培養(yǎng)。取上述培養(yǎng)物按比例接入含氨芐青霉素(Amp)的LB培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)至對數(shù)中期。取1 mL培養(yǎng)物為未誘導(dǎo)菌對照。加IPTG至終濃度1.0 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)，4 h后收集菌體進(jìn)行超聲破碎。將菌體裂解物進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。樣品全部處理后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，切取目的蛋白透析袋中，洗脫至無色，取出膠條，放于PBS 中過夜。次日收集純化的蛋白，用Folin-酚法檢測各融合蛋白的濃度。

1.2.5 多克隆抗體的制備 將已純化的抗原分別免疫8周齡～10周齡雌性昆明系SPF小鼠，共3組，包括試驗(yàn)組2個(gè)，對照組1個(gè)，4只/組。初免用融合蛋白(50 μg)與等體積的弗氏完全佐劑乳化后，背部多點(diǎn)皮下注射，對照組注射等體積的生理鹽水；10 d后二免使用弗氏不完全佐劑乳化抗原，劑量同一免，對照組注射等量滅菌生理鹽水；7 d后三免，方法與劑量同二免。三免1周后，眼球摘除法收集小鼠血液至滅菌不含抗凝劑的離心管中。4℃靜置過夜，收集血清于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 抗體檢測 用Western blot鑒定抗體特異性，將表達(dá)的融合蛋白用SDS-PAGE后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，用制備的抗血清1∶100稀釋后作為一抗37℃孵育2 h，1∶5 000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG為二抗孵育2 h，充分洗滌后，加入3,3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，并拍照記錄。

2 結(jié)果

2.1 MHCⅠα、β2m基因片段的擴(kuò)增

以構(gòu)建的質(zhì)粒pMD18-T-MHCⅠα、 pMD18-T-MHCⅠβ2m為模板，進(jìn)行擴(kuò)增后電泳檢測。分別獲得了與預(yù)期條帶大小相符的約822 bp和300 bp的DNA片段，而陰性對照未見擴(kuò)增條帶(圖1)。

M. DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1. MHCⅠα的PCR陰性對照; 2. MHCⅠα的PCR產(chǎn)物; 3. MHCⅠβ2m的PCR產(chǎn)物;4 MHCⅠβ2m的PCR陰性對照

M. DNA Marker DL 2 000;1. Negative control of MHCⅠα; 2. PCR products of MHCⅠα; 3. PCR products of MHCⅠβ2m; 4.Negative control of MHCⅠβ2m

圖1 雞MHCⅠα、β2m的PCR擴(kuò)增

Fig.1 PCR amplification of MHCⅠα and β2m gene

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

以篩選的陽性重組質(zhì)粒pET-MHCⅠα和pET-MHCⅠβ2m為模板，采用各自引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，初步鑒定重組質(zhì)粒。陽性重組質(zhì)粒分別用內(nèi)切酶EcoRⅠ、SalⅠ和EcoRⅠ、EcoR V雙酶切，電泳結(jié)果可見相應(yīng)目的條帶(圖2)。重組質(zhì)粒經(jīng)生物公司測序后，使用生物軟件進(jìn)行比較，結(jié)果與目的序列完全一致，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 融合蛋白的表達(dá)

將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒pET-MHCⅠα、pET-MHCⅠβ2m和pET-32a空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌Rosetta。用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，然后進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果顯示經(jīng)誘導(dǎo)的pET-MHCⅠα、pET-MHCⅠβ2m和空載體菌分別在約52.1、33.0、22.0 ku處有一特異性條帶，與預(yù)期的載體標(biāo)簽His蛋白及其融合蛋白大小一致(圖3)。超聲波裂解誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液，離心分離上清液及沉淀，可見融合蛋白His- MHCⅠα主要存在于沉淀中，而His- MHCⅠβ2m蛋白則在上清和沉淀中均大量存在(圖4)。進(jìn)一步檢測純化后融合蛋白His- MHCⅠα和His- MHCⅠβ2m的濃度，分別為1.02 mg/mL和0.98 mg/mL。

M. DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1. MHCⅠα的PCR產(chǎn)物; 2. 重組質(zhì)粒pET-MHCⅠα/EcoRⅠ+SalⅠ; 3. MHCⅠβ2m的PCR產(chǎn)物; 4. 重組質(zhì)粒pET-MHCⅠβ2m /EcoR V+EcoRⅠ

M. DNA Marker DL 2 000;1. PCR products of MHCⅠα; 2. Recombinant plasmid pET-MHCⅠα digested byEcoRⅠandSalⅠ; 3. PCR products of MHCⅠβ2m; 4. Recombinant plasmid pET-MHCⅠβ2m digested byEcoR V andEcoRⅠ

圖2 重組質(zhì)粒的鑒定

Fig.2 Identification of the recombinant plasmids

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1.未誘導(dǎo)His/Rosetta; 2.誘導(dǎo)His/ Rosetta; 3. 未誘導(dǎo)His-MHCⅠα/Rosetta; 4. 誘導(dǎo)His -MHCⅠα/Rosetta; 5. 未誘導(dǎo)His-MHCⅠβ2m/Rosetta; 6. 誘導(dǎo)His-MHCⅠβ2m/Rosetta

M.Protein molecular weight Marker; 1. Uninduced His/Rosetta; 2. His/ Rosetta induced by IPTG;3.Uninduced His-MHCⅠα/Rosetta; 4. His -MHCⅠα/Rosetta induced by IPTG; 5.Uninduced His-MHCⅠβ2m/Rosetta; 6. His-MHCⅠβ2m/Rosetta induced by IPTG

圖3 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE

Fig.3 SDS-PAGE map of expression products

2.4 Western blot 結(jié)果分析

利用免疫印跡技術(shù)分析確定融合蛋白的活性，分別以純化的融合蛋白His- MHCⅠα、His- MHCⅠβ2m，及其免疫小鼠的抗血清作為反應(yīng)一抗，進(jìn)行Western blot檢測。為了排除His蛋白標(biāo)簽對反應(yīng)結(jié)果的影響，使用His標(biāo)簽蛋白為反應(yīng)抗原設(shè)對照組，一抗為上述獲得的2種抗血清。結(jié)果可見2個(gè)MHCⅠ融合蛋白在相應(yīng)位置均有特異性反應(yīng)帶，而His標(biāo)簽蛋白則無(圖5)；表明融合蛋白與相應(yīng)的多克隆抗體發(fā)生了特異性結(jié)合，具有免疫活性。

1.誘導(dǎo)的His-MHCⅠα/Rosetta; 2. 裂解液上清/His- MHCⅠα; 3. 裂解液沉淀/His- MHCⅠα; 4. 純化的His-MHCⅠα融合蛋白; 5.誘導(dǎo)的His-MHCⅠβ/Rosetta; 6. 裂解液上清/His- MHCⅠβ;7. 裂解液沉淀/His- MHCⅠβ; 8. 純化的His-MHCⅠβ融合蛋白

1.Induced His-MHCⅠα/Rosetta; 2. Lysate supernatant of Rosetta/His-MHCⅠα; 3. Lysate precipitate of Rosetta/His-MHCⅠα; 4. Purified protein of His-MHCⅠα; 5.Induced Rosetta/His- MHCⅠβ; 6. Lysate supernatant of Rosetta/His-MHCⅠβ; 7. Lysate precipitate of Rosetta/His- MHC I β; 8. Purified protein of His- MHCⅠβ

圖4 融合蛋白的可溶性鑒定與純化

Fig.4 Solubility identification and purification of fusion proteins

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1.His-MHCⅠα融合蛋白; 2.His-MHCⅠβ2m 融合蛋白; 3.陰性對照(MHCⅠα抗血清); 4.陰性對照(MHCⅠβ2m抗血清)

M. Protein molecular weight Marker; 1. Fusion protein of His-MHC Iα; 2. Fusion protein of His-MHC I β2m; 3. Negative control(MHCⅠα antiserum); 4. Negative control(MHCⅠβ2m antiserum)

圖5 His-MHCⅠα和His-MHCⅠβ2m蛋白Western blot鑒定

Fig.5 Identification of His-MHC I α and His-MHCⅠβ2m proteins by Western blot

3 討論

研究表明，大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)具有菌體生長快、易操作和成本低等優(yōu)點(diǎn)，在體外重組蛋白制備中被廣泛應(yīng)用[12]。大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)雖優(yōu)點(diǎn)頗多，但目的蛋白容易形成包涵體。包涵體主要含有重組蛋白和一些菌體雜質(zhì)等，是不可溶的，內(nèi)部的蛋白多是雜亂無章地錯(cuò)誤折疊，因此對重組蛋白的活性影響較大。為獲得穩(wěn)定且可溶的重組蛋白，我們通過對雞MHCⅠα、β2m鏈基因序列的信號肽、抗原性、親疏水性及表面暴露性等進(jìn)行分析，去除基因信號肽及疏水區(qū)域等，其中MHCⅠα基因片段僅包含3個(gè)功能區(qū)域α1、α2和α3，盡可能的避免其對后續(xù)蛋白表達(dá)的影響。同時(shí)嘗試調(diào)低誘導(dǎo)溫度，降低誘導(dǎo)劑的量，以及減短誘導(dǎo)時(shí)間等方法，降低菌體產(chǎn)生包涵體。但結(jié)果發(fā)現(xiàn)表達(dá)的His-MHCⅠα融合蛋白仍然主要以包涵體形式存在，His-MHCⅠβ2m融合蛋白則以包涵體和上清兩種形式出現(xiàn)。融合蛋白難以避免以包涵體的形式大量存在，這與其他學(xué)者的研究相似，分析其原因可能與蛋白表達(dá)量較大，且速度太快等因素有關(guān)[13-14]。

MHC分子是抗原呈遞的關(guān)鍵分子，因其具有重要免疫功能，而備受關(guān)注。但由于自然選擇平衡的因素，MHC分子具有高度的多態(tài)性，迄今為止人類MHC分子的等位基因總數(shù)已經(jīng)達(dá)到上千個(gè)[15]。因此，MHC分子的多樣和復(fù)雜性導(dǎo)致其相關(guān)的研究較為困難。禽類系統(tǒng)被認(rèn)為是研究MHC分子遺傳進(jìn)化的潛力候選載體，而雞MHC基因則是與適應(yīng)性免疫密切相關(guān)的典型基因家族[16-17]。與哺乳動物相比，雞MHC分子結(jié)構(gòu)簡單、分子小且緊密，具有最低限度的功能基本單元[18]，因此吸引了眾多對MHC分子感興趣的學(xué)者。研究前期我們獲得了大量地方品種雞的MHCⅠα和β2m基因，并進(jìn)行了序列比對分析，證實(shí)α鏈基因較為多態(tài)，而β2m 鏈則相對較為保守[5，11]。本研究通過構(gòu)建雞MHCⅠα和β2m基因原核表達(dá)載體，成功獲得了其活性蛋白，并通過免疫小鼠得到了具有特異性的多克隆抗體，為進(jìn)一步研究MHCⅠα和β2m分子結(jié)構(gòu)特征，以及MHCⅠ類分子靶向性疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

[1] Boehm T, Zufall F. MHC peptides and the sensory evaluation of genotype[J]. Acta Paediatrica, 2006, 29(2):100-107.

[2] Hughes A L, Yeager M. Natural selection at major histocompatibility complex loci of vertebrates [J]. Annu Rev Genet, 1998, 32:415-435.

[3] Otting N, de Vos-Rouweler A J, Heijmans C M, et al. MHC class I A region diversity and polymorphism in macaque species [J]. Immunogenetics, 2007, 59:367-375.

[4] 戴 銀，王承志，沈?qū)W懷,等.淮南麻黃雞MHCⅠα鏈基因的克隆及序列分析[J]. 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2015，36(2):34-38.

[5] Zhou H, Lamont S J. Chicken MHC class I and II gene effects on antibody response kinetics in adult chickens[J]. Immunogenetics, 2003, 55(3):133-140.

[6] Cloutier A, Mills J A, Baker A J. Characterization and locus-specific typing of MHC class I genes in the red-billed gull (Larusscopulinus) provides evidence for major, minor, and nonclassical loci vertebrate populations [J]. Immunogenetics, 2011, 63:377-394.

[7] Mc Cairns R J, Bourget S, Bernatchez L. Putative causes and consequences of MHC variation within and between locally adapted stickleback demes [J]. Mol Ecol, 2011, 20(3):486-502.

[8] Shaw I, Powell T J, Marston D A, et al. Different evolutionary histories of the two classical class I genes BF1 and BF2 illustrate drift and selection within the stable MHC haplotypes of chickens[J]. J Immunol, 2007, 178:5744-5752.

[9] Livant E J, Brigati R, Ewald S J. Diversity and locus specificity of chicken MHC B class I sequences[J]. Anim Genet, 2004, 35:18-27.

[10] 戴 銀，張丹俊，胡曉苗，等.雞主要組織相容性復(fù)合體Ⅰβ微球蛋白(β2m)基因的克隆及序列分析[J].中國畜牧獸醫(yī), 2014, 41 (10):28-32.

[11] Kaufman J, Andersen R, Avila D, et al. Different features of the MHC class I heterodimer have evolved at different rates. Chicken B-F and beta 2-microglobulin sequences reveal invariant surface residues [J]. J Immunol, 1992, 148:1532-1546.

[12] 陳 濤．豬Ⅰ型干擾素基因的克隆及其在大腸埃希菌中的表達(dá)[D].江蘇南京：南京師范大學(xué)，2002．

[13] Selleck W，Tan S. Recombinant protein complex expression inE.coli[J].Curr Protoc Protein Sci, 2008, 21(5):324-321.

[14] 張舒婕,龔炎長,俸艷萍,等.鴨MHCⅡβ基因的克隆、表達(dá)及多克隆抗體的制備[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008,39(11):1612-1615.

[15] 裴梓峰, 李 巖, 馬 威，等. HLA基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性研究進(jìn)展[J]. 大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009, 3(6):259-363.

[16] Westerdahl H. Passerine MHC: genetic variation and disease resistance in the wild [J]. J Ornithol, 2007, 148: S469-S477.

[17] Kaufman J. The simple chicken major histocompatibility complex: life and death in the face of pathogens and vaccines [J]. Phil Trans R Soc Lond B, 2000, 355: 1077-1084.

[18] Eimes J A, Bollmer J L, Dunn P O, et al. Mhc class II diversity and balancing selection in greater prairie-chickens [J]. Genetica, 2010, 138: 265-271.

Prokaryotic Expression and Polyclonal Antibody Preparation of Chicken MHC Ⅰα and β2m Genes

DAI Yin1, WANG Cheng-zhi2, LIU Sheng-jie3, SHEN Xue-huai1,ZHAO Rui-hong1, HU Xiao-miao1, ZHANG Dan-jun1

(1.InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryScience,AnhuiAcademyofAgriculturalScience,Hefei,Anhui,230031,China; 2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei,Anhui, 230036,China; 3.SchoolofBiologyandFoodEngineering,FuyangNormalCollege,Fuyang,Anhui,236041,China)

To explore MHCⅠfunction as DNA vaccine，chicken MHCⅠgenes were expressed by usingEscherichiacoliprokaryotic expression system，and polyclonal antibodies against the recombinant protein MHCⅠwere prepared. Chicken MHCⅠα and β2m genes were cloned，the recombinant plasmid pET-MHCⅠα, pET-MHCⅠβ2m were constructed，and confirmed by PCR amplification，double enzyme digestion and DNA sequencing．Next, the recombinant plasmids were expressed inE.coliRosetta induced by using IPTG．After purification of the recombinant protein，the polyclonal antibodies against the recombinant protein were prepared in Kunming mice. The reactivity of the prepared polyclonal antibodies were determined by Western blot. The results revealed that the MHCⅠα and β2m genes were successfully expressed inE.coli，and the fusion proteins were about 52.1 ku and 33.0 ku, respectively. The polyclonal antibodies had the specific reactinogenicity, it was proved by Western blot. All this made it possible to do further studies on chicken MHCⅠmolecule.

chicken MHC I molecule; prokaryotic expression; polyclonal antibody

2015-10-07

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31302044)；安徽省科技攻關(guān)項(xiàng)目(11010302119)；安徽省教育廳自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2013A203)

戴 銀(1980-)，女，安徽蒙城人，助理研究員，博士，主要從事獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)研究。 *通訊作者

S852.4；S858.31

A

1007-5038(2016)05-0038-05