狂犬病病毒磷蛋白在桿狀病毒中的表達及鑒定

鄭光來，盧曉冉，張永武，張靜遠，陳 騰，王東方，嚴 妍,3，張守鋒，扈榮良*

(軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所，吉林省人獸共患病預防與控制重點實驗室，吉林長春 130122)

狂犬病病毒磷蛋白在桿狀病毒中的表達及鑒定

鄭光來1，盧曉冉2，張永武2，張靜遠2，陳 騰2，王東方2，嚴 妍2,3，張守鋒2，扈榮良1*

(軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所，吉林省人獸共患病預防與控制重點實驗室，吉林長春 130122)

采用RT-PCR方法擴增出狂犬病病毒BD06株的磷蛋白(P)基因片段，將其插入桿狀病毒穿梭載體pFastBac 1獲得的pFastBac 1-P重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E.coliDH10Bac成功構(gòu)建出桿狀病毒表達質(zhì)粒Bacmid-P，用脂質(zhì)體介導Bacmid-P轉(zhuǎn)染Sf9細胞獲得重組桿狀病毒(AcMNPV-P)。經(jīng)SDS-PAGE、Western blot和直接免疫熒光分析鑒定，BD06-P蛋白在桿狀病毒中成功表達，且具有良好的反應原性，為進一步研究狂犬病病毒磷蛋白的結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎。

狂犬病病毒；桿狀病毒表達系統(tǒng)；磷蛋白

狂犬病(Rabies)是一種古老而又持續(xù)流行的人獸共患傳染病。由于狂犬病病毒(Rabies virus，RV)在感染人或動物腦組織以后才會表現(xiàn)出臨床癥狀，因此一旦發(fā)病，病死率幾乎為100%，全世界每年因為狂犬病感染而死亡的人數(shù)約有50 000人～70 000人，給人類的生命帶來了巨大的安全隱患[1]。

狂犬病病毒屬于彈狀病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病病毒屬(Lyssavirus)的成員，其基因組由11 928(有些毒株為11 932)個核苷酸組成，為單股不分節(jié)段的負鏈RNA病毒。自基因組的3′端至5′端依次編碼著N(核蛋白)、P(磷蛋白)、M(基質(zhì)蛋白)、G(糖蛋白)、L(大轉(zhuǎn)錄酶蛋白)5種蛋白。磷蛋白是狂犬病病毒所有結(jié)構(gòu)蛋白中變異最大的一種蛋白，同時也是功能最為復雜的一種蛋白。磷蛋白可以通過和N、L兩個蛋白共同作用，促進病毒RNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯[2-3]；同時磷蛋白還具有阻止干擾素調(diào)控因子3(interferon regulatory factor 3，IRF3)激活，從而阻止干擾素的表達等功能[4]。

磷蛋白具有功能多樣性，目前雖然磷蛋白的研究相對廣泛，但仍不完善。本試驗通過pFast-Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)成功克隆表達了狂犬病病毒BD06株的磷蛋白，為深入研究RABV的感染機制、P蛋白結(jié)構(gòu)和功能以及狂犬病ELISA診斷試劑盒的研發(fā)奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

RV BD06毒株、E.coliDH10BacTM感受態(tài)、昆蟲細胞Sf9、桿狀病毒表達載體pFastBacTM1、磷蛋白單抗1C9、FITC標記的磷蛋白單抗1C9均由吉林省人獸共患病預防與控制重點實驗室保存；E.coliDH5α感受態(tài)、ExTaq酶、DNA和蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶為NEB公司產(chǎn)品；總RNA提取試劑盒為BioFlux公司產(chǎn)品；小量質(zhì)粒提取試劑盒和小量DNA凝膠回收試劑盒均為AxyGen公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計 根據(jù)GenBank：EU549783.1中RV BD06毒株的磷蛋白基因序列設計PCR引物，并在上、下游引物中引入BamH I和KpnI兩個酶切位點，上、下游引物分別為BD06-P-F：5′-CGCGGATCCATGAGCAAGATCTTCGT-3′(BamH I)和BD06-P-R：5′-CGGGGTACCTCAGCAGGATGTATA-3′(Kpn I)。磷蛋白基因片段長度為894 bp。

1.2.2 重組桿狀病毒表達質(zhì)粒的構(gòu)建 取RV BD06的細胞毒100 μL用總RNA提取試劑盒提取病毒RNA，然后用磷蛋白上游引物反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再用磷蛋白的特異性引物進行PCR擴增，擴增條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。然后將PCR產(chǎn)物和桿狀病毒表達載體pFastBacTM1分別用BamH I和KpnI雙酶切、回收，T4連接酶16 ℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)以獲得重組桿狀病毒表達載體pFastBacTM1-P，隨后用雙酶切鑒定，并送至吉林省庫美生物技術(shù)有限公司測序。

將經(jīng)鑒定正確的重組桿狀病毒表達載體轉(zhuǎn)化入E.coliDH10BacTM感受態(tài)中進行藍白斑篩選，挑選較大的白斑并純化一次。然后挑取大個的白斑用Bacmid質(zhì)粒上的通用引物M13F/M13R進行PCR鑒定。最終得到含有BD06-P基因的重組桿狀病毒表達質(zhì)粒Bacmid-P。

1.2.3 重組桿狀病毒(AcMNPV-P)的獲得與擴增 用CellfectinⅡReagent脂質(zhì)體介導Bacmid-P轉(zhuǎn)染六孔板里匯合度達到80%左右的Sf9細胞，并設立空白對照。待細胞出現(xiàn)病變(約96 h)后收集細胞上清即為P1代AcMNPV-P。經(jīng)2次傳代后，獲得大量的P3代AcMNPV-P，用于后期蛋白表達及鑒定，并用Reed-Muench法計算第3代AcMNPV-P病毒滴度。

1.2.4 重組磷蛋白的鑒定

1.2.4.1 直接免疫熒光試驗(DIFA) 用第3代AcMNPV-P感染六孔板里的正常Sf9細胞，設立未接毒的空白對照。28 ℃培養(yǎng)72 h后棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，800 mL/L的丙酮于4 ℃固定20 min，然后棄去丙酮，風干，加入FITC標記的小鼠抗磷蛋白單抗1C9(1∶800)，37 ℃孵育1 h，用PBST洗滌3次，5 min/次。滴加2滴800 mL/L的甘油，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4.2 SDS-PAGE和Western blot檢測 收集感染AcMNPV-P的Sf9細胞，用PBS洗滌2遍，然后加入適量的PBS。反復凍融3次后離心取上清，加入5×的SDS-Loading buffer，煮沸10 min。處理好的樣品跑兩份SDS-PAGE膠，一份用于考馬斯亮藍染色，另一份用半干式轉(zhuǎn)膜法電轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。轉(zhuǎn)印好的PVDF膜用10 g/L的酪蛋白室溫振蕩封閉2 h，PBST洗滌3次，10 min/次；用小鼠抗磷蛋白的單抗1C9(1∶200)室溫孵育1 h，PBST洗滌3次，10 min/次；用HRP標記的山羊抗小鼠IgG二抗室溫孵育1 h，PBST洗滌3次，10 min/次；TMB顯色10 min。1.2.5 重組Ac-MNPV-P的電鏡觀察 用重組Ac-MNPV-P感染Sf9細胞，待細胞完全病變后(約96 h)收集細胞懸液于離心管中，室溫下1 000 r/min，離心5 min，取上清進行電鏡觀察。

不斷推進人員本土化進程。保加利亞公司高度重視生產(chǎn)與管理的本土化，聘請保籍農(nóng)業(yè)專家擔任執(zhí)行經(jīng)理，聘請培育、種植、加工、病蟲害防治的農(nóng)藝專家和技術(shù)骨干，組成以農(nóng)業(yè)院校、種植專家、科技機構(gòu)相結(jié)合的中保方人員參與的技術(shù)管理團隊，目前絕大多數(shù)的中層崗位由保加利亞人員擔任。同時不斷加強中方管理人員與基地保方負責人、農(nóng)業(yè)技術(shù)人員的溝通、交流，將中國先進的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)技術(shù)與保加利亞豐富的自然資源相結(jié)合，實現(xiàn)了資源、技術(shù)等多項優(yōu)勢互補，農(nóng)業(yè)種植、田間管理的經(jīng)驗共享與提高。

2 結(jié)果

2.1 磷蛋白基因PCR產(chǎn)物鑒定

從RV BD06株感染的BHK細胞上清液里提取病毒的總RNA，并以此為模板進行RT-PCR，然后用磷蛋白的特異性引物擴增出磷蛋白基因片段(圖1)。

1～2.磷蛋白基因；M.DNA標準DL 1 0001-2.BD06-P gene fragment；M.DNA Marker DL1 000

2.2 重組桿狀病毒表達質(zhì)粒的鑒定

利用通用引物M13F/R對重組桿狀病毒表達質(zhì)粒進行鑒定，若沒有重組成功則只會出現(xiàn)300 bp的條帶，若重組成功則會擴增出3 196 bp(2 300 bp+894 bp)的條帶。試驗成功擴增出了3 200 bp左右的條帶(圖2)，證明重組桿狀病毒表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M.DNA標準 DL 5 000；1～2.重組質(zhì)粒Bacmid-P的PCR產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 5 000；1-2：PCR products of recombinant plasmid Bacmid-P

圖2 重組表達質(zhì)粒Bacmid-P的PCR鑒定

Fig.2 Identification of recombinant plasmid Bacmid-P by PCR

2.3 重組桿狀病毒的獲得

感染AcMNPV-P的Sf9細胞72 h后可以觀察出明顯的細胞病變，與正常細胞相比，病變細胞的直徑變大，細胞內(nèi)部出現(xiàn)許多顆粒物，隨著時間延長，病變細胞慢慢脫落。而正常細胞的直徑則大小均勻，形狀規(guī)則(圖3)。

2.4 重組磷蛋白的直接免疫熒光(DIFA)檢測

用FITC標記的磷蛋白單克隆抗體1C9對重組桿狀病毒表達的磷蛋白進行間接免疫熒光檢測。結(jié)果顯示(圖4)，表達的重組磷蛋白能夠和磷蛋白單抗發(fā)生特異性的反應。證明重組磷蛋白在Sf9細胞中成功表達且具有良好的反應原性。

A.Sf9細胞；B.感染AcMNPV-P 72 h后的Sf9細胞

A.Sf9 cells；B.Sf9 cells infected with AcMNPV-P after 72 h

圖3 正常Sf9細胞和感染AcMNPV-P的Sf9細胞(100×)

Fig.3 Control Sf9 cells and Sf9 cells infected with AcMNPV-P (100×)

A.感染AcMNPV-P 72 h后的Sf9細胞；B.Sf9細胞

A.Sf9 cells infected with AcMNPV-P after 72 h；B.Sf9 cells

圖4 直接免疫熒光鑒定重組磷蛋白的表達(100×)

Fig.4 Detection of recombinant phosphoprotein by DIFA(100×)

2.5 SDS-PAGE和Western blot分析重組磷蛋白

用SDS-PAGE分析Sf9細胞和重組桿狀病毒感染的Sf9細胞的細胞裂解上清，在40 ku左右出現(xiàn)了一個條帶。Western blot顯示在40 ku左右出現(xiàn)了特異性的條帶，與預期蛋白大小一致，而正常Sf9細胞的裂解上清未出現(xiàn)條帶。

M.蛋白分子質(zhì)量標準；1、4.Sf9細胞裂解上清；2、3.感染AcMNPV-P的Sf9細胞裂解上清

M.Protein molecular weight Marker；1,4.The supernatant of lysed Sf9 cells；2,3.The supernatant of lysed Sf9 cells infected with AcMNPV-P

圖5 表達產(chǎn)物的SDS-PAGE和Western blot分析

Fig.5 Analyses of the expressed proteins by SDS-PAGE and Western blot

2.6 重組AcMNPV-P的電鏡觀察

用重組AcMNPV-P感染Sf9細胞，待細胞完全病變后，收集細胞培養(yǎng)上清進行電鏡觀察(圖6)。在病變的細胞上清中觀察到了重組桿狀病毒。

圖6 重組AcMNPV-P的電鏡觀察

3 討論

桿狀病毒表達系統(tǒng)作為四大表達系統(tǒng)之一，與其他表達系統(tǒng)相比，桿狀病毒表達系統(tǒng)具有安全性高，對外源基因克隆容量大，重組病毒易于篩選，具有對重組蛋白進行翻譯后的加工和修飾功能，且重組蛋白易從無血清的培養(yǎng)集中純化，無內(nèi)毒素等優(yōu)點[5]。目前，桿狀病毒表達系統(tǒng)已廣泛應用于重組蛋白的獲取、基因治療、疫苗研制和藥物開發(fā)等多個領域[6]。

目前，不同狂犬病病毒毒株的磷蛋白已在多個表達系統(tǒng)中獲得成功表達。張金陽等[7]利用真核細胞表達系統(tǒng)表達了狂犬病毒Flury-HEP毒株磷蛋白，但真核細胞表達系統(tǒng)表達量有限，且不易實現(xiàn)大規(guī)模培養(yǎng)。靳紅亮等[8]利用人腺病毒5型表達了狂犬病病毒BD06株磷蛋白，但這種腺病毒載體存在一定的安全風險。許運斌等[9]利用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達了狂犬病病毒 ERA 株磷蛋白，而狂犬病病毒ERA株屬于弱毒株。本試驗利用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達了狂犬病病毒 BD06 株的磷蛋白。與狂犬病病毒ERA株不同的是狂犬病病毒BD06株屬于強毒株，因此對其蛋白組分中的磷蛋白進行克隆表達，為探討強毒株磷蛋白的生物功能及研究狂犬病病毒致病機制奠定了基礎。

磷蛋白是一種磷酸化的蛋白，在SDS-PAGE中呈現(xiàn)的約為40 ku的磷酸化形式[10-11]。通過Western blot和直接免疫熒光試驗對重組磷蛋白進行反應原性的研究，發(fā)現(xiàn)重組磷蛋白能夠和狂犬病病毒磷蛋白單克隆抗體1C9產(chǎn)生良好的反應，且相對分子質(zhì)量約為40 ku，與預期相符。證明利用桿狀病毒表達系統(tǒng)成功的表達了具有反應原性的重組RV-BD06-P蛋白，為深入研究狂犬病病毒的感染機制和狂犬病ELISA診斷試劑盒奠定了基礎。

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Expression and Characterization of Rabies Virus Phosphoprotein in Baculovirus

ZHENG Guang-lai1,LU Xiao-ran2,ZHANG Yong-wu2,ZHANG Jing-yuan2,CHEN Teng2,WANG Dong-fang2,YAN Yan2,3,ZHANG Shou-feng2,HU Rong-liang1

(AcademyofMilitaryMedicalSciences,KeyLaboratoryofJinlinProvincialZoonosis,VeterinaryResearchInstitute,Changchun，Jilin,130122,China)

The phosphoprotein gene of rabies virus BD06 stain was amplified by RT-PCR and cloned into the baculovirus shuttle vector pFastBac 1,then the recombinant vector pFastBac 1-P was transformed intoE.coliDH10Bac to obtain the recombinant expression plasmid Bacmid-P. The recombinant baculovirus AcMNPV-P was obtained by transfecting the Bacmid-p into Sf9 cells.The expressed recombinant phosphoprotein was identified by SDS-PAGE,Western blot and direct immunofluoresence assay.The results showed that the BD06-P was expressed in recombinant baculovirus successfully and had a good antigenicity,it would be potentially used for further study on the structures and functions of the phosphoprotein of rabies virus.

Rabies virus;baculovirus expression systerm;phosphoprotein

2015-11-23

國家863計劃項目(2011AA10A212)

鄭光來(1989-)，男，河南許昌人，碩士研究生，主要從事分子病毒學研究。*通訊作者

S852.655

A

1007-5038(2016)05-0026-04