噬菌體Bp7尾絲蛋白gp37的原核表達(dá)與鑒定

孫虎芝，任慧英，張 燦

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島 266109)

噬菌體Bp7尾絲蛋白gp37的原核表達(dá)與鑒定

孫虎芝，任慧英，張 燦*

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島 266109)

為了研究噬菌體尾絲蛋白gp37在識(shí)別宿主菌大腸埃希菌K12過程中的作用，PCR擴(kuò)增獲得gp37基因C端1 161 bp序列，以EGFP為熒光標(biāo)簽，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-EGFP-gp37，在大腸埃希菌BL21(DE3)中IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白EGFP-gp37，親和層析純化蛋白。SDS-PAGE及Western blot檢測(cè)結(jié)果表明,重組蛋白EGFP-gp37在大腸埃希菌BL21(DE3)為可溶性表達(dá)，表達(dá)量占菌體總蛋白量的23%。EGFP-gp37融合蛋白與大腸埃希菌K12相互作用，激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)結(jié)果顯示,尾絲蛋白gp37能夠吸附到宿主菌K12表面，表明尾絲蛋白gp37參與宿主菌受體的識(shí)別和吸附過程。

噬菌體Bp7；尾絲蛋白gp37；綠色熒光蛋白EGFP；大腸埃希菌K12

噬菌體作為一種細(xì)菌病毒，通過侵染細(xì)菌從而使其裂解，是自然界中細(xì)菌的天敵。近年來，隨著抗生素的廣泛使用，細(xì)菌的耐藥情況日益嚴(yán)重，噬菌體作為抗菌制劑用于耐藥菌的防治研究引起高度重視[1]。

T4類噬菌體為有尾噬菌體，在形態(tài)上相似，頭部為20面體，尾部可以伸縮，由基板和長短兩組尾絲構(gòu)成[2]。長尾絲通過其末端的尾絲蛋白識(shí)別宿主表面的特異性受體并與之可逆性結(jié)合，從而啟動(dòng)噬菌體侵染宿主菌的過程，這種識(shí)別受體的特異性決定了噬菌體的宿主范圍[3-4]。gp37位于T4類噬菌體長尾絲末端，其C端能夠識(shí)別宿主菌表面受體，引發(fā)噬菌體的吸附過程，是T4類噬菌體識(shí)別受體的關(guān)鍵蛋白[5-6]。在前期研究工作中，從雞場(chǎng)糞便中分離到一株噬菌體Bp7，具有寬宿主譜的特性，基因組序列分析顯示其屬于T4類噬菌體[7]。噬菌體Bp7基因組的功能基因預(yù)測(cè)表明，開放閱讀框ORF37編碼尾絲蛋白gp37，與T4類噬菌體的尾絲蛋白gp37具有同源性，因此推測(cè)其在噬菌體Bp7識(shí)別宿主菌受體過程中具有關(guān)鍵作用。

為了驗(yàn)證上述假說，本試驗(yàn)著眼于噬菌體Bp7尾絲蛋白gp37 的C端序列，以綠色熒光蛋白為標(biāo)簽，檢測(cè)其與宿主菌大腸埃希菌K12的結(jié)合情況，從而確定噬菌體Bp7尾絲蛋白gp37是否參與識(shí)別宿主菌的受體，為進(jìn)一步研究噬菌體Bp7與宿主菌的相互作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株 質(zhì)粒pET-28a、質(zhì)粒pEGFP-N1、質(zhì)粒pGEX-6P-1-gp37、大腸埃希菌BL21(DE3)菌株、大腸埃希菌DH5α菌株,均由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保存的；大腸埃希菌K12,購自河南省微生物菌種資源庫菌種保藏中心。

1.1.2 試劑 營養(yǎng)瓊脂,購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒、質(zhì)粒小量快速提取試劑盒,購自北京艾德萊生物科技有限公司；T4 DNA連接酶、DNA Marker DL 2 000、限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ、SalⅠ、XholⅠ，二抗為HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG,均購自寶生物工程(大連)有限公司;一抗為鼠抗HIS標(biāo)簽單克隆抗體,Top Sciense公司產(chǎn)品;DAB試劑盒,購自Biosharp公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因EGFP及gp37的引物設(shè)計(jì) 參照GenBank已登錄的EGFP序列(GI: CVU55762)和噬菌體Bp7的基因組序列(GI: HQ829472)，以EGFP基因和尾絲蛋白gp37 C端1 161 bp為目的基因，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，并分別在EGFP基因上下游引物P1、P2引入EcoRⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)(下劃線表示)，在gp37基因上、下游引物P3、P4引入SalⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)(下劃線表示)；在EGFP基因下游引物中引入一個(gè)linker(斜體表示)，引物序列如下：P1： 5′-GGC GAA TTC ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG-3′；P2： 5′-CCC GTC GACTCGGCTCCAGGAACGCCATCGGCTCCAGGAACGCCATCGGCTCCAGGAACGCCATTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC-3′；P3： 5′-CAG GTC GAC GCT ACT CGT GTT TCT A-3′ ；P4： 5′-TTG CTC GAG CCC GAA GGC CCT TTC TTAT-3′ 。

1.2.2 目的基因EGFP及gp37的PCR擴(kuò)增及鑒定 分別以質(zhì)粒pEGFP-N1和質(zhì)粒pGEX-6P-1-gp37為模板，擴(kuò)增目的基因片段EGFP和gp37，PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，57 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

1.2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-EGFP-gp37的構(gòu)建 分別將載體pET-28a和目的基因EGFP用EcoRⅠ與SalⅠ雙酶切，產(chǎn)物回收后用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DH5α后挑菌提取質(zhì)粒，將所得的質(zhì)粒分別進(jìn)行PCR與雙酶切鑒定,選出陽性克隆，命名為pET-28a-EGFP。送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，以確保插入基因的準(zhǔn)確。將目的基因片段gp37與測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET-28a-EGFP用SalⅠ與XhoⅠ雙酶切，雙酶切產(chǎn)物回收后連接，轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DH5α后挑菌提取質(zhì)粒，將所得的質(zhì)粒分別進(jìn)行PCR與雙酶切鑒定,選出陽性克隆，命名為pET-28a-EGFP-gp37。送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，以確保插入基因的準(zhǔn)確。

1.2.4 重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-EGFP-gp37/BL21(DE3)的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)與可溶性分析 將重組質(zhì)粒pET-28a-EGFP-gp37轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸埃希菌BL21(DE3)，隨機(jī)挑取含Kana的LB平板上長出的單菌落，接種含Kana的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，取70 μL接種7 mL含Kana的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD 600 nm約為0.6～0.8，加入終濃度為0.6 mmol/L IPTG，37℃振蕩培養(yǎng)6 h，離心，分別收集培養(yǎng)上清液和菌體沉淀，菌體以PBS重懸后在冰浴條件下進(jìn)行超聲波裂解，裂解條件為：冰浴間歇超聲30 min，超聲2 s，間歇2 s。超聲后的菌液12 000 r/min 、4℃離心5 min，分別收集上清和沉淀，SDS-PAGE電泳檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)。

1.2.5 表達(dá)產(chǎn)物的純化以及Western blot 檢測(cè) 收集超聲破碎后的菌液上清，用Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒進(jìn)行純化，純化的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE后，將凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上進(jìn)行免疫印跡，一抗為鼠抗HIS標(biāo)簽的單克隆抗體，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，用底物二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。

1.2.6 融合蛋白EGFP-gp37與宿主菌相互作用 保存的宿主菌大腸埃希菌K12菌種進(jìn)行普通營養(yǎng)瓊脂平板復(fù)蘇，37℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落，37℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，分別取500 μL加入到2個(gè)EP管中8 000 r/min離心3 min，用200 μL的PBS液重懸，其中一管加入200 μL純化的融合蛋白EGFP-gp37(0.2 mg/mL)，另一管加入等量的EGFP蛋白作對(duì)照，37℃作用10 min，2 000r /min離心10 min，加入1 mL的PBS液洗滌2次，激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)兩者相互作用情況。

2 結(jié)果

2.1 目的基因EGFP及gp37基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

分別以質(zhì)粒pEGFP-N1和pGEX-6P-1-gp37為模板，擴(kuò)增EGFP和gp37基因序列，10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1)。

M. DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～3.擴(kuò)增的gp37基因；4～6.擴(kuò)增的EGFP基因

M. DNA Marker DL 2 000;1-3.PCR products of gp37 gene;4-6.PCR products of EGFP gene

圖1 EGFP基因與gp37基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig.1 PCR amplification results of EGFP and gp37 gene

由圖1可知，PCR擴(kuò)增后分別出現(xiàn)特異的條帶，大小約1 161 bp和774 bp，與預(yù)期的條帶大小一致。

2.2 重組質(zhì)粒pET-28a-EGFP-gp37的PCR鑒定與雙酶切鑒定結(jié)果

用EcoRⅠ與SalⅠ雙酶切EGFP和載體，構(gòu)建pET-28a-EGFP質(zhì)粒；用SalⅠ與XhoⅠ雙酶切g(shù)p37和載體pET-28a-EGFP，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-EGFP-gp37。將構(gòu)建的質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定與雙酶切鑒定，10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果(圖2)。對(duì)篩選出的陽性克隆送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明目的基因序列正確。

由圖2可見，對(duì)于構(gòu)建的質(zhì)粒pET-28a-EGFP，PCR擴(kuò)增出774 bp的條帶與目的基因EGFP一致，經(jīng)過雙酶切得到2個(gè)條帶，其中包括與預(yù)期774 bp大小一致的條帶。對(duì)于構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-28a-EGFP-gp37，PCR擴(kuò)增出1 161 bp的條帶與目的基因gp37一致，經(jīng)過雙酶切得到2個(gè)條帶，其中包括與預(yù)期1 161 bp大小一致的條帶。測(cè)序結(jié)果表明，獲得了正確的重組質(zhì)粒pET-28a-EGFP-gp37。

2.3 融合蛋白EGFP-gp37的誘導(dǎo)表達(dá)與可溶性分析

重組菌pET-28a-EGFP-gp37/BL21(DE3)通過IPTG的誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果見圖3。通過SDS-PAGE可以發(fā)現(xiàn)，融合蛋白在上清中可溶性表達(dá)，表達(dá)量約占菌體總蛋白量的23%。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.pET-28a-EGFP；2.pET-28a-EGFP雙酶切鑒定；3.pET-28a-EGFP-gp37；4.pET-28a-EGFP-37雙酶切鑒定

M.DNA Marker DL 2 000;1.pET-28a-EGFP;2.Double enzymes digestion of pET-28a-EGFP;3.pET-28a-EGFP-gp37;4.Double enzymes digestion of pET-28a-EGFP-gp37

圖2 pET-28a-EGFP-gp37的PCR與雙酶切鑒定

Fig.2 PCR and double enzymes digestion identification of EGFP pET-28a-EGFP-gp37

2.4 融合蛋白的純化以及Western blot檢測(cè)

原核表達(dá)的EGFP-gp37融合蛋白利用親和層析純化，洗脫時(shí)每管收集1 mL，純化后進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)純化第2管含量最高(圖3)，進(jìn)行Western blot檢測(cè)時(shí)，出現(xiàn)一條分子質(zhì)量71 ku特異性的結(jié)合帶(圖3)，根據(jù)分子質(zhì)量大小推測(cè)，這條

帶分子質(zhì)量與目的蛋白的分子質(zhì)量相同，從而證明表達(dá)的蛋白是EGFP-gp37融合蛋白。

2.5 融合蛋白EGFP-gp37與宿主菌相互作用

融合蛋白EGFP與宿主菌大腸埃希菌K12相互作用，利用激光共聚焦顯微鏡觀察二者相互作用(圖4)。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.空質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá);2.重組質(zhì)粒pET-28a-EGFP-gp37的誘導(dǎo)表達(dá);3.菌體裂解上清;4.菌體裂解沉淀;5～7.不同管洗脫的融合蛋白;8.Western blot

M.Protein molecular weight Marker;1.Expression induced by backbone plasmid;2.Expression of recombinant plasmid pET-28a-EGFP-gp37;3.The supernatant of lysates; 4.The deposition of lysates;5-7.Fusion proteins of different tubes;8.Western blot

圖3 融合蛋白EGFP-gp37 SDS-PAGE及Western blot分析

Fig.3 SDS-PAGE and Western blot analysis of recombinant protein EGFP-gp37

A.熒光條件下拍攝;B.白光條件下拍攝;C.A與B的疊加;D.對(duì)照組

A.Shooting under the condition of fluorescence;B.Shooting under white light;C.Overlapping of A and B;D.Control group

圖4 激光共聚焦檢測(cè)

Fig.4 Results of laser confocal detection

由圖4可知，試驗(yàn)組中有菌體存在的地方就有綠色熒光，而對(duì)照組中沒有，這說明蛋白EGFP-37能夠結(jié)合到宿主菌K12上，而EGFP蛋白不能與宿主菌K12結(jié)合，表明尾絲蛋白gp37參與噬菌體Bp7吸附大腸埃希菌K12的過程，能夠吸附到宿主菌表面。

3 討論

近年來，隨著抗生素的使用以及耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)，噬菌體治療也越來越受到人們的關(guān)注。本試驗(yàn)中的噬菌體Bp7來自雞場(chǎng)糞便，并且完成了全基因組測(cè)序，基因組分析顯示，噬菌體Bp7與T4類噬菌體同源性極高，生物學(xué)特征分析顯示，其對(duì)雞致病性大腸埃希菌的裂解率達(dá)45%，具有較寬的裂解譜[8]。在T4類噬菌體中，尾絲蛋白gp37參與宿主菌表面受體的識(shí)別[9]，因此，本試驗(yàn)對(duì)噬菌體Bp7尾絲蛋白gp37進(jìn)行研究，確定其在噬菌體Bp7識(shí)別宿主菌表面受體過程中的作用。

蛋白之間的相互作用可以通過多種方法進(jìn)行檢測(cè)，其中最常用的就是CoIP和Pull-down方法，但是需要SDS-PAGE以及轉(zhuǎn)膜的操作過程，費(fèi)時(shí)繁瑣[10]。EGFP作為一種報(bào)告分子，可以用于檢測(cè)蛋白表達(dá)、蛋白和細(xì)胞熒光示蹤、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及功能的研究[11]。庾慶華等報(bào)道了利用EGFP研究禽腸炎沙門菌在雞腸道定植分布規(guī)律和芽胞桿菌在仔豬和雛雞體內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布[12]。Warren R M等[13]報(bào)道了利用綠色熒光蛋白標(biāo)記噬菌體對(duì)細(xì)菌病原體進(jìn)行檢測(cè)。Bae H W等[14]報(bào)道了利用綠色熒光蛋白標(biāo)記噬菌體蛋白，發(fā)現(xiàn)了抑制Ⅳ型菌毛裝配所需的細(xì)菌ATP酶。本試驗(yàn)通過綠色熒光蛋白與尾絲蛋白gp37的融合表達(dá)，使尾絲蛋白帶有綠色熒光標(biāo)簽，通過激光共聚焦顯微鏡直接觀察尾絲蛋白gp37與大腸埃希菌K12的相互作用情況。自然光條件下菌體是無色的，熒光條件下檢測(cè)到菌體帶綠色熒光，試驗(yàn)結(jié)果顯示，尾絲蛋白gp37能夠結(jié)合到宿主菌K12表面。利用綠色熒光可追蹤的特點(diǎn)來觀察尾絲蛋白gp37與宿主菌K12的吸附過程，減少了SDS-PAGE凝膠電泳以及Western blot轉(zhuǎn)膜等復(fù)雜的過程，不僅節(jié)約了時(shí)間，而且試驗(yàn)結(jié)果更加清晰明了。

本試驗(yàn)構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28a-EGFP-gp37，實(shí)現(xiàn)了綠色熒光蛋白EGFP與尾絲蛋白gp37重組蛋白的融合表達(dá)，獲得71 ku的可溶性蛋白EGFP-gp37。融合蛋白EGFP-gp37能夠結(jié)合到宿主菌表面，表明尾絲蛋白gp37參與宿主菌受體的識(shí)別。在T4類噬菌體中尾絲蛋白gp37是噬菌體與宿主菌的相互作用過程中的關(guān)鍵蛋白，本研究結(jié)果將為進(jìn)一步研究噬菌體Bp7與宿主菌的相互作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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Prodaryotic Expression and Activity Determination of Tail Fiber Protein gp37 of Phage Bp7

SUN Hu-zhi,REN Hui-ying,ZHANG Can

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,QingdaoAgriculturalUniversity,Qingdao,Shandong,266109,China)

In order to identify the tail fiber protein gp37 function in phage Bp7 adsorbing onE.coliK12,1 161 bp C terminal sequence of gp37 as amplified by PCR,and recombinant plasmid pET-28a-EGFP-gp37 was constructed with a fluorescent tag of EGFP.InE.coliBL21(DE3),the fusion protein EGFP-gp37 was induced by IPTG to express and purified by affinity chromatography.SDS-PAGE and Western blot analysis showed that protein EGFP-gp37 was expressed in supernatant ofE.coliBL21(DE3).The expression level reached 23%.The purfied protein of EGFP-gp37 was incubated withE.coliK12 and detected by laser confocal microscopy.The result showed that protein EGFP-gp37 adsorbed on the surface ofE.coliK12,which indicated that tail fiber protein gp37 participated in the receptor recognition of phage Bp7.

phage Bp7;tail fiber protein gp37;green fluorescent protein EGFP;E.coliK12

2015-10-22

青島農(nóng)業(yè)大學(xué)創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(QYC201406)；山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZR2013CQ024；ZR2015CM020)

孫虎芝(1991-)，男，山東乳山人，碩士研究生，主要從事獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)研究。*通訊作者

S852.65;Q789

A

1007-5038(2016)05-0010-05