3個(gè)道地產(chǎn)區(qū)丹參混合提取物對(duì)大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響※

李紅剛 王紅鴿 聶曉楓 孫 陳衛(wèi)銀

(陜西省渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院臨床教研室，陜西 渭南 714000)

實(shí) 驗(yàn) 研 究

3個(gè)道地產(chǎn)區(qū)丹參混合提取物對(duì)大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響※

(陜西省渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院臨床教研室，陜西 渭南 714000)

目的 通過(guò)觀察山東、河南、四川3個(gè)道地產(chǎn)區(qū)丹參混合提取物對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注后腦組織B細(xì)胞淋巴瘤-2基因(Bc1-2)、腫瘤抑制基因p53的影響，探討3個(gè)道地產(chǎn)區(qū)丹參對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。方法 將60只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組、山東丹參組、河南丹參組、四川丹參組，每組10只。用線栓法阻斷大腦中動(dòng)脈，建立大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，用蘇木精-伊紅(HE)染色法觀察缺血腦組織的病理學(xué)變化，采用免疫組化法檢測(cè)再灌注24 h后各組Bc1-2和p53蛋白的表達(dá)。結(jié)果 正常組和假手術(shù)組細(xì)胞與間質(zhì)之間界限清楚，細(xì)胞核完整，核仁清晰；模型組細(xì)胞與間質(zhì)之間界限不清楚，大部分組織細(xì)胞壞死，多數(shù)細(xì)胞溶解呈空泡狀，可見(jiàn)核固縮和核碎裂；3個(gè)道地產(chǎn)區(qū)丹參組腦組織細(xì)胞壞死程度均較模型組輕，可見(jiàn)少量細(xì)胞核固縮及溶解，部分胞質(zhì)液化。正常組、假手術(shù)組Bcl-2的積分光密度值(IOD)較少，二者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；模型組Bcl-2的IOD值較正常組、假手術(shù)組增加(P<0.05)；與模型組比較，3個(gè)道地產(chǎn)區(qū)丹參組均能上調(diào)Bcl-2的IOD值(P<0.05)；與河南、四川丹參組比較，山東丹參組上調(diào)Bcl-2的IOD值的幅度最大(P<0.05)。正常組、假手術(shù)組p53的IOD值較少，二者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；模型組p53的IOD值較正常組、假手術(shù)組增加(P<0.05)；與模型組比較，3個(gè)道地產(chǎn)區(qū)丹參組均能降低p53的IOD值(P<0.01)；與河南丹參組比較，山東、四川丹參組降低p53的IOD值的幅度最大(P<0.05)。結(jié)論 3個(gè)道地產(chǎn)區(qū)丹參混合提取物均能通過(guò)上調(diào)Bcl-2表達(dá)、降低p53表達(dá)，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮腦保護(hù)作用。不同產(chǎn)區(qū)丹參混合提取物對(duì)各指標(biāo)表達(dá)影響不同，其原因可能與不同產(chǎn)區(qū)丹參混合提取物所含活性成分的含量不同，作用靶點(diǎn)不一致有關(guān)。

疾病模型，動(dòng)物；腦缺血；神經(jīng)元，細(xì)胞學(xué)；細(xì)胞凋亡；再灌注損傷；丹參

丹參是常用活血化瘀藥之一，其對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型的影響報(bào)道較多，其單體成分通過(guò)不同途徑對(duì)腦缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用，但未見(jiàn)不同產(chǎn)地丹參對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型影響的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究選取山東、河南、四川3個(gè)道地產(chǎn)區(qū)丹參混合提取物，旨在觀察不同產(chǎn)區(qū)丹參對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注后腦組織B細(xì)胞淋巴瘤-2基因(Bc1-2)、腫瘤抑制基因p53的影響，從而探討其對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康Sprague-Dawley(SD)大鼠60只，購(gòu)于四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：scxk(川)-10-2006，雌雄各半，鼠齡7～8周，清潔級(jí)，體質(zhì)量平均(275.35±24.28) g。在成都中醫(yī)藥大學(xué)時(shí)間生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(TCM-03-150)喂養(yǎng)。手術(shù)前后常規(guī)飼養(yǎng)，室溫保持23～25 ℃，自由進(jìn)水、進(jìn)食。

1.1.2 藥品與試劑 采取四川省德陽(yáng)市中江縣古店鄉(xiāng)、山東省臨沂市沂南縣、河南省南陽(yáng)市方城縣栽培丹參根10 kg，樣品采集后快速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)常規(guī)加工處理后，干燥成藥材，由成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院提取制成0.4 g/mL生藥的供試品溶液。兔抗大鼠Bcl-2單克隆抗體、兔抗大鼠p53單克隆抗體 (均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；生物素化羊抗兔IgG抗體(購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 造模及分組 大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)造模方法采用在 Zea longa[1]基礎(chǔ)上改良的造模方法頸內(nèi)動(dòng)脈線栓加環(huán)扎法。將60只SD大鼠隨機(jī)分為正常組(n=10)、假手術(shù)組(n=10)、模型組(n=10)、四川丹參組(n=10)、山東丹參組(n=10)及河南丹參組(n=10)。

1.2.2 治療方法 正常組：不予任何干預(yù)手段；假手術(shù)組：暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈分叉，然后縫合皮膚，術(shù)前5 d予0.9%氯化鈉注射液灌胃，每日1次，術(shù)后2 h予0.9%氯化鈉注射液再灌胃1次；模型組：MCAO造模90 min后再灌注，造模前5 d予0.9%氯化鈉注射液灌胃，每日1次，再灌注后2 h予0.9%氯化鈉注射液再灌胃1次；四川丹參組、山東丹參組、河南丹參組：MCAO造模90 min后再灌注，造模前5 d分別予四川、山東、河南丹參混合提取物灌胃，每日1次，再灌注后2 h再灌胃1次。再灌注24 h后處死大鼠。根據(jù)人和動(dòng)物用量體表面積換算法[2]計(jì)算，實(shí)驗(yàn)中丹參混合提取物的灌胃劑量為6.75 mL/kg。

1.2.3 大鼠死亡情況 正常組、假手術(shù)組無(wú)死亡，模型組死亡2只，四川丹參組死亡3只，山東丹參組和河南丹參組各死亡4只，故按照山東丹參組和河南丹參組大鼠存活數(shù)，在其他各組存活大鼠中每組隨機(jī)選取6只進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4 蘇木精-伊紅(HE)染色法及免疫組化檢測(cè)方法 病理組織切片標(biāo)本收集及處理：①各組大鼠再灌注后24 h灌注取腦并固定，固定72 h后做成石蠟切片，每個(gè)標(biāo)本各取1張用于HE染色。②應(yīng)用鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)法(SP)進(jìn)行，一抗為兔抗大鼠Bcl-2、p53單克隆抗體，二抗為生物素化羊抗兔IgG抗體,封片后再采用光鏡觀察。③免疫組化染色結(jié)果拍照后進(jìn)行半定量分析，并計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的積分光密度值(IOD)。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠光鏡下組織病理學(xué)改變 見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠光鏡下組織病理學(xué)改變(HE，×100)

由圖1可見(jiàn)，正常組和假手術(shù)組細(xì)胞與間質(zhì)之間界限清楚，細(xì)胞核完整，核仁清晰；模型組細(xì)胞與間質(zhì)之間界限不清楚，大部分組織細(xì)胞壞死，多數(shù)細(xì)胞溶解呈空泡狀，可見(jiàn)核固縮和核碎裂；3個(gè)道地產(chǎn)區(qū)丹參組腦組織細(xì)胞壞死程度均較模型組輕，可見(jiàn)少量細(xì)胞核固縮及溶解，部分胞質(zhì)液化。

2.2 各組大鼠Bcl-2的IOD值比較 見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠Bcl-2的IOD值比較

組 別nBcl-2(×106)正常組60.49±0.11假手術(shù)組60.50±0.06模型組61.43±0.33*山東丹參組63.44±1.39△河南丹參組62.42±0.88△#四川丹參組62.36±0.90△#

與正常組、假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與山東丹參組比較，#P<0.05

由表1可見(jiàn)，正常組、假手術(shù)組Bcl-2 IOD值較少，二者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；模型組Bcl-2的IOD值較正常組、假手術(shù)組增加(P<0.05)；與模型組比較，3個(gè)道地產(chǎn)區(qū)丹參組均能上調(diào)Bcl-2的IOD值(P<0.05)；與河南、四川丹參組比較，山東丹參組上調(diào)Bcl-2的IOD值的幅度最大(P<0.05)；河南丹參組與四川丹參組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組對(duì)Bcl-2表達(dá)的影響見(jiàn)圖2。

圖2 各組對(duì)Bcl-2表達(dá)的影響(免疫組化染色，×400)

2.3 各組大鼠p53的IOD值比較 見(jiàn)表2。

由表2可見(jiàn)，正常組、假手術(shù)組p53的IOD值較少，二者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；模型組p53的IOD值較正常組、假手術(shù)組增加(P<0.05)；與模型組比較，3個(gè)道地產(chǎn)區(qū)丹參組均能降低p53的IOD值(P<0.01)；與河南丹參組比較，山東、四川丹參組降低p53的IOD值的幅度最大(P<0.05)；山東丹參組與四川丹參組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組對(duì)p53表達(dá)的影響見(jiàn)圖3。

表2 各組大鼠p53的IOD值比較

組 別np53(×105)正常組60.81±0.25假手術(shù)組60.79±0.23模型組618.46±1.86*河南丹參組69.00±2.19△山東丹參組64.41±1.32△#四川丹參組64.21±1.52△#

與正常組、假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.01；與河南丹參組比較，#P<0.05

圖3 各組對(duì)p53表達(dá)的影響(免疫組化染色，×400)

3 討 論

腦缺血再灌注是指腦缺血一段時(shí)間后，再恢復(fù)其血液供應(yīng)的過(guò)程。多數(shù)研究表明，腦缺血再灌注后腦缺血性的損傷反而會(huì)加重，其機(jī)制非常復(fù)雜，包括興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性作用、白細(xì)胞滲透、血小板和補(bǔ)體激活、細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載、炎性細(xì)胞因子損傷、過(guò)度灌注、凋亡調(diào)控基因的激活等因素[3]。腦缺血再灌注后細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡并存，細(xì)胞壞死主要位于缺血中心區(qū)，是不可逆的；而細(xì)胞凋亡主要出現(xiàn)在缺血灶周?chē)鷧^(qū)即缺血半暗帶，是可逆的。因此，腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞凋亡已成為研究熱點(diǎn)。

現(xiàn)已知與神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因可分為兩大類(lèi)[4]：一類(lèi)是抑制凋亡的基因，如Bc1-2等；另一類(lèi)是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因，如p53、bax等。本實(shí)驗(yàn)研究選取Bc1-2和p53作為觀察指標(biāo)，探討3個(gè)道地產(chǎn)區(qū)丹參混合提取物對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。

關(guān)于丹參藥材的道地產(chǎn)區(qū)，郭寶林等[5]考證，《名醫(yī)別錄》述“生桐柏山谷及太山”(今河南和湖北交界及山東泰山一帶)，《圖經(jīng)本草》述“今陜西河?xùn)|州郡及隨州皆有之”(今山西、湖北，河?xùn)|州郡應(yīng)歸為山西而非陜西)，《本草品匯精要》述“道地隨州”(今湖北隨州)，《藥物出產(chǎn)辨》述“產(chǎn)四川龍安府為佳”(今四川平武)，可見(jiàn)在歷史上湖北、河南、山東、山西、四川等幾個(gè)省都曾被視為丹參的道地產(chǎn)區(qū)。近代以來(lái), 四川產(chǎn)丹參被視為佳品，《中國(guó)道地藥材》[6]將丹參列為四川產(chǎn)道地藥材?？偨Y(jié)起來(lái)，文獻(xiàn)記載的丹參道地產(chǎn)區(qū)主要有四川、河南、山東、山西及湖北5個(gè)產(chǎn)地。多數(shù)研究表明，不同產(chǎn)地丹參中丹參酮ⅡA、丹酚酸和丹參素等活性成分的含量差別較大。本實(shí)驗(yàn)研究所選用四川省德陽(yáng)市中江縣古店鄉(xiāng)、山東省臨沂市沂南縣、河南省南陽(yáng)市方城縣3個(gè)道地產(chǎn)區(qū)丹參，經(jīng)測(cè)定丹參酮ⅡA、丹酚酸和丹參素等活性成分的含量差別較大，與多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相似[7-8]。

Bcl-2、p53是目前研究較多的一對(duì)凋亡調(diào)控基因。Bcl-2基因首先在血液淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2是細(xì)胞凋亡的重要抑制基因，它在腦缺血中表達(dá)并起重要作用[9]。p53是1979年Lane DP等[10]在DNA病毒SV40感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，因其相對(duì)分子質(zhì)約53×103(53KD)，故簡(jiǎn)稱(chēng)p53。Villunger A等[11]認(rèn)為，p53是引起缺血再灌注后神經(jīng)元凋亡的關(guān)鍵因素。總之，腦缺血再灌注后腦內(nèi)p53表達(dá)明顯增加，活性提高?？梢?jiàn)，Bcl-2和p53基因?qū)δX細(xì)胞凋亡起重要作用，二者表達(dá)水平的高低與凋亡的嚴(yán)重性直接相關(guān)，Bcl-2升高，抑制細(xì)胞凋亡；p53升高，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12-13]。

觀察結(jié)果表明，山東、河南、四川3個(gè)道地產(chǎn)區(qū)丹參混合提取物均能明顯提高Bcl-2表達(dá)，降低p53表達(dá)，表明3個(gè)產(chǎn)區(qū)丹參混合提取物通過(guò)上調(diào)Bcl-2、下調(diào)p53表達(dá)而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而改善缺血再灌注損傷而發(fā)揮腦保護(hù)作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，3個(gè)道地產(chǎn)區(qū)丹參混合提取物對(duì)Bcl-2和p53表達(dá)的影響不同，對(duì)Bcl-2的表達(dá)，山東丹參組上調(diào)的幅度大于河南丹參組、四川丹參組(P<0.05)；河南丹參組與四川丹參組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對(duì)p53的表達(dá)，山東丹參組、四川丹參組降低p53的幅度大于河南丹參組(P<0.05)；山東丹參組與四川丹參組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。綜上，3個(gè)道地產(chǎn)區(qū)丹參混合提取物均能影響B(tài)cl-2、p53表達(dá)，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。不同產(chǎn)區(qū)丹參混合提取物對(duì)各指標(biāo)表達(dá)影響不同，其原因可能與不同產(chǎn)區(qū)丹參混合提取物所含活性成分的含量不同，作用靶點(diǎn)不一致有關(guān)。

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(本文編輯：習(xí) 沙)

Effecs of Danshen mixed extract from 3 genuine producing areas on nerve cells apoptosis in cerebral ischemia and reperfusion rats

LIHonggang,WANGHongge,NIEXiaofeng,etal.

ClinicalTeachingandResearchSection,MedicalSchoolofWeinanVocationalTechnicalInstituteinShanxiProvince,Shanxi,Weinan714000

Objective To observe the effecs of Danshen mixed extract from 3 genuine producing areas (Shandong, Henan, Sichuan) on B-cell lymphoma-2 gene (Bcl-2) and tumor suppressor gene p53 in cerebral ischemia and reperfusion rats, to investigate the effects Danshen of three difference area on nerve cells apoptosis. Methods 60 SD rats were randomly divided into normal group, shame operation group, model group，Shandong Danshen group, Henan Danshen group and Sichuan danshen group, 10 rats in each group. The rats model of focal cerebral ischemia-reperfusion were established with the middle cerebral artery occlusion .The pathologic change of cerebral ischemia tissue was observed by HE staining. The expressions of Bc1-2 and p53 after 24 reperfusion were observed by mean of immunohistochemistry. Results Cells in normal and shame operation group had clear margin with mesenchyme, integral nucleus and clear nucleolus. Cells in model group had unclear margin with mesenchyme, many cytolysis showed vacuole-shape, and the karyopyknosis and nuclear fragmentation were observed. The necrotic degree of brain tissue cells in three genuine producing areas were lighter than model group, there were few karyopyknosis and karyolysis, partial plasmatosis. The integrated optical density (IOD) of Bcl-2 in normal and shame operation group was fewer, with no statistical difference between two groups (P>0.05). The IOD of Bcl-2 in model group was increased as compared with the normal and shame operation group (P<0.05). As compared with model group, the IOD of Bcl-2 in three genuine producing areas were up-regulation (P<0.05). As compared with Henan and Sichuan danshen group, the IOD of Bcl-2 in Shandong Danshen group had maximum enhanced amplitude (P<0.05). The IOD of p53 in normal and shame operation group was fewer, with no statistical difference between two groups (P>0.05). The IOD of p53 in model group was increased as compared with the normal and shame operation group (P<0.05). As compared with model group, the IOD of p53 in three genuine producing areas were down-regulation (P<0.01). As compared with Henan danshen group,the IOD of p53 in Shandong and Sichuan Danshen group had maximum reduction amplitude (P<0.05). Conclusion Danshen mixed extract from 3 genuine producing areas can up-regulate Bcl-2 and down-regulate the p53, thus inhibit the neuronal apoptosis, play a role in cerebral protection. Danshen from difference ares with difference effects on various indexes, which may be related with difference content of active ingredients and action targets inconformity.

Disease model; Animals; Cerebral ischemia; Nerve cell; Cytology; Apoptosis; Reperfusion injury; Danshen

10.3969/j.issn.1002-2619.2016.10.018

※ 項(xiàng)目來(lái)源：渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院院級(jí)科研項(xiàng)目(編號(hào)：WZYY201322)

李紅剛(1979—)，男，主治醫(yī)師，講師，碩士。從事內(nèi)科學(xué)臨床、教學(xué)及科研工作。

R-332；R322.8；R329.25；R341；R743.31

A

1002-2619(2016)10-1515-05

2016-07-28)

△ 通訊作者：成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川 成都 610072