陰溝腸桿菌產(chǎn)AmpC酶和ESBLs的檢測及耐藥性分析*

楊洪芬，李 美，3，劉 寶，萬 珊，楊煥婕，費(fèi) 櫻，3△

(1.貴州省貴陽市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 550081；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院微生物免疫科，貴陽 550001；3.貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，貴陽 550004)

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·論 著·

陰溝腸桿菌產(chǎn)AmpC酶和ESBLs的檢測及耐藥性分析*

楊洪芬1，李 美1，3，劉 寶2，萬 珊2，楊煥婕2，費(fèi) 櫻2，3△

(1.貴州省貴陽市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 550081；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院微生物免疫科，貴陽 550001；3.貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，貴陽 550004)

目的 明確陰溝腸桿菌產(chǎn)頭孢菌素酶(AmpC酶)和超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)的情況，分析細(xì)菌產(chǎn)酶與藥物耐藥間的關(guān)系，指導(dǎo)臨床合理用藥。方法 非重復(fù)陰溝腸桿菌共174株采用Microscan walkaway-40SI全自動(dòng)細(xì)菌鑒定與藥敏分析儀進(jìn)行細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)；采用多底物協(xié)同-拮抗法(MSSAT)檢測ESBLs和AmpC酶。結(jié)果 174株陰溝腸桿菌中，單產(chǎn)AmpC酶92株(52.87%),其中高誘導(dǎo)型25株，部分去阻遏型33株，完全去阻遏型22株；同時(shí)產(chǎn)AmpC酶和ESBLs 54株(31.03%)；單產(chǎn)ESBLs 1株(0.57%)；AmpC酶和ESBLs均不產(chǎn)有27株(15.52%)；陰溝腸桿菌產(chǎn)酶株的耐藥率明顯高于不產(chǎn)酶株的耐藥率(P<0.05)，同時(shí)產(chǎn)AmpC酶和ESBLs菌株的耐藥率高于單產(chǎn)AmpC酶株的耐藥率(P<0.05)；產(chǎn)AmpC酶和ESBLs菌株對頭孢曲松、頭孢噻肟、哌拉西林的耐藥率均高于92.0%，對氨曲南耐藥率高達(dá)88.9%，對阿米卡星耐藥率較低(14.8%)，對亞胺培南耐藥率為0%。結(jié)論 陰溝腸桿菌以產(chǎn)AmpC酶為主，單產(chǎn)ESBLs菌株少，同時(shí)產(chǎn)AmpC酶和ESBLs的菌株對三代頭孢菌素、單環(huán)類、青霉素類具有高度耐藥性，對碳青霉烯類藥物敏感；碳青霉烯類抗菌藥物依然是治療多重耐藥陰溝腸桿菌感染的首選。

陰溝腸桿菌； 頭孢菌素酶； 超廣譜β-內(nèi)酰胺酶； 耐藥性

陰溝腸桿菌是醫(yī)院感染常見的條件致病菌之一，可引起呼吸道、傷口、血液系統(tǒng)、泌尿道等多部位感染[1]。隨著廣譜抗菌藥物的廣泛使用，細(xì)菌的耐藥情況變得越來越嚴(yán)重。大多常見致病菌對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的主要機(jī)制產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，而陰溝腸桿菌產(chǎn)頭孢菌素酶(AmpC酶)和超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)是導(dǎo)致其對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的重要原因之一[2]。鑒于本地區(qū)對陰溝腸桿菌產(chǎn)AmpC酶和ESBLs檢測狀況的研究報(bào)道甚少，本文選用明德松等[3]建立的多底物協(xié)同拮抗法(MSSAT)檢測貴陽市第二人民醫(yī)院陰溝腸桿菌產(chǎn)AmpC酶和ESBLs的情況，分析細(xì)菌產(chǎn)酶與耐藥間的關(guān)系，旨在為臨床控制感染及臨床合理使用抗菌藥物提供一定的理論參考依據(jù)，現(xiàn)具體報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集2013年6月至2014年6月臨床檢出的鑒定率達(dá)98.0%以上的陰溝腸桿菌共174株，去除同一病例同一部位標(biāo)本的重復(fù)菌株。質(zhì)控菌株:大腸埃希菌 ATCC25922、銅綠假單胞菌 ATCC27853和肺炎克雷伯菌 ATCC700603(由貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院微生物免疫科保存)。

1.2 儀器與試劑 Microscan WalkAway-40 SI全自動(dòng)細(xì)菌鑒定與藥敏分析儀(Siemens，德國)；鑒定藥敏復(fù)合檢測板NC50(Siemens,德國)；藥敏紙片：頭孢噻肟(CTX，30微克/片)、頭孢噻肟/克拉維酸(CTX/CA，30/10微克/片)、頭孢他啶(CAZ，30微克/片)、頭孢他啶/克拉維酸(CAZ/CA，30/10微克/片)、頭孢吡肟(FEP，30微克/片)、亞胺培南(IPM，10微克/片)和頭孢西丁(FOX，30微克/片)，均購自英國Oxoid公司。

1.3 方法

1.3.1 陰溝腸桿菌耐藥性分析 細(xì)菌分離、培養(yǎng)按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第3版要求進(jìn)行[4]，采用Microscan walkaway-40SI全自動(dòng)細(xì)菌鑒定與藥敏分析儀和鑒定藥敏復(fù)合檢測板進(jìn)行細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)，結(jié)果判讀參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會2013版標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[5]，并得出藥敏數(shù)據(jù)。

1.3.2 陰溝腸桿菌產(chǎn)AmpC酶和ESBLs表型檢測及結(jié)果判讀 參照明德松等[3]建立的多底物協(xié)同拮抗法(MSSAT)進(jìn)行檢測及結(jié)果判讀。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用WHONET5.6軟件和SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 陰溝腸桿菌產(chǎn)不同表型AmpC酶和ESBLs MSSAT結(jié)果顯示，174株陰溝腸桿菌中，單產(chǎn)ESBLs 1株，單產(chǎn)AmpC酶 92株，同時(shí)產(chǎn)ESBLs和AmpC酶 54株，2種酶均不產(chǎn)27株。見表1。

2.2 陰溝腸桿菌產(chǎn)酶株耐藥情況 對產(chǎn)酶株與不產(chǎn)酶株耐藥結(jié)果分析顯示，產(chǎn)酶株的耐藥率明顯高于不產(chǎn)酶株的耐藥率(P<0.05)，同時(shí)產(chǎn)AmpC酶+ESBLs的陰溝腸桿菌耐藥率明顯高于單產(chǎn)AmpC酶耐藥率(P<0.05)，見表2。

表1 174株陰溝腸桿菌的產(chǎn)酶率

表2 174株陰溝腸桿菌對15種抗菌藥物的耐藥率(%)

藥物名稱陰溝腸桿菌(n=174)AmpC酶陽性(n=92)AmpC酶+ESBLs均陽性(n=54)AmpC酶+ESBLs均陰性(n=27)阿米卡星5.21.114.80.0氨曲南40.820.788.911.1頭孢他啶36.222.874.13.7環(huán)丙沙星20.19.844.43.7頭孢曲松42.520.798.13.7頭孢噻肟42.020.796.33.7頭孢吡肟33.315.277.83.7慶大霉素23.010.953.70.0亞胺培南1.12.20.00.0左氧氟沙星12.13.331.53.7哌拉西林42.522.892.67.4復(fù)方磺胺甲噁唑32.816.374.13.7替卡西林/克拉維酸32.822.863.03.7妥布霉素21.39.850.00.0

表3 陰溝腸桿菌不同表型產(chǎn)酶株對15種抗菌藥物的耐藥率(%)

續(xù)表3 陰溝腸桿菌不同表型產(chǎn)酶株對15種抗菌藥物的耐藥率(%)

2.3 陰溝腸桿菌不同表型產(chǎn)酶株耐藥情況 產(chǎn)不同表型AmpC酶的陰溝腸桿菌耐藥率顯示，完全去阻遏型的耐藥率最高，其次是部分去阻遏型，高誘導(dǎo)型的耐藥率最低；同時(shí)產(chǎn)AmpC酶及ESBLs菌株的高誘導(dǎo)型、部分去阻遏型、完全去阻遏型陰溝腸桿菌耐藥率明顯高于單產(chǎn)AmpC酶各型的耐藥率。見表3。

3 討 論

近來研究發(fā)現(xiàn)，高產(chǎn)AmpC酶和ESBLs是陰溝腸桿菌對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的主要機(jī)制[6]。因此，及時(shí)、正確地檢測出產(chǎn)酶菌株具有重要的臨床意義，至今尚無公認(rèn)的關(guān)于陰溝腸桿菌產(chǎn)ESBLs和AmpC酶表型檢測的確認(rèn)方法。美國臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會推薦的用于大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌產(chǎn)ESBLs檢測的雙紙片確證法是檢測陰溝腸桿菌產(chǎn)ESBLs借鑒最多的方法。目前，檢測AmpC酶的方法有改良三維試驗(yàn)、頭孢菌素初篩試驗(yàn)、等電聚焦及氟氯西林抑制試驗(yàn)等，而改良三維實(shí)驗(yàn)較為經(jīng)典，且文獻(xiàn)運(yùn)用較多，但該方法操作繁瑣，影響因素較多。MSSAT能夠一步檢測出產(chǎn)ESBLs、3種類型(高誘導(dǎo)型、部分去阻遏型、完全去阻遏型)AmpC酶及二者不同組合產(chǎn)酶情況，但對于AmpC酶存在的其他表型，此法也不能一步同時(shí)檢測。本研究對產(chǎn)AmpC酶的不同表型結(jié)果顯示，92株單產(chǎn)AmpC酶中，有12株陰溝腸桿菌表型出現(xiàn)頭孢西丁耐藥、亞胺培南敏感，但亞胺培南與周邊5種紙片并沒有出現(xiàn)拮抗現(xiàn)象而產(chǎn)生內(nèi)外緣半徑差，故而不能分型，可能是陰溝腸桿菌中還存在其他類型的AmpC酶而本法不能檢測出，有待科研工作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)更加全面的檢測方法。由于本實(shí)驗(yàn)結(jié)果是通過量取內(nèi)外緣半徑差來判斷產(chǎn)不同類型的AmpC酶，測量誤差對實(shí)驗(yàn)影響大，對內(nèi)外緣半徑的測量要嚴(yán)格，相差1 mm則就可能被判定為不同表型。為了試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，最好選用游標(biāo)卡尺進(jìn)行測量。本研究實(shí)驗(yàn)過程中，同時(shí)選用直徑為90 mm和150 mm的M-H瓊脂平板檢測菌株產(chǎn)ESBLs與AmpC酶表型情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用直徑為150 mm的M-H瓊脂平板比使用90 mm的M-H瓊脂平板更易于結(jié)果的判斷，減少了因測量誤差所導(dǎo)致的分型錯(cuò)誤，從而提高了試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

本次研究結(jié)果顯示，174株陰溝腸桿菌中，單產(chǎn)AmpC酶占52.87%，高于陸丹倩等[7]報(bào)道的12.35%和趙德軍等[8]報(bào)道的23.1%，低于楊月琳[9]的64.0%；同時(shí)產(chǎn)ESBLs與AmpC酶檢出率為31.03%，均高于以上地區(qū)的相應(yīng)報(bào)道。對陰溝腸桿菌在不同地區(qū)、不同醫(yī)院之間產(chǎn)AmpC酶和ESBLs存在著的明顯差異，可能與其感染情況、用藥習(xí)慣、環(huán)境、醫(yī)院感染及消毒隔離措施等諸多原因有關(guān)。

有研究學(xué)者將同一細(xì)菌所產(chǎn)生的ESBLs及質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶稱之為超超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(SSBLs)，其表現(xiàn)為對第三代頭孢菌素、頭霉素及酶抑制劑復(fù)合制劑均耐藥[10]。本研究對陰溝腸桿菌產(chǎn)酶株與耐藥性分析發(fā)現(xiàn)，同時(shí)產(chǎn)AmpC酶和ESBLs菌株耐藥率明顯高于單產(chǎn)AmpC酶和不產(chǎn)酶株的耐藥率(P<0.05)，同時(shí)產(chǎn)AmpC酶及ESBLs菌株對青霉素類的哌拉西林、三代頭孢類藥物頭孢曲松和頭孢噻肟、單環(huán)類抗菌藥物氨曲南表現(xiàn)出高度耐藥性，對四代頭孢藥物頭孢吡肟的耐藥率也高達(dá)77.8%；對喹諾酮類與氨基糖苷類抗菌藥物也有較高的耐藥率；對阿米卡星較敏感，對亞胺培南敏感。而單產(chǎn)AmpC酶菌株與非產(chǎn)酶株耐藥率之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表現(xiàn)為對三代頭孢,氨曲南，哌拉西林等各類抗菌藥物的耐藥率均不高(<23%)，對亞胺培南的耐藥率均為100.0%。AmpC酶的強(qiáng)誘導(dǎo)劑是碳青霉烯類抗菌藥物,但因其空間構(gòu)象特殊,使其具有很強(qiáng)的抗菌活性,能在誘導(dǎo)產(chǎn)生足量AmpC酶之前快速殺滅細(xì)菌,且對AmpC酶高度穩(wěn)定，所以是治療產(chǎn)酶菌株感染的有效藥物，可作為陰溝腸桿菌重癥感染的首選抗菌藥物，其次為阿米卡星，而喹諾酮類及氨基糖苷類抗菌藥物對產(chǎn)AmpC酶和ESBLs的耐藥狀況各地報(bào)道不一,需根據(jù)當(dāng)?shù)厮幟羟闆r進(jìn)行選擇。

陰溝腸桿菌是產(chǎn)生AmpC酶的典型細(xì)菌[11]?？咕幬镎T導(dǎo)調(diào)節(jié)是染色體介導(dǎo)AmpC酶基因表達(dá)的一種經(jīng)典模式。例如，在缺乏β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物(如頭孢西丁、亞胺培南等)誘導(dǎo)時(shí),許多革蘭陰性桿菌只產(chǎn)生少量的AmpC酶,但在β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物存在時(shí)，AmpC酶的產(chǎn)量明顯增加，其表型為產(chǎn)高誘導(dǎo)型AmpC酶。AmpC酶的誘導(dǎo)表達(dá)是由染色體上的amp復(fù)合操縱子調(diào)控的，其包括上游的調(diào)節(jié)基因ampR、ampG、ampD、ampE和結(jié)構(gòu)基因ampC。當(dāng)調(diào)節(jié)基因ampD發(fā)生突變時(shí),其編碼產(chǎn)生的AmpD蛋白的功能部分或全部喪失,致使AmpC酶表達(dá)部分或完全去阻遏效應(yīng),使得細(xì)菌持續(xù)高產(chǎn)AmpC酶,對應(yīng)的AmpC酶表型分別為部分去阻遏型(非誘導(dǎo)型)和完全去阻遏型。本次研究對陰溝腸桿菌不同表型產(chǎn)酶株的耐藥情況分析發(fā)現(xiàn)，單產(chǎn)AmpC酶的不同表型對15種抗菌藥物的耐藥率基本是高誘導(dǎo)型最低，其次是部分去阻遏型，完全去阻遏型的耐藥率最高(均不超過60%)，這可能是由于誘導(dǎo)型AmpC酶產(chǎn)酶率低，故其耐藥率低；而同時(shí)產(chǎn)ESBLs及AmpC酶3種表型菌株對15種抗菌藥物(亞胺培南除外)的耐藥率均明顯高于單產(chǎn)AmpC酶的3種表型菌株的耐藥率(P<0.05)，提示陰溝腸桿菌在產(chǎn)ESBLs的同時(shí)存在產(chǎn)AmpC酶的話，會使細(xì)菌對抗菌藥物的耐藥性明顯提高。

綜上所述，產(chǎn)AmpC酶和ESBLs的陰溝腸桿菌存在的多重耐藥問題給臨床抗感染治療及控制耐藥菌株的產(chǎn)生帶來極大困難，及時(shí)、準(zhǔn)確地檢測陰溝腸桿菌產(chǎn)AmpC酶和ESBLs情況可以了解其耐藥機(jī)制，對臨床抗感染治療有重要意義。當(dāng)前檢測AmpC酶的方法多種多樣，但還沒有一種國際公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)方法，有待廣大的科研人員研究出一種簡單、快速而準(zhǔn)確的檢測方法。

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Analysis of antibiotic resistance and detection of AmpC producing and ESBLs producing E.cloacae*

YANGHongfen1,LIMei1,3,LIUBao2,WANShan2,YANGHuanjie2,FEIYing2,3△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,GuiyangMunicipalSecondPeople′sHospital,Guiyang,Guizhou550081,China;2.DepartmentofMicroorganismandImmunology,AffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang,Guizhou550001,China;3InstituteofClinicalLaboratory,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang,Guizhou550004,China)

Objective To determine the situation of E.cloacae for producing extented spectrum beta-lactamases(ESBLs) and cephalosporinase (AmpC) and to analyze the relationship between bacterial enzyme production and drug resistance for guiding rational drug use in clinic.Methods A total of 174 strains of non-repetitive E.cloacae were performed the identification and drug susceptibility test by adopting the Microscan walkaway 40SI fully automatic bacterial identification and drug susceptibility analyzer;the multi-substrates synergy-antagonize test(MSSAT) was used for detecting ESBLs and AmpC.Results Among 174 strains of E.cloacae,92 strains(52.87%) only produced AmpC,25 strains produced highly inducible AmpC,33 strains produced partially derepressed AmpCs and 22 strains produced completely derepressed AmpCs;54 strains(31.03%) produced both AmpC and ESBLs;1 strain (0.57%) only produced ESBLs;27 strains(15.52%) did notproduced AmpC and ESBLs.The drug resistance rate of enzyme producing E.cloacae strains was significantly higher than that of non-enzyme producing E.cloacae strains (P<0.05).The resistance rate of both AmpC producing and ESBLs producing strains was significantly higher than that of only AmpC producing strains(P<0.05).The resistance rates of E.cloacae producing both AmpC and ESBLs to ceftriaxone,cefotaxime and piperacillin were more than 92.0%,which to aztreonam was up to 88.9%,which to amikacin was relatively low(15.1%) and which to imipenem was 0%.Conclusion E.cloacae is dominated by AmpC producing,simply producing ESBLs strains is little.Both AmpCs and ESBLs producing E.cloacae strain shows high drug resistance to third generation cephalosporin,single ring antibiotics and penicillins,and sensitive to carbapenem drugs.Carbapenem antibacterial drugs are still the first choice for treating multi-drug resistant E.cloacae infection.

Enterobacter cloacae; AmpC; extented spectrum beta-lactamase; drug resistance

貴州省貴陽市科技局基金資助項(xiàng)目(筑科合同[20151001]社34號)。

楊洪芬，女，主任技師，主要從事病原生物學(xué)檢測研究?！?/p>

，E-mail:645903661@qq.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.24.006

A

1673-4130(2016)24-3400-04

2016-09-01

2016-10-20)