水稻OsDHHC13基因參與氧化脅迫響應(yīng)的初步研究

劉選明，王文文，楊遠(yuǎn)柱，夏妙林，李 夏，左棟梁，林建中

(1. 湖南大學(xué) 生物學(xué)院 植物功能基因組學(xué)與發(fā)育調(diào)控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410082；2. 湖南亞華種業(yè)科學(xué)研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410001)

水稻OsDHHC13基因參與氧化脅迫響應(yīng)的初步研究

劉選明1*，王文文1，楊遠(yuǎn)柱2，夏妙林1，李 夏1，左棟梁1，林建中1*

(1. 湖南大學(xué) 生物學(xué)院 植物功能基因組學(xué)與發(fā)育調(diào)控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410082；2. 湖南亞華種業(yè)科學(xué)研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410001)

DHHC型鋅指蛋白參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的棕櫚酰化修飾，對(duì)細(xì)胞和個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育起著重要的調(diào)控作用.OsDHHC13是典型的DHHC型鋅指蛋白基因.生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，OsDHHC13的啟動(dòng)子區(qū)域含有脅迫及光響應(yīng)元件，而且其編碼蛋白是具有4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的典型膜蛋白.對(duì)OsDHHC13過(guò)表達(dá)株系進(jìn)行H2O2的氧化脅迫處理發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)株系幼苗的根顯著長(zhǎng)于野生型，說(shuō)明OsDHHC13能解除H2O2對(duì)根生長(zhǎng)的抑制，提高了抗氧化脅迫的能力.隨后H2O2含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，OsDHHC13過(guò)表達(dá)株系幼苗根部的H2O2含量顯著低于野生型.進(jìn)一步的qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，與清除H2O2相關(guān)的酶基因的轉(zhuǎn)錄水平在過(guò)表達(dá)株系中顯著升高，說(shuō)明OsDHHC13能促進(jìn)清除H2O2的相關(guān)酶基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)內(nèi)源性H2O2的動(dòng)態(tài)平衡.總之，本研究結(jié)果初步證明鋅指蛋白基因OsDHHC13正調(diào)控水稻的抗氧化脅迫能力.

OsDHHC13基因；H2O2含量；根長(zhǎng)；鋅指蛋白

DHHC型鋅指蛋白是一類富含DHHC (Asp-His-His-Cys) 型鋅指結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì).DHHC型鋅指結(jié)構(gòu)域是一種富含半胱氨酸高度保守的鋅指結(jié)構(gòu)域，是一種常見(jiàn)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)單元.DHHC型鋅指蛋白一般具有的通用結(jié)構(gòu)，至少存在4段跨膜結(jié)構(gòu)域、DHHC-CRD結(jié)構(gòu)域以及DPG功能元件[1].DHHC型鋅指蛋白的主要功能是棕櫚酰化其下游蛋白，從而影響其下游蛋白的定位、轉(zhuǎn)運(yùn)，最終影響其生理功能[2].DHHC型鋅指蛋白的棕櫚酰化是生物體一種常見(jiàn)的修飾方式，它包括3種方式[3-4],最主要是PAT介導(dǎo)的硫酰基轉(zhuǎn)移，其次是硫酰基輔酶A介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移和以硫?；o酶A為輔酶的蛋白質(zhì)介導(dǎo)轉(zhuǎn)移.

以往對(duì)DHHC型鋅指蛋白的研究主要集中在動(dòng)物和酵母的研究.Pedram等[5]發(fā)現(xiàn)動(dòng)物體內(nèi)DHHC-7與DHHC-21蛋白能夠作為新靶點(diǎn)選擇性地抑制膜性類固醇受體定位并影響其功能.Fukata等[6]在人和鼠基因庫(kù)篩選時(shí)，篩選出23個(gè)能夠編碼不同DHHC型蛋白的DHHC基因.在植物中DHHC基因的功能研究相對(duì)甚少，目前只有OsDHHC1，AtTIP1(TIP GROWTH DEFECTIVE1)和At5g04270這3個(gè)基因的功能是研究的比較清楚的.研究發(fā)現(xiàn)OsDHHC1基因主要與水稻株型構(gòu)建及產(chǎn)量相關(guān)[7]，AtTIP1主要影響擬南芥的根毛的生長(zhǎng)[2].

活性氧ROS(Reactive oxygen species)是植物體內(nèi)普遍存在的一種代謝產(chǎn)物，主要包括超氧根離子、過(guò)氧化氫和羥自由基等[8-10].在正常情況下細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡中，ROS濃度相對(duì)比較低.但是當(dāng)植物受到非生物脅迫時(shí)，植物體內(nèi)這種動(dòng)態(tài)平衡就會(huì)受到破壞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)積累過(guò)多的ROS[11-12]，從而影響植物的各種生理功能.其中H2O2是研究最多的ROS，研究發(fā)現(xiàn)過(guò)量的H2O2會(huì)對(duì)植物造成損傷，而適量的H2O2可作為細(xì)胞內(nèi)一種信號(hào)分子，參與并調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)各種生物和非生物刺激的應(yīng)答反應(yīng)[13].近年的研究揭示, H2O2通過(guò)在信號(hào)傳導(dǎo)途徑的上游抑制或激活相關(guān)激酶的活性來(lái)啟動(dòng)或增強(qiáng)信號(hào)的作用從而影響植物的氧化脅迫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、氣孔的關(guān)閉、發(fā)育以及組織的形態(tài)建成[10,14-16].Ivanchenko等[17]發(fā)現(xiàn)H2O2能夠影響西紅柿根的發(fā)育，在IAA或H2O2處理下會(huì)導(dǎo)致dgt1-1突變體根部?jī)?nèi)源性H2O2增加，從而抑制西紅柿根的發(fā)育.Zhang等[18]發(fā)現(xiàn)H2O2可作為信號(hào)分子介導(dǎo)OsRACK1基因調(diào)控水稻種子的萌發(fā).

在本研究中，我們克隆了OsDHHC13基因，構(gòu)建了該基因過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系，并對(duì)OsDHHC13過(guò)表達(dá)株系的H2O2脅迫響應(yīng)進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)鋅指蛋白OsDHHC13正調(diào)控水稻的抗氧化脅迫響應(yīng).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

粳稻品種日本晴用于OsDHHC13基因的克隆和組織特異性表達(dá)分析.粳稻品種Kitaake用于作為轉(zhuǎn)化受體，其轉(zhuǎn)基因植株用于后續(xù)的分子及表型分析.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析

OsDHHC13基因全長(zhǎng)CDS序列與氨基酸序列通過(guò)TIGR(http://tigrblast.tigr.org/tgi, RiceGenome Annotation Project)和NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih. gov, National Center for Biotechnology information)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得.利用植物啟動(dòng)子順式作用元件分析網(wǎng)站plantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/ plantcare/html/) 對(duì)OsDHHC13基因啟動(dòng)子進(jìn)行分析.采用丹麥科技大學(xué)生物序列分析中心(CBS)的蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)程序TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) 進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè).

1.2.2 載體構(gòu)建與水稻轉(zhuǎn)化

利用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)克隆正向引物5’-CCCAAGCTTATGCTCTTCGTCATATGTGG TG-3’(下劃線為HindⅢ酶切位點(diǎn)) 和反向引物5’-CGGGATCCAAGAAGTTTTGAAC TCGAAT TGTC-3’ (下劃線為BamHⅠ酶切位點(diǎn))，然后以日本晴的cDNA為模板，用prime STAR 高保真酶(TaKaRa)，通過(guò)PCR反應(yīng)獲得目的片段.PCR反應(yīng)條件為：98 ℃，5 min；98℃，10 s；56 ℃，15 s；72 ℃，1 min ；共35個(gè)循環(huán).然后將PCR產(chǎn)物連接至pGEM-T Easy Vector (Promega)，送至鉑尚生物技術(shù)公司測(cè)序.最后將測(cè)序正確的OsDHHC13的CDS片段通過(guò)酶切連接到pHB載體[19].在pHB-OsDHHC13載體中，目標(biāo)基因OsDHHC13由2×35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)，植物中的篩選標(biāo)記基因?yàn)槌泵顾乜剐曰騂pt(主要用于轉(zhuǎn)化過(guò)程的抗性愈傷組織篩選)和除草劑Basta抗性基因bar(主要用于苗期篩選).

根據(jù)林建中等[20-21]的水稻轉(zhuǎn)化方法，將重組的質(zhì)粒pHB-OsDHHC13經(jīng)電擊法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，通過(guò)農(nóng)桿菌侵染水稻粳稻品種Kitaake的愈傷組織以獲取過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系.

1.2.3 轉(zhuǎn)基因水稻的鑒定及實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)分析

采用經(jīng)典的CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)法[ 20]從再生的轉(zhuǎn)基因水稻株系中提取DNA.然后以特異性引物(F: 5’-ATCTCGTGCTTTCAGCTTCG-3’; R: 5’-ACATCGCCTCGCTCCAGT-3’)進(jìn)行PCR鑒定T-DNA區(qū)域的潮霉素抗性基因Hpt.同時(shí)，采用Trizol試劑盒(Invitrogen)提取各轉(zhuǎn)基因株系葉片的總RNA，然后再利用Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒(TaKaRa)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA, 并以此為模板進(jìn)行qRT-PCR鑒定OsDHHC13的轉(zhuǎn)錄水平.PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃，2 min；95 ℃，10 min；95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s；45個(gè)循環(huán).重復(fù)3次，以持家基因OsActin1為內(nèi)參，然后使用Mx3000P軟件對(duì)相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行分析(qRT-PCR引物見(jiàn)表1).未轉(zhuǎn)化的Kitaake野生型(WT)作為對(duì)照.

為了檢測(cè)OsDHHC13的表達(dá)對(duì)H2O2的響應(yīng)，將野生型Kitaake幼苗水培培養(yǎng)至三葉期，然后用5 mmol/L的H2O2分別處理幼苗1 h, 3 h, 6 h, 9 h, 12 h和24 h，選取水稻幼苗根部用于提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA.采用qRT-PCR鑒定OsDHHC13在H2O2處理的不同時(shí)間點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄水平.另外,提取營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期(20 d的幼苗)和生殖生長(zhǎng)期(抽穗期)野生型的各組織器官的總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA, 然后采用qRT-PCR分析OsDHHC13在水稻不同生長(zhǎng)時(shí)期和不同組織器官中的轉(zhuǎn)錄水平.

為了檢測(cè)轉(zhuǎn)基因株系中與H2O2清除相關(guān)的基因OsCATb，OsSOD1，OsAPX1和OsAPX2的轉(zhuǎn)錄水平[14-17]，將轉(zhuǎn)基因株系和野生型幼苗水培培養(yǎng)至三葉期，然后用5 mmol/L的H2O2處理幼苗12 h，然后提取幼苗總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA.采用qRT-PCR鑒定4個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平(qRT-PCR引物見(jiàn)表1).

表1 定量PCR相關(guān)引物

1.2.4 水稻幼苗的處理及根長(zhǎng)的測(cè)定

挑選OsDHHC13轉(zhuǎn)基因株系及野生型的飽滿種子，用10% NaClO消毒30 min，再用去離子水(ddH2O)漂洗4～5次，然后放置于室溫吸脹處理48 h，接著轉(zhuǎn)移至28 ℃恒溫培養(yǎng)箱催芽48 h.待種子露白后，再轉(zhuǎn)入添加和未添加H2O2(5 mmol/L)的1/2 MS培養(yǎng)液的試管里.種子用棉花作為支撐讓其位于試管上部，置于恒溫培養(yǎng)室(28 ℃，光照16 h/黑暗8 h)培養(yǎng)10 d.然后觀察幼苗表型，并測(cè)量和統(tǒng)計(jì)根長(zhǎng).

1.2.5 水稻根部H2O2含量的測(cè)定

將水培至三葉期的OsDHHC13轉(zhuǎn)基因株系及野生型幼苗用濃度為5 mmol /L H2O2處理5 d，然后用碧云天生物技術(shù)公司的H2O2檢測(cè)試劑盒提取并測(cè)定水稻根部H2O2含量.

2 結(jié) 果

2.1OsDHHC13基因啟動(dòng)子調(diào)控元件分析

通過(guò)相關(guān)網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的sequence viewer工具找到OsDHHC13基因起始密碼子上游1 500 bp的片段，然后把這段核苷酸序列輸入植物專用的啟動(dòng)子分析網(wǎng)站在線分析工具中，對(duì)OsDHHC13基因上游啟動(dòng)子進(jìn)行預(yù)測(cè)分析(如圖1所示).結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OsDHHC13基因啟動(dòng)子存在大量的AE-box，Box 4，G-box和I-box等光響應(yīng)元件，同時(shí)也存在一些與激素相關(guān)的AuxRR-core和P-box等元件.有趣的是，在啟動(dòng)子區(qū)域還發(fā)現(xiàn)了TC-rich repeats和 MBS等與抗旱以及脅迫響應(yīng)密切相關(guān)的元件.該分析結(jié)果表明，OsDHHC13基因可能被光信號(hào)、激素以及其他非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，并且其編碼蛋白有可能參與植物的光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、激素轉(zhuǎn)導(dǎo)以及非生物脅迫響應(yīng).

2.2 OsDHHC13蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

將OsDHHC13的氨基酸全長(zhǎng)序列輸入跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)程序TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM/)，結(jié)果顯示OsDHHC13蛋白可能存在4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(圖2).在跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)結(jié)果中，其跨膜分值越高，則表明該段序列跨膜的可能性越大.在OsDHHC13可能存在的4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域中，3個(gè)分值較高，而另1個(gè)分值則稍低，但是其分值仍大于0.8.因此，該結(jié)果表明，OsDHHC13可能是一個(gè)具有4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的典型膜蛋白.(圖中斷裂雙線表示該段氨基酸序列處于質(zhì)膜的胞外側(cè);斷裂單線表示該段氨基酸序列處于質(zhì)膜的胞質(zhì)側(cè); 連續(xù)線表示該段氨基酸序列為跨膜結(jié)構(gòu)域)

圖1 OsDHHC13啟動(dòng)子元件分析

圖2 OsDHHC13蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域分析

2.3OsDHHC13基因的克隆與轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

通過(guò)NCBI以及TIGR等數(shù)據(jù)庫(kù)查找到OsDHHC13的基因組序列及其CDS序列，利用特異性的克隆引物，從水稻品種日本晴的cDNA中克隆了OsDHHC13的CDS序列(如圖3(a)所示).通過(guò)酶切連接的方式將OsDHHC13連接至終載體pHB.最后轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌浸染水稻愈傷組織，再經(jīng)組織培養(yǎng)及田間栽培后，共收獲8個(gè)獨(dú)立的OsDHHC13過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系的種子.隨后，對(duì)T1代幼苗分別進(jìn)行了DNA與RNA水平的鑒定(如圖3(b)(c)所示).從圖3(b)可以看出，8個(gè)轉(zhuǎn)基因株系均能檢測(cè)到潮霉素抗性基因hpt，說(shuō)明T-DNA已經(jīng)成功整合到轉(zhuǎn)基因株系的基因組中.OsDHHC13的轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，5個(gè)株系中的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于野生型(WT; 圖3(c))，說(shuō)明OsDHHC13已成功過(guò)表達(dá)于轉(zhuǎn)基因株系.隨后我們選取了3個(gè)過(guò)表達(dá)株系：35S::OsDHHC13-9，35S::OsDHHC13-12和35S::OsDHHC13-19的T2代純合子用于后續(xù)的表型鑒定.

(a) OsDHHC13的克隆; (b) 轉(zhuǎn)基因株系DNA水平的PCR鑒定；(c) 轉(zhuǎn)基因株系RNA水平的qRT-PCR鑒定

2.4OsDHHC13基因的時(shí)空表達(dá)分析

基因的時(shí)空表達(dá)模式可為預(yù)測(cè)和研究其生物學(xué)功能提供參考依據(jù).于是，我們采用qRT-PCR方法分析了營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期和生殖生長(zhǎng)期OsDHHC13在水稻不同組織器官中的相對(duì)表達(dá)量(如圖4所示).結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的苗期OsDHHC13在根、莖和葉中均有表達(dá)，尤其在葉片中的表達(dá)量相對(duì)較高，而根中的相對(duì)較低(如圖4(a)所示).在生殖生長(zhǎng)的抽穗期，OsDHHC13在各組織器官中均有表達(dá)，其中葉片中的表達(dá)量最高，根中的表達(dá)量?jī)H次于葉片，而節(jié)間的表達(dá)量最低(如圖4(b)所示).

(a) 幼苗期的組織表達(dá)模式 (b) 抽穗期的組織表達(dá)模式

2.5OsDHHC13轉(zhuǎn)基因株系對(duì)H2O2的響應(yīng)

啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn)，OsDHHC13基因的啟動(dòng)子存在TC-rich repeats和 MBS等與抗旱以及脅迫響應(yīng)密切相關(guān)的元件(如圖1所示), 說(shuō)明該基因可能參與了非生物脅迫響應(yīng).為了驗(yàn)證該假設(shè)，我們用5 mmol/L的H2O2處理剛發(fā)芽的OsDHHC13轉(zhuǎn)基因株系種子10 d，然后觀察表型并統(tǒng)計(jì)根長(zhǎng).結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在正常水培條件(未含H2O2)下轉(zhuǎn)基因株系的根長(zhǎng)與野生型沒(méi)有差別(如圖5(a)(c)所示)，而在H2O2處理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)基因株系的根顯著長(zhǎng)于野生型(如圖5(b)(d)所示).該結(jié)果說(shuō)明，OsDHHC13轉(zhuǎn)基因植株提高了對(duì)H2O2脅迫的抗性，鋅指蛋白OsDHHC13可能正調(diào)控植物的抗氧化脅迫.隨后，我們檢測(cè)了H2O2對(duì)野生型幼苗根部OsDHHC13轉(zhuǎn)錄水平的影響，發(fā)現(xiàn)OsDHHC13的轉(zhuǎn)錄水平隨著H2O2處理時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，在12 h時(shí)達(dá)到最大值，隨后稍有下降(如圖5(e)所示).該結(jié)果說(shuō)明H2O2能夠誘導(dǎo)OsDHHC13基因的表達(dá)，意味著OsDHHC13基因可能參與脅迫條件下水稻根部生長(zhǎng)和發(fā)育的調(diào)控.

(a)正常生長(zhǎng)10 d的幼苗根長(zhǎng); (b) H2O2處理10 d后的幼苗根長(zhǎng); (c) 正常生長(zhǎng)10 d的幼苗根長(zhǎng)統(tǒng)計(jì); (d) H2O2處理10 d后的幼苗根長(zhǎng)統(tǒng)計(jì); (e) 不同H2O2處理時(shí)間對(duì)OsDHHC13轉(zhuǎn)錄水平的影響. 所有H2O2的濃度均為5 mmol/L.

2.6 根部?jī)?nèi)源性H2O2含量變化及相關(guān)基因測(cè)定

為了進(jìn)一步探究在外源性H2O2處理下OsDHHC13基因如何影響水稻幼苗根部生長(zhǎng)與發(fā)育，我們進(jìn)一步對(duì)幼苗根部?jī)?nèi)源性H2O2含量進(jìn)行了測(cè)定.如圖6(a)所示，當(dāng)OsDHHC13轉(zhuǎn)基因株系幼苗經(jīng)5 mmol /L H2O2處理5 d后，其水稻根部H2O2含量比野生型顯著降低，而在未經(jīng)H2O2處理的幼苗根中轉(zhuǎn)基因株系與野生型間沒(méi)有明顯的差別.該結(jié)果說(shuō)明，OsDHHC13可能正調(diào)控氧化脅迫條件下體內(nèi)H2O2的降解，從而解除氧化脅迫對(duì)植株的傷害.

為了進(jìn)一步驗(yàn)證以上推測(cè)，我們檢測(cè)了5 mmol/L H2O2處理12 h的轉(zhuǎn)基因株系幼苗中與H2O2清除相關(guān)的酶基因OsCATB，OsSOD1，OsAPX1和OsAPX2等的轉(zhuǎn)錄水平(如圖6所示).結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在正常條件下OsCATB，OsSOD1，OsAPX1和OsAPX2等4個(gè)酶基因的轉(zhuǎn)錄水平在轉(zhuǎn)基因株系和野生型(WT)間沒(méi)有明顯差異，但是在H2O2處理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)基因株系中4個(gè)酶基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于野生型(如圖6(b)～(e)所示).該結(jié)果表明，在氧化脅迫條件下OsDHHC13確實(shí)能促進(jìn)清除H2O2的相關(guān)酶基因表達(dá)，從而調(diào)節(jié)內(nèi)源性H2O2含量的動(dòng)態(tài)平衡，最終解除H2O2對(duì)根的生長(zhǎng)與發(fā)育的抑制.

(a) 幼苗根部H2O2的含量; (b) OsCATB表達(dá)量檢測(cè)；(c) OsSOD1表達(dá)量檢測(cè)；(d) OsAPX1表達(dá)量檢測(cè)；(e) OsAPX2表達(dá)量檢測(cè)

3 討 論

DHHC蛋白是一類典型的膜蛋白，一般具有多段跨膜結(jié)構(gòu)域，包含了DHHC-CRD結(jié)構(gòu)域.它的主要功能是棕櫚?；湎掠蔚鞍?，從而影響其轉(zhuǎn)運(yùn)與定位，最終調(diào)控植物的各種生理功能[2].通過(guò)生物信息學(xué)的預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，OsDHHC13蛋白具有4段跨膜結(jié)構(gòu)域(如圖1所示)，并且發(fā)現(xiàn)其啟動(dòng)子含有多個(gè)與光調(diào)控、激素和脅迫響應(yīng)相關(guān)的元件(如圖2所示)，為研究該基因與激素、光調(diào)控相關(guān)功能提供了重要線索.

通過(guò)對(duì)基因在植物不同組織器官中的表達(dá)分析，可以對(duì)該基因的功能進(jìn)行預(yù)測(cè)[22].我們對(duì)OsDHHC13在水稻不同時(shí)期和不同組織器官的表達(dá)特異性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)OsDHHC13主要在水稻葉片、根以及莖表達(dá)(如圖4所示)，暗示該基因可能參與水稻根、莖和葉的生長(zhǎng)與發(fā)育調(diào)控.隨后，通過(guò)H2O2處理發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系的根要顯著長(zhǎng)于野生型，相反正常條件下的根長(zhǎng)則沒(méi)有明顯變化，說(shuō)明該基因參與逆境下根的生長(zhǎng)與發(fā)育調(diào)控.同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系與野生型間在葉片形態(tài)及株高等方面沒(méi)有明顯變化(結(jié)果未列出)，因此OsDHHC13在葉和莖中的功能還有待進(jìn)一步研究.

ROS的穩(wěn)態(tài)在植物中發(fā)揮重要功能[13].H2O2是最主要的一種ROS，在植物中參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物的生長(zhǎng)發(fā)育以及非生物脅迫響應(yīng)的作用[22-23].H2O2在植物抗病反應(yīng)中的作用已經(jīng)得到了廣泛的研究, 而在非生物脅迫條件下,同樣扮演了關(guān)鍵的調(diào)控作用, 參與多種生理生化過(guò)程, 包括光合作用、光呼吸、氣孔運(yùn)動(dòng)與細(xì)胞程序性死亡等.前人已有活性氧代謝以及H2O2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面的綜述報(bào)道[24].Ivanchenko等[17]發(fā)現(xiàn)H2O2積累能夠抑制西紅柿根部的生長(zhǎng)與發(fā)育，但具體機(jī)制尚不清楚.本研究通過(guò)H2O2處理野生型與轉(zhuǎn)基因幼苗，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系根顯著長(zhǎng)于野生型(如圖5所示).通過(guò)測(cè)定根部H2O2含量以及與H2O2清除相關(guān)的酶基因表達(dá)分析，過(guò)表達(dá)株系H2O2含量以及相關(guān)基因表達(dá)量顯著高于野生型(如圖6所示).這些結(jié)果說(shuō)明，在氧化脅迫等逆境下OsDHHC13確實(shí)能促進(jìn)清除H2O2的相關(guān)酶基因表達(dá)，從而解除H2O2對(duì)根的生長(zhǎng)與發(fā)育的抑制.至于作為鋅指蛋白的OsDHHC13如何棕櫚?；湎掠蔚鞍?，最終如何調(diào)控水稻根部H2O2的動(dòng)態(tài)平衡的分子機(jī)制尚且未知，還有待進(jìn)一步研究.

綜上所述，本研究初步發(fā)現(xiàn)，水稻鋅指蛋白基因OsDHHC13能促進(jìn)清除H2O2的相關(guān)酶基因表達(dá)，調(diào)節(jié)內(nèi)源性H2O2的動(dòng)態(tài)平衡，從而正調(diào)控水稻的抗氧化脅迫能力.

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Preliminary Study on a RiceOsDHHC13 Gene Involving in the Response to Oxidative Stress

LIU Xuan-ming1?, WANG Wen-Wen1, YANG Yuan-zhu2, XIA Miao-lin1, LI Xia1, ZUO Dong-liang1, LIN Jian-zhong1?

(1. Hunan Province Key Laboratory of Plant Function Genomics and Developmental Regulation, College of Biology, Hunan Univ, Changsha, Hunan 410082, China; 2. Academy of Seed Industry of Hunan Yahua, Changsha, Hunan 410001, China)

DHHC-type zinc finger proteins are involved in the palmitoylated modification of intracellular proteins and play important roles in the growth and development of cells and individuals.OsDHHC13 is a typical DHHC-type zinc finger gene. Bioinformatics analysis showed that theOsDHHC13 promoter region contains some stress and light response elements, and its encoded protein is a typical membrane protein with four transmembrane domains. When theOsDHHC13 overexpressing lines were suffered from oxidative stress with H2O2, the roots of overexpressing seedlings were significantly longer than those of wild-type, indicating thatOsDHHC13 can remove the inhibition of root growth by H2O2and improve the ability of resistance to oxidative stress. Subsequently, analysis of H2O2contents found that the H2O2contents in the roots of overexpressing seedlings were markedly lower than that in wild type. qRT-PCR analysis further revealed that the transcriptional levels of enzyme genes related to H2O2elimination increased significantly, suggesting thatOsDHHC13 can promote the expression of enzyme genes related to H2O2elimination and regulate the homeostasis of endogenous H2O2in plants. In a whole, present study preliminarily proved that the zinc finger protein geneOsDHHC13 positively regulates the ability of resistance to oxidative stress.

OsDHHC13 gene；H2O2content；root length；zinc finger protein

1674-2974(2016)12-0110-08

2016-03-21 基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31170172, 31571635), National Natural Science Foundation of China(31170172, 31571635); 湖南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目( 12JJ3024)；湖南省生物發(fā)育工程與新產(chǎn)品研發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目( 20134486)；湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目( 2012FJ4262，2014WK2005) 作者簡(jiǎn)介：劉選明(1963-)，男，湖南邵陽(yáng)人，湖南大學(xué)教授,博士生導(dǎo)師 ?通訊聯(lián)系人，E-mail:sw_xml@hnu.edu.cn; jianzhlin@163.com

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