超快速液相色譜法同時(shí)測(cè)定車(chē)前子中京尼平苷酸和毛蕊花糖苷的含量

關(guān) 皎 ， 朱鶴云 ， 馮 春 ， 張 穎 ， 郝乘儀 ， 馮 波

(吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院 ， 吉林吉林132013)

超快速液相色譜法同時(shí)測(cè)定車(chē)前子中京尼平苷酸和毛蕊花糖苷的含量

關(guān) 皎 ， 朱鶴云 ， 馮 春 ， 張 穎 ， 郝乘儀 ， 馮 波

(吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院 ， 吉林吉林132013)

建立超快速液相色譜法同時(shí)測(cè)定車(chē)前子中京尼平苷酸和毛蕊花糖苷的含量， 為車(chē)前子藥材的質(zhì)量控制提供參考。 采用Shim-Pack XR-ODS柱(75 mm×3.0 mm, 2.2 μm)；流動(dòng)相為0.1%甲酸水(A)-甲醇(B)， 梯度洗脫(0～11 min， 20%～65%B)， 平衡時(shí)間為3 min； 流速為0.4 mL/min； 檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm； 柱溫為35℃。 結(jié)果： 京尼平苷酸和毛蕊花糖苷分別在16-160 μg/mL(R=0.9996)、 8-80 μg/mL(R=0.9995)濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系； 平均回收率(n=9)分別為99.0%和99.4%。 結(jié)論：該方法結(jié)果準(zhǔn)確、 操作簡(jiǎn)便、 具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性， 可用于車(chē)前子藥材的質(zhì)量控制， 同時(shí)為新獸藥開(kāi)發(fā)利用提供參考。

車(chē)前子 ； 京尼平苷酸 ； 毛蕊花糖苷 ； 超快速液相色譜法

車(chē)前子為車(chē)前科植物車(chē)前(L.Plantagoasiatica)或平車(chē)前(PlantagodepressaWilld).的干燥成熟種子。性寒、味甘、歸腎、膀胱、肝、肺經(jīng)，具有利水通淋、滲濕止瀉、清肝明目、清熱化痰的功效[1]。主要分布于江西、黑龍江、遼寧、河北等省。車(chē)前子主要含有環(huán)烯醚萜類(lèi)、苯乙醇苷類(lèi)、黃酮類(lèi)、多糖等化合物[2-3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，車(chē)前子具有利尿、降血脂、降血糖、祛痰、鎮(zhèn)咳、抗炎、明目、抗腫瘤等藥理作用[4-5]。目前，文獻(xiàn)報(bào)道的車(chē)前子質(zhì)量控制方法包括紫外法[6]、薄層色譜法[7-8]和高效液相色譜法[9]。然而，這些方法存在專(zhuān)屬性差、分析時(shí)間長(zhǎng)、檢測(cè)指標(biāo)少、樣品處理復(fù)雜等缺點(diǎn)。近年來(lái)，超快速液相色譜(Ultra-fast liquid chromatography, UFLC)技術(shù)由于在峰容量、分析效率、靈敏度和分辨率方面均優(yōu)于常規(guī) HPLC，并可在極短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到柱平衡或重新平衡，顯著減少分析時(shí)間，同時(shí)相應(yīng)會(huì)減少溶劑消耗，已越來(lái)越多的應(yīng)用于中藥成分分析研究[10-11]。本研究首次采用超快速液相色譜法測(cè)定車(chē)前子中京尼平苷酸和毛蕊花糖苷的含量，所建立的定量分析方法分析時(shí)間短，分析效率明顯提高，可為車(chē)前子的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)，有利于將車(chē)前子的藥用價(jià)值充分應(yīng)用于獸藥行業(yè)，為天然藥物應(yīng)用于獸藥領(lǐng)域提供參考。

1 儀器與試藥

Prominence UFLC型超高快速液相色譜儀(配備Prominence SIL-20AHT自動(dòng)進(jìn)樣器，LC-20AD二元泵，CTO-20A柱溫箱，SPD-20A紫外檢測(cè)器，LC solution色譜工作站，日本島津公司)；KQ-250DE型數(shù)控聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；CPA 225D型電子天平(德國(guó)賽多利斯儀器有限公司)。

甲醇為色譜純(美國(guó)Fisher科技)，所用水為經(jīng)過(guò)Milli-Q型超純水儀凈化后的超純水，其他試劑均為分析純。對(duì)照品京尼平苷酸(批號(hào)：110753-201415)和毛蕊花糖苷(批號(hào)：111530-201512)，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度均大于98%。

車(chē)前子藥材，分別購(gòu)自吉林市吉林大藥房和吉林市同仁堂大藥房，產(chǎn)地均為江西省，經(jīng)吉林醫(yī)藥學(xué)院生藥教研室李景華副教授鑒定為車(chē)前科植物，樣本留存于吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院中藥樣品室。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的配制 分別精密稱(chēng)取對(duì)照品京尼平苷酸、毛蕊花糖苷對(duì)照品適量，置于5 mL容量瓶中，用60%甲醇稀釋并定容至刻度，制成含京尼平苷酸0.8 mg/mL、毛蕊花糖苷0.4 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備 取車(chē)前子藥材粉末(過(guò)40目篩)約0.5 g，精密稱(chēng)定，置50 mL錐形瓶中，加入60%甲醇50 mL，稱(chēng)定重量，回流提取2 h，放冷后再稱(chēng)重，用60%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)。取續(xù)濾液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后作為供試品溶液。

2.3 色譜條件 采用Shim-Pack XR-ODS色譜柱(75mm×3.0 mm, i.d. 2.2 μm)，預(yù)柱為C18保護(hù)柱(4 mm×3.0 mm, i.d. 2.2 μm)，流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液(A)-甲醇(B)，梯度洗脫(0～11 min，20%～65%B，11～14 min，65%～20%B)，平衡時(shí)間3 min，流速0.4 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量5 μL。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，置于5 mL量瓶中，用甲醇-水(60∶40)定容至刻度，依次注入液相色譜儀，測(cè)定色譜峰面積，以進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo)，色譜峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，京尼平苷酸、毛蕊花糖苷的回歸方程分別為：

圖1 混合對(duì)照品(A)、樣品(B)色譜圖

1：京尼平苷酸(geniposidic acid)； 2：毛蕊花糖苷(acteoside)

Y= 2.000×106X+ 1.00636×105R= 0.9996;Y= 2.000×106X+ 3.370×104R = 0.9995

結(jié)果表明，京尼平苷酸、毛蕊花糖苷濃度分別在16-160 μg/mL、8-80 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取“2.4”項(xiàng)下制備的第3混合對(duì)照品溶液5 μL， 按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果京尼平苷酸、毛蕊花糖苷峰面積的RSD(n=6)分別為1.5%和0.8%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批次的供試品溶液，放置于室溫，分別于0，2，4，8，12，24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果京尼平苷酸、毛蕊花糖苷峰面積的RSD分別為2.5%，1.3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批車(chē)前子樣品6份，精密稱(chēng)定，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣5 μL，計(jì)算京尼平苷酸、毛蕊花糖苷的含量，結(jié)果上述2種成分的含量的平均值(n=6)分別為1.96%和0.99%；RSD分別為1.5%和0.9%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知含量(京尼平苷酸和毛蕊花糖苷含量分別為1.97%和0.99%)的車(chē)前子樣品粉末9份，每份0.25g，精密稱(chēng)定，分別加入相當(dāng)于樣品中京尼平苷酸和毛蕊花糖苷含量的80%，100%，120%的對(duì)照品溶液適量，各3份。按“2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，進(jìn)樣5 μL測(cè)定，計(jì)算京尼平苷酸和毛蕊花糖苷的回收率和RSD，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 車(chē)前子樣品中京尼平苷酸和毛蕊花糖苷的回收率

2.9 樣品含量測(cè)定 精密稱(chēng)取6批車(chē)前子樣品粉末(1-3批購(gòu)自吉林市吉林大藥房，生車(chē)前子，4-6批購(gòu)自吉林市同仁堂大藥房，鹽車(chē)前子)，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣5 μL，每個(gè)溶液進(jìn)樣3次，計(jì)算京尼平苷酸、毛蕊花糖苷的含量。6批樣品測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 車(chē)前子樣品中京尼平苷酸、毛蕊花糖苷的含量 (%，n =6)

3 討論

3.1 流動(dòng)相的優(yōu)化 分別考察了的甲醇-0.5%醋酸、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.5%醋酸、乙腈-0.1% 甲酸共4種流動(dòng)相體系，結(jié)果表明，甲醇-0.1% 甲酸作為流動(dòng)相時(shí)能夠獲得較好的分離效果，分析時(shí)間為10 min，與文獻(xiàn)[12-14]中采用常規(guī)HPLC相比分析時(shí)間明顯縮短，且藥材中其他色譜峰不干擾樣品的測(cè)定。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 采用二極管陣列檢測(cè)器(DAD)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示，京尼平苷酸在235 nm，485 nm，693 nm處有最大吸收波長(zhǎng)，毛蕊花糖苷在274 nm，334 nm處有最大吸收。綜合考慮雜峰影響，基線(xiàn)平穩(wěn)，色譜峰峰形，最大吸收等因素，本試驗(yàn)選擇254 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 提取方法及提取溶劑的選擇 本試驗(yàn)對(duì)比了回流法和超聲法提取車(chē)前子中京尼平苷酸、毛蕊花糖苷的提取效果。結(jié)果表明，回流提取2 h所得供試品中上述兩種活性成分的含量明顯高于超聲提取法。本試驗(yàn)對(duì)比了60%、80%、100%乙醇溶液和60%、80%、100%甲醇溶液對(duì)車(chē)前子中2種活性成分的提取效率，結(jié)果顯示，60%甲醇的綜合提取效率最高，故本試驗(yàn)采用60%甲醇作為提取溶劑。

3.4 本研究建立UFLC法同時(shí)測(cè)定車(chē)前子中京尼平苷酸、毛蕊花糖苷的含量，并應(yīng)用該方法測(cè)定了6批河北產(chǎn)車(chē)前子中2種活性成分的含量。購(gòu)自吉林大藥房的3批車(chē)前子和購(gòu)自吉林市同仁堂大藥房的3批車(chē)前子均符合藥典要求(藥典規(guī)定車(chē)前子中京尼平苷酸含量不低于0.50%，毛蕊花糖苷含量不低于0.40%；鹽車(chē)前子中京尼平苷酸含量不低于 0.40%，毛蕊花糖苷含量不低于0.30%)。但炮制后車(chē)前子中2種活性成分含量明顯升高，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[15]，由此可見(jiàn)車(chē)前子經(jīng)鹽制入藥有一定的科學(xué)性。本研究建立的分析方法簡(jiǎn)單、快速、可靠，可用于車(chē)前子藥材的質(zhì)量控制。

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Simultaneous determination of geniposidic acid and acteoside inPlantaginisSemenby UFLC

GUAN Jiao , ZHU He-yun , FENG Chun , ZHANG Ying , HAO Cheng-yi , FENG Bo

(College of Pharmacy , Jilin Medical University , Jilin 132013 , China)

To establish an ultra-fast liquid chromatography (UFLC) method for the determination of geniposidic acid and acteoside inPlantaginisSemen. Chromatographic separation was performed on Shim-Pack XR-ODS column(75 mm×3.0 mm, 2.2 μm); The mobile phase was 0.1% formic acid (A)-acetonitrile (B) with gradient elution(0～11 min， 20%～65%B)at a flow rate of 0.4 mL·min-1and the equilibration time was 3 min; The detecting wavelength was set at 254 nm and column temperature was maintained at 35 °C. The linear ranges were 16-160 μg·mL-1(r=0.9996) for geniposidic acid and 8.0-80 μg·mL-1(r=0.9995) for acteoside; The average recovery (n=9) of geniposidic acid and acteoside were 99.0% and 99.4%. The developed method is simple, and accurate with high repeatability and stability, which is suitable for the quality control ofPlantaginisSemenand can provide references for the development and utilization of new veterinary drugs.

PlantaginisSemen; Geniposidic acid; Acteoside; UFLC

FENG Bo

2016-07-07

吉林省衛(wèi)生廳科研課題(2013Z008)；吉林省科技廳科研課題(200905113)

關(guān)皎(1983-)，女，講師，博士，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量控制及藥代動(dòng)力學(xué)，E-mail: rainbowguanjiao@sina.com

馮波, E-mail：fengbo2@sina.com

R 917

A

0529-6005(2016)00-0104-03