水貂源乳酸菌的分離鑒定及其抑菌性研究

任謂明 ， 孫 銘 ， 林志軍 ， 趙 丹

(1． 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部參茸產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心吉林長春130118 ； 2.通化師范學(xué)院分院養(yǎng)殖教研室吉林通化134001 ； 3.吉林特研生物技術(shù)有限責(zé)任公司 吉林長春130118)

水貂源乳酸菌的分離鑒定及其抑菌性研究

任謂明1， 孫 銘2， 林志軍3， 趙 丹1

(1． 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部參茸產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心吉林長春130118 ； 2.通化師范學(xué)院分院養(yǎng)殖教研室吉林通化134001 ； 3.吉林特研生物技術(shù)有限責(zé)任公司 吉林長春130118)

通過革蘭染色、 菌落形態(tài)觀察、 生化分析鑒定、 牛津杯抑菌試驗(yàn)對分離到的1株乳酸菌進(jìn)行研究。 結(jié)果顯示， 經(jīng)16S rDNA序列測定,比對分析該株乳酸菌與鼠李糖乳桿菌、 乳酸乳球菌乳亞種、 唾液乳桿菌、 乳鏈球菌、 哥倫比亞腸球菌和鼠乳桿菌高度同源。 乳酸菌抑菌試驗(yàn)檢測顯示， 對大腸桿菌、 沙門菌、 蠟樣芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌具有很強(qiáng)的抑菌效應(yīng)。 同時(shí)該株乳酸菌對水貂腸道上皮細(xì)胞有一定的粘附能力。 結(jié)果表明， 該株乳酸菌株產(chǎn)生菌能夠粘附于水貂腸道上皮細(xì)胞上并具有較強(qiáng)的抑菌活性。

水貂 ； 乳酸菌 ； 抑菌性 ； 粘附性

乳酸菌是指發(fā)酵糖類主要產(chǎn)物為乳酸的一類革蘭陽性菌，不產(chǎn)生芽孢，過氧化氫酶陰性細(xì)菌的總稱。乳酸菌是益生菌的重要組成部分，擔(dān)負(fù)著機(jī)體多種重要的生理功能，并在腸道內(nèi)發(fā)揮益生功能，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力和抵抗力，促進(jìn)腸道的生長和發(fā)育，是廣泛應(yīng)用的益生菌之一。大多數(shù)乳酸菌對外界環(huán)境耐受能力差，而作為有效的微生態(tài)制劑必須能夠有較強(qiáng)的定植于肌體腸道內(nèi)才能發(fā)揮其生物學(xué)功能。據(jù)報(bào)道，細(xì)菌的粘附性和細(xì)菌表面物理化學(xué)特性之間沒有直接的相關(guān)性，而與細(xì)菌表面凝集素和粘附黏液的性質(zhì)有一定的相關(guān)性。乳酸菌粘附不同宿主小腸黏液的差異很大，可能是由于不同物種黏液中細(xì)菌凝集素受體的分布不同。同種乳酸菌向不同宿主小腸黏液的粘附具有差異性，說明粘附素的表達(dá)具有物種特異性。乳酸菌在腸道內(nèi)的數(shù)量較多，可以分解碳水化合物，產(chǎn)生多種有機(jī)酸，因而可提高機(jī)體的消化機(jī)能，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。本試驗(yàn)的目的就是要篩選適用于水貂生產(chǎn)、具有抗逆性和抑菌特性的水貂源乳酸菌株，研究其生物學(xué)特性及抑菌活性，為益生素類制劑的制備提供優(yōu)良菌種[1-2]。

1 材料與方法

1.1 樣品來源與處理 試驗(yàn)用水貂(約7月齡)，購自吉林市左家鎮(zhèn)某水貂養(yǎng)殖廠，剖殺后取其腸段并用無菌雙蒸水沖洗干凈。用無菌刀片輕輕刮取腸道上壁的附著物置于無菌離心管中，迅速置于4℃冰箱備用。

1.3 指示菌菌株 大腸桿菌、沙門菌和金黃色葡萄球菌由本研究室提供。

1.4 主要試劑 革蘭染色試劑：草酸銨結(jié)晶紫染色液、盧氏碘液、番紅復(fù)染液均為自己配制；DNA提取試劑盒，購自TaKaRa公司；溶菌酶，購自Sigama公司；生化發(fā)酵試管和葡葡糖、鼠李糖、纖維二糖、果糖、乳糖、半乳糖、木糖、棉籽糖、麥芽糖、蔗糖、山梨糖、淀粉、血清菊糖、蕈糖發(fā)酵微量鑒定生化管，購自杭州天和微生物試劑有限公司；30%過氧化氫，購自西隴化工股份有限公司；16S rDNA通用引物，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)所用試劑：胎牛血清、MEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胰蛋白酶等，購自長春沃特思生物有限公司。

1.5 主要儀器 PCR儀：BIO-RAD T100；凝膠成像系統(tǒng)：以色列DNR生物成像系統(tǒng)。

1.6 乳酸菌初篩 將處理好的樣品用無菌雙蒸水依次按101、102、103、104倍梯度稀釋分別涂布于MRS固體平板上,37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，挑取不同形態(tài)的菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，革蘭染色，顯微鏡檢，選擇無芽孢的革蘭陽性菌[3]。

1.7 16S rDNA鑒定 對初篩所得的菌株進(jìn)行純化培養(yǎng)后，提取細(xì)菌基因組DNA，采用細(xì)菌16S rDNA通用引物(上游引物P1：5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’；下游引物P2：5’-TAGGGTTACCTTGTTACGAC- TT-3’),以基因組DNA為模板，進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(25 μL)：2×premix Buffer 12.5μL，P1、P2各1μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL。

PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 5min、95 ℃ 30s、55 ℃ 30s、72 ℃ 1.5min，35個(gè)循環(huán)，72℃ 10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，片段長度正確的PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。從GenBank中獲取與之有同源性的菌株序列，采用MEGA軟件進(jìn)行分析。[4]

1.8 乳酸菌生化試驗(yàn)鑒定 對分離的菌株進(jìn)行常規(guī)生化鑒定，包括過氧化氫酶試驗(yàn)、精氨酸產(chǎn)氨試驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣試驗(yàn)、七葉苷水解試驗(yàn)、石蕊牛奶試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、乙酰甲基甲醇試驗(yàn)、H2S產(chǎn)生試驗(yàn)、精氨酸水解試驗(yàn)和葡聚糖產(chǎn)生試驗(yàn)。[5]

1.2.1 常規(guī)針灸治療方式 主治醫(yī)師需要選擇患者的肩骼穴位、支溝穴位、肩貞穴位、手五里穴位、手三里穴位、肩井穴位為常規(guī)針灸治療的穴位，并以每天一次的頻率為患者進(jìn)行針灸治療，共計(jì)治療四周[1-3]。

1.9 菌株糖發(fā)酵鑒定 取生化管于距離內(nèi)容物上方，用砂條割開，迅速于酒精燈火焰消毒，然后用接種針分別挑取少量分離菌株的培養(yǎng)物接種于各種糖發(fā)酵微量鑒定生化管中，37℃培養(yǎng)24 h[6]。

1.10 抑菌試驗(yàn)

1.10.1 乳酸菌發(fā)酵上清液抑菌試驗(yàn) 以105CFU/mL大腸桿菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌為指示菌株，采用牛津杯法測定抑菌圈的大小。

1.10.2 乳酸排除試驗(yàn) 將培養(yǎng)24 h的乳酸菌發(fā)酵液離心后取上清，用乳酸調(diào)節(jié)至pH值5.0后，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，指示菌株為大腸桿菌，采用牛津杯法測定抑菌圈大小[7]。

1.10.3 過氧化氫排除試驗(yàn) 培養(yǎng)液上清按10g/L的量加入過氧化氫酶，37 ℃溫育1 h后進(jìn)行試驗(yàn)，以未加酶的乳酸菌發(fā)酵上清液作為對照，指示菌株為大腸桿菌，采用牛津杯法測定抑菌圈大小[8]。

1.11 乳酸菌粘附試驗(yàn) 無菌操作，取水貂小腸黏膜，制成腸上皮細(xì)胞懸液。用細(xì)胞計(jì)數(shù)器調(diào)整至濃度為50萬個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，每50 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中分裝5 mL，37 ℃培養(yǎng)24 h。將菌液，經(jīng)4 000 r/min離心20 min，棄上清。菌泥用PBS洗3次，用營養(yǎng)液配制成濃度為106個(gè)/mL的菌液。取該菌液1 mL。加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)2 h，其間振搖3次。將細(xì)胞一細(xì)菌混合培養(yǎng)液，進(jìn)行500 r/min離心5 min．棄上清。沉淀用PBS洗6遍。取沉淀涂片，革蘭染色，鏡檢[9-10]。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)特征 利用涂板劃線分離技術(shù)，挑取菌落形態(tài)、顏色均不相同的細(xì)菌，經(jīng)過連續(xù)分離純化最終獲得1株乳酸菌并命名為ZJ株。經(jīng)革蘭染色鑒定，該株乳酸菌為革蘭陽性菌，單個(gè)菌體呈桿狀，菌落形態(tài)濕潤，有光澤，光滑，邊緣整齊。

2.2 16S rDNA序列分析 將初篩到的乳酸菌擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取基因組后，擴(kuò)增細(xì)菌的16S rDNA保守序列，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)該菌株的保守序列約為1 500 bp。如圖1。

圖1 來源于水貂腸道乳酸菌株的16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物

1:ZJ株16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物； M:為DL-2 000 DNA Marker

2.3 菌株16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析 將擴(kuò)增得到的乳酸菌株的16S rDNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的的數(shù)據(jù)進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，ZJ株與鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)的16S rDNA的相似性達(dá)98%；與乳酸乳球菌乳亞種(Lactococcuslactissubsp.Lactis)的16S rDNA相似性達(dá)99%；與唾液乳桿菌(Lactobacillussalicarius)的16S rDNA相似性達(dá)99%；ZJ株與乳酸鏈球菌(Streptococcuslactis)16S rDNA相似性達(dá)99%；與哥倫比亞腸球菌(Enterococcuscolumbae)的16S rDNA相似性達(dá)98%；與鼠乳桿菌(Lactobacillusmurinus)的16S rDNA相似性達(dá)98%。

2.4 乳酸菌的生理生化特性 分離的革蘭陽性菌的過氧化氫酶接觸反應(yīng)試驗(yàn)、產(chǎn)H2S試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)和產(chǎn)氣試驗(yàn)均為陰性，且表現(xiàn)為無運(yùn)動(dòng)性。石蕊牛奶試驗(yàn)、產(chǎn)酸試驗(yàn)、葡聚糖產(chǎn)生試驗(yàn)、精氨酸水解試驗(yàn)和V-P試驗(yàn)結(jié)果顯示菌株為陽性。

2.5 乳酸菌的糖發(fā)酵鑒定 由糖發(fā)酵鑒定結(jié)果可知，乳酸菌ZJ株能夠發(fā)酵葡萄糖、鼠李糖、纖維二糖、果糖、半乳糖、木糖、麥芽糖、蔗糖、山梨糖、淀粉、血清菊糖和蕈糖，不能發(fā)酵棉籽糖，見表1。

表1 乳酸菌發(fā)酵試驗(yàn)

+：陽性，-：陰性

2.6 乳酸菌產(chǎn)生的抑菌效果的本質(zhì) ZJ株乳酸菌培養(yǎng)物上清抑菌效果見表3。由表3可知，該乳酸菌對指示菌株顯示了抗菌活性，該株乳酸菌對大腸桿菌的抑菌能力相對較弱，對沙門菌和金黃色葡萄球菌顯示了較強(qiáng)的抑菌活性。

表3 乳酸菌上清抑菌活性

在乳酸排除試驗(yàn)中試驗(yàn)組的抑菌圈直徑要明顯大于對照組，說明在ZJ株乳酸菌上清液中，其抑菌作用的成分為有機(jī)酸或者依賴有機(jī)酸發(fā)揮作用的其他物質(zhì)，乳酸可能起了主要作用。用過氧化氫酶處理的試驗(yàn)組的抑菌圈直徑與對照組的結(jié)果差別不大認(rèn)為沒有影響，見表4。

表4 不同處理對乳酸菌上清液抑菌活性的影響

2.7 乳酸菌粘附細(xì)胞的試驗(yàn) 乳酸菌粘附水貂腸道上皮細(xì)胞的結(jié)果見圖2。由圖2可知，ZJ株乳酸菌對水貂腸道上皮細(xì)胞有一定的粘附能力。

圖2 ZJ株粘附水貂腸道上皮細(xì)胞

3 討論

隨著水貂價(jià)格的增長,人們在高利潤的驅(qū)使下,養(yǎng)殖量和養(yǎng)殖密度不斷增加,導(dǎo)致疾病不斷發(fā)生。本研究從水貂本身出發(fā)，研究水貂腸道中的益生菌，使水貂健康水平得到提高，從而提高水貂的抗病性。本研究從水貂腸道環(huán)境中分離得到1株乳酸菌株ZJ株，并對其生理生化特性進(jìn)行研究，希望能夠獲得特征優(yōu)良、能夠作為水貂專用腸道益生菌株的乳酸菌株。

乳酸菌作為一種有效的益生菌，在畜牧生產(chǎn)中應(yīng)用較廣，因此分離鑒定出具有獨(dú)特優(yōu)勢的乳酸菌極其重要。在應(yīng)用研究中，表型特征測定一直是鑒定乳酸菌的重要依據(jù)，包括形態(tài)學(xué)和生理學(xué)特征的鑒定，主要依據(jù)為細(xì)菌的菌落特征、菌體形態(tài)、生理生化特性和代謝產(chǎn)物等。但傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定方法試驗(yàn)周期長，工作量大且較為依賴于主觀判斷。近年來，16S rDNA序列分析比對直接從核酸水平鑒定乳酸菌的方法，能更準(zhǔn)確的鑒定分離菌的性質(zhì)。通過16S rDNA技術(shù)，對分離到的乳酸菌ZJ株進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，乳酸菌ZJ株保守序列約為1 500 bp；同時(shí)運(yùn)用理化試驗(yàn)和糖發(fā)酵試驗(yàn)研究其特性；乳酸菌ZJ株能夠發(fā)酵葡萄糖、鼠李糖等多種糖類，不能發(fā)酵棉籽糖。研究表明，乳酸菌ZJ株其基因的保守序列與多種優(yōu)良乳酸菌株都有極高的同源性；且能發(fā)酵多種糖類，滿足了益生菌株對生理生化方面特性的需要。

乳酸菌作為天然抗生素具有在機(jī)體內(nèi)不殘留、不產(chǎn)生耐藥和抗藥性，同時(shí)還可以抑制胃腸道內(nèi)有害微生物的生長，保護(hù)機(jī)體的微生態(tài)平衡的特點(diǎn)。國內(nèi)外有很多研究人員對乳酸菌的抑菌活性進(jìn)行了研究。能夠影響乳酸菌抑菌活性的因素主要包括兩個(gè)方面：一是乳酸菌所分泌的抑菌物質(zhì)的抑菌作用；另一方面是乳酸菌本身在環(huán)境中的定植作用。在本研究中分別對分離到的乳酸菌ZJ株進(jìn)行了這兩方面的試驗(yàn)。結(jié)果表明，乳酸菌ZJ株具有一定的抑菌性和對腸道細(xì)胞的粘附性，適合作為水貂腸道益生菌的備選菌株。

綜上，乳酸菌ZJ株的生理生化特性及粘附性等多方面因素都滿足了成為益生菌備選菌株的條件。但其相關(guān)機(jī)理仍需進(jìn)一步研究。

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2016-03-16

吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)科研啟動(dòng)基金(201334)

任謂明(1983-)，男，助理研究員，碩士，從事微生物與生物技術(shù)研究工作，E-mail：469577286@qq.com

趙丹，E-mail：469577286@qq.com

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0529-6005(2016)11-0046-03