Ghrelin在馴鹿胃腸道的表達(dá)及定位檢測

唐 娟 ， 張 曼 ， 金 鑫 ， 劉 驕 ， 田巧珍 ， 王云鶴 ， 楊銀鳳

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所， 內(nèi)蒙古呼和浩特 010031； 2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院， 內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

Ghrelin在馴鹿胃腸道的表達(dá)及定位檢測

唐 娟1， 張 曼2， 金 鑫2， 劉 驕2， 田巧珍2， 王云鶴2， 楊銀鳳2

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所， 內(nèi)蒙古呼和浩特 010031； 2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院， 內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)和免疫組織化學(xué)技術(shù)對Ghrelin在馴鹿胃腸道的表達(dá)及定位進(jìn)行初步研究。 RT-qPCR結(jié)果顯示，Ghrelin在馴鹿胃腸道內(nèi)均有表達(dá)， 且在皺胃內(nèi)表達(dá)量極顯著高于其他組織(P<0.01)， 其次是十二指腸、 回腸和結(jié)腸； 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示， Ghrelin免疫陽性細(xì)胞在皺胃內(nèi)主要分布于黏膜層、 黏膜下層和肌層； 在瘤胃、 網(wǎng)胃、 瓣胃的黏膜層、 黏膜下層中也可見Ghrelin的免疫陽性細(xì)胞， 但肌層中未見表達(dá)； 在十二指腸、 空腸、 回腸、 結(jié)腸的黏膜層、 黏膜下層和肌層均有Ghrelin免疫陽性細(xì)胞分布， 且在腸絨毛和黏膜下層分布較多。 RT-qPCR和免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，Ghrelin在胃腸道內(nèi)表達(dá)量及分布范圍基本一致， 這表明Ghrelin對馴鹿的消化可能具有潛在的調(diào)控作用。

Ghrelin； 馴鹿； 實(shí)時(shí)熒光定量PCR； 免疫組織化學(xué)

Ghrelin最早是由日本學(xué)者Kojima等[1]在人和鼠的胃中分離出來的一種含有28個(gè)氨基酸殘基的多肽，是生長激素促分泌素受體1a(growth hormone secretagogue receptor 1a，GHS-R1a)的一個(gè)內(nèi)源性配體。據(jù)報(bào)道，這28個(gè)氨基酸序列在魚類、鳥類、爬行動(dòng)物、兩棲動(dòng)物和哺乳動(dòng)物體內(nèi)顯著保守[2]。研究發(fā)現(xiàn)，Ghrelin免疫陽性細(xì)胞分布于嚙齒類動(dòng)物胃腸道的各個(gè)部位。其中在胃黏膜層中分布最密集；在腸隱窩和絨毛的上皮細(xì)胞分布較多，并隨著消化管向后延伸數(shù)量大幅度減少[3]。Hayashida等[4]用免疫組織化學(xué)方法發(fā)現(xiàn)Ghrelin密集分布于牛、綿羊、豬、馬和大鼠胃腺的頸部至底部，特別在豬的賁門和幽門區(qū)分布較多。而關(guān)于Ghrelin在馴鹿這種野生動(dòng)物身上的研究報(bào)道很少，目前相關(guān)的究研僅局限于馴鹿生長素Ghrelin全長cDNA的克隆及序列分析[5]。因此，本試驗(yàn)采用RT-qPCR和免疫組織化學(xué)等方法對馴鹿胃腸道內(nèi)Ghrelin的相對表達(dá)量及細(xì)胞定位進(jìn)行了研究，以探索Ghrelin對馴鹿胃腸道消化的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品制備 成年雄性馴鹿由內(nèi)蒙古大興安嶺北敖魯古雅民族自治鄉(xiāng)提供。馴鹿屠宰后立即刮取瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃、皺胃、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸等組織黏膜，并切取適量組織塊用生理鹽水清洗后放入4%多聚甲醛固定液中4 ℃固定24 h。

1.2 相對定量

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)本課題組呈送到GenBank中的馴鹿Ghrelin部分mRNA序列和跨內(nèi)含子引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)一對特異性PCR引物P1、P2。另外根據(jù)馴鹿18S rRNA序列設(shè)計(jì)另外一對PCR引物P3、P4。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

上游引物(Primer1)序列為: 5′-AACGCCCCCTTTGACATTGG-3′；

下游引物(Primer2)序列為：5′-TGAGGGTGGGGAACGGACAG -3′；

上游引物(Primer3)序列為：5′-CCCGGAGAAGGAGCCTGAGAAAC-3′；

下游引物(Primer4)序列為：5′-TGATGCCCCCGACTGTCCCTATTA -3′。

1.2.2 總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 總RNA的提取按照Total RNA提取試劑盒(TaKaRa公司日本，9108)說明書進(jìn)行操作。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用PrimerScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa公司)試劑盒進(jìn)行操作。

1.2.3 RT-qPCR 采用SYBR Green II熒光染料進(jìn)行RT-qPCR檢測，按其說明書進(jìn)行操作。每個(gè)樣品的18S rRNA和Ghrelin基因分別做5個(gè)重復(fù)。由于Ghrelin和18S rRNA的擴(kuò)增效率均接近等于1，因此采用2-ΔCT公式進(jìn)行相對表達(dá)量的計(jì)算[6]，△Ct=CtGhrelin-Ct18S rRNA。

1.3 免疫組織化學(xué)染色 將固定好的組織樣品沖水過夜，經(jīng)脫水、透明、浸蠟及包埋，制成石蠟連續(xù)切片。切片厚度為4-5 μm。按照SABC免疫組織化學(xué)試劑盒說明書進(jìn)行操作，其中一抗為稀釋度1∶200的兔抗人、大鼠、小鼠、兔抗Ghrelin多克隆抗體，二抗為生物素化山羊抗兔IgG。經(jīng)蘇木精復(fù)染，脫水和透明后中性樹膠封固，鏡檢。陰性對照以PBS緩沖液取代一抗，其他步驟同上。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 用Graphpad Prism 5軟件進(jìn)行單因子方差分析，每組重復(fù)5次，檢驗(yàn)結(jié)果以P<0.01 代表差異極顯著，P<0.05代表差異顯著。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 Ghrelin相對表達(dá)量 RT-qPCR檢測結(jié)果經(jīng)Graphpad Prism 5軟件分析發(fā)現(xiàn)，Ghrelin在馴鹿胃腸道內(nèi)均有表達(dá)且相對表達(dá)量差異顯著(圖1)，Ghrelin在皺胃內(nèi)的表達(dá)豐度極顯著高于其他器官(P<0.01)，其次是十二指腸、 回腸、結(jié)腸、瓣胃，且上述器官與瘤胃、網(wǎng)胃、空腸等器官內(nèi)的表達(dá)量相比差異顯著(P<0.05)。

圖1 Ghrelin在馴鹿胃腸道的相對表達(dá)量**：P <0.01；*：P <0.05

2.2 Ghrelin陽性細(xì)胞的分布 經(jīng)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，Ghrelin免疫陽性細(xì)胞主要分布于瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃的黏膜層和黏膜下層，染色呈淡棕色，肌層未見陽性染色(見中插彩版圖2：A1、B1、C1)；在皺胃內(nèi)大多散在分布于黏膜上皮和腺頸部，少數(shù)分布于腺體部和腺底部，黏膜下層和肌層也可見較強(qiáng)的陽性信號(hào)(見中插彩版圖2：D1、D2)；在十二指腸內(nèi)Ghrelin的陽性細(xì)胞在黏膜層、黏膜下層和肌層均有分布(見中插彩版圖3：E1)，其中腸絨毛上皮和黏膜下層陽性染色呈深棕色，十二指腸腸腺著色不明顯(見中插彩版圖3：E2)；空腸內(nèi)的Ghrelin陽性細(xì)胞主要集中在黏膜層和黏膜下層，固有層腸腺和肌層著色不明顯(見中插彩版圖3：F1)；回腸主要分布在黏膜層、黏膜下層和肌層，固有層腸腺著色不明顯(見中插彩版圖3：G1)；結(jié)腸則主要位于黏膜上皮，其次是黏膜下層，肌層未見陽性表達(dá)(見中插彩版圖3：H1)。上述各陰性對照組均未發(fā)現(xiàn)陽性信號(hào)(見中插彩版圖2、圖3：A3-H3)。

3 討論

Ghrelin 是生長激素領(lǐng)域里的一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)。它的發(fā)現(xiàn)使我們對生長激素調(diào)節(jié)系統(tǒng)和胃腸功能等調(diào)節(jié)機(jī)制有了更深入的了解。目前，關(guān)于反芻動(dòng)物消化道Ghrelin的研究也在持續(xù)增多。Wang等[7]通過檢測0～56日齡羔羊胃腸道內(nèi)Ghrelin的表達(dá)，結(jié)果顯示，在皺胃內(nèi)Ghrelin的表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他胃腸組織。王家鄉(xiāng)等[8]通過RT-PCR法研究Ghrelin在非洲雛鴕鳥胃腸道內(nèi)的分布變化，結(jié)果顯示，Ghrelin除在空腸、結(jié)腸不表達(dá)外，在消化道的其他部位均有表達(dá)。本試驗(yàn)采用RT-qPCR和免疫組織化學(xué)等方法對Ghrelin在馴鹿胃腸道的表達(dá)及分布進(jìn)行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，皺胃、十二指腸、回腸、結(jié)腸內(nèi)Ghrelin的表達(dá)量和免疫陽性細(xì)胞分布均顯著高于瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃、空腸(P<0.05)，且在馴鹿胃腸道的黏膜層、黏膜下層都可見免疫陽性反應(yīng)。

于高水等[9]研究，Ghrelin在撒能奶山羊胃腸道的分布與表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ghrelin陽性細(xì)胞在胃腸道黏膜層均可被檢測到。本試驗(yàn)證實(shí)，在馴鹿體內(nèi)Ghrelin免疫陽性細(xì)胞分布于整個(gè)消化管的黏膜層，說明反芻動(dòng)物在表達(dá)Ghrelin上可能存在種屬特異性。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，在瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃內(nèi)Ghrelin mRNA和蛋白表達(dá)均比較低。Ghrelin陽性細(xì)胞在馴鹿皺胃、十二指腸、空腸、回腸的分布特點(diǎn)與黑麂[10]、濟(jì)寧青山羊[11]和鼠[12]相一致，黏膜層、黏膜下層和肌層都可見免疫陽性細(xì)胞的分布，提示Ghrelin可能對馴鹿胃腸功能和胃酸的分泌發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

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The examination of expression andlocalization of Ghrelin in the reindeer gastrointestinal tract

TANG Juan1, ZHANG Man2, JIN Xin2, LIU Jiao2, TIAN Qiao-zhen2,WANG Yun-he2, YANG Yin-feng2

(1. Academy of Agriculture and Animal Husbandry in Inner Mongolia, Hohhot 010031， China;2. College of Veterinary Medicine，Inner Mongolia Agriculture University, Hohhot 010018,China)

The RT-qPCR and Immunohistochemistry were used to examine the expression and localization of Ghrelin in the reindeer gastrointestinal tract. The results of RT-qPCR indicated that the expression in the abomasum was significantly higher than that in other organs(P<0.01), followed by duodenum, ileum and colon. Immunohistochemical staining results showed that Ghrelin-positive cells in the abomasum were mainly distributed in the tunica mucosa, tunica submucosa and tunica muscularis and also detected in the tunica mucosa, tunica submucosa of rumen, reticulum, omasum. Ghrelin-positive cells were mainly localized in the tunica mucosa, tunica submucosa and tunica muscularis of duodenum, jejumum, ileum, and colon. Especially more cells were found in the epithelium of intestinal villi and the tunica submucosa. RT-qPCR and immunohistochemistry indicated that Ghrelin was presented in gastrointestinal tract, suggesting its possible role in regulating the digestive function.

Ghrelin; reindeer; RT-qPCR; Immunohistochemistry

YANG Yin-feng

2016-06-29

內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金(2013MS0408)

唐娟(1965- )，女，副研究員，本科，主要從事中獸藥的研發(fā),E-mail:tangjuan12002@163.com；張曼(1990- )，女，博士生，主要從事動(dòng)物解剖及分子生物研究，E-mail：zhangman90514@163.com

楊銀鳳，E-mail：julie1963@163.com

S865.4?2

A

0529-6005(2016)11-0040-03

注：張曼與唐娟對本文具有同等貢獻(xiàn)