血漿對(duì)氧磷酶1在奶牛酮病中的變化及其預(yù)測(cè)作用

曹 宇 ， 張 江 ， 楊 威 ， 夏 成 ， 張洪友 ， 王艷輝 ， 徐 闖

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院， 黑龍江大慶163319)

血漿對(duì)氧磷酶1在奶牛酮病中的變化及其預(yù)測(cè)作用

曹 宇 ， 張 江 ， 楊 威 ， 夏 成 ， 張洪友 ， 王艷輝 ， 徐 闖

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院， 黑龍江大慶163319)

為了早期預(yù)測(cè)奶牛酮病的發(fā)生， 隨機(jī)選取黑龍江某集約化牛場(chǎng)， 產(chǎn)后14～21 d奶牛為試驗(yàn)動(dòng)物。 通過對(duì)氧磷酶1(PON1)、 葡萄糖(GLU)、 游離脂肪酸(NEFA)、 β-羥丁酸(BHBA)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的檢測(cè)， 闡明奶牛圍產(chǎn)期PON1在奶牛酮病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)警作用。 結(jié)果表明， 酮病組較對(duì)照組奶牛血漿中PON1活性和含量顯著下降。 PON1含量、 活性與GLU、 BHBA、 NEFA和AST均有顯著相關(guān)性。 根據(jù)受試者工作特征曲線(ROC)分析確定酮病預(yù)測(cè)值為血漿PON1含量>46.79 nmol/L、 GLU>3.04 mmol/L、 AST<100 U/L、 NEFA>0.82 mmol/L。 試驗(yàn)表明，PON1、 GLU、 AST和NEFA均可用作預(yù)測(cè)奶牛酮病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估指標(biāo)。

奶牛； 酮??； 對(duì)氧磷酶-1； 相關(guān)分析； ROC分析

酮病是奶牛圍產(chǎn)期常見的危害較為嚴(yán)重的營養(yǎng)代謝病，其臨床主要表現(xiàn)為酮血癥、酮尿癥和酮乳癥[1]。國際上公認(rèn)的奶牛酮病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是血漿β-羥丁酸(BHBA)≥1.2 mmol/L[2]。較多文獻(xiàn)還報(bào)道了奶牛酮病、肝功異常與奶牛脂肪肝發(fā)生密切相關(guān)。當(dāng)奶牛酮病圍產(chǎn)期發(fā)生率越高、血漿BHBA濃度升高越多(2.50 mmol/L以上)，肝功酶活性越高(AST>100 U/L)，奶牛脂肪肝發(fā)生率也越高[3]。

PON1是一種鈣依賴性酶，主要經(jīng)肝臟分泌入血。最新的文獻(xiàn)報(bào)道血中PON1活性降低對(duì)奶牛脂肪肝具有良好的診斷價(jià)值[4]。本試驗(yàn)通過檢測(cè)圍產(chǎn)后期酮病奶牛和AST高的試驗(yàn)牛血漿中PON1活性和含量以及相關(guān)生化指標(biāo)，闡明血漿PON1對(duì)產(chǎn)后酮病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)作用，為及早預(yù)防奶牛酮病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與血液樣本采集 在黑龍江某地采用自由臥欄、TMR飼喂以及具有完善牛場(chǎng)管理軟件的集約化奶牛場(chǎng)中開展試驗(yàn)。選取年齡2～4歲，胎次1～3次，產(chǎn)后14～21d健康奶牛21頭，酮病奶牛17頭。

試驗(yàn)?zāi)膛Ｓ谇宄坎裳獣r(shí)間點(diǎn)空腹進(jìn)行尾靜脈采血10 mL，加入150 IU肝素抗凝，于30 min內(nèi)離心分離血漿(5 000 r/min離心5 min)，血漿分裝后置于 -80 ℃ 冰柜冷凍保存。

1.2 檢測(cè)指標(biāo)與統(tǒng)計(jì)分析 血漿PON1活性使用血液PON1有機(jī)磷酸酶活性光度法定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，PON1含量使用牛PON1酶聯(lián)免疫分析測(cè)定(均購自上海哈靈科技有限公司)。β-羥丁酸、游離脂肪酸、谷草轉(zhuǎn)氨酶和血糖(以上試劑盒均購自南京建成生物工程研究所)。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用IBM SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，相關(guān)性利用皮爾遜相關(guān)系數(shù)分析，疾病預(yù)測(cè)利用二元回歸分析，診斷效果以及分界值的確定利用ROC分析。

2 結(jié)果

2.1 試驗(yàn)?zāi)膛Ｑ荷笜?biāo)的比較 由表1可知，酮病組較對(duì)照組奶牛血漿中PON1活性顯著下降；PON1含量和GLU含量極顯著下降；AST、BHBA和NEFA含量極顯著升高。

表1 試驗(yàn)?zāi)膛Ｑ荷笜?biāo)的比較

2.2 奶牛PON1與血液各生化指標(biāo)的相關(guān)性 由表2可知PON1含量與PON1活性和葡萄糖呈極顯著正相關(guān)；與AST呈顯著負(fù)相關(guān)；與BHBA和NEFA呈極顯著負(fù)相關(guān)。PON1活性與PON1含量和GLU呈極顯著正相關(guān)；與AST和BHBA呈極顯著負(fù)相關(guān)。

表2 奶牛PON1與血液各生化指標(biāo)的相關(guān)性

*：差異顯著， P<0.05； **差異極顯著,P<0.01

3 泌乳奶牛酮病的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)

表2和中插彩版圖1顯示了奶牛酮病預(yù)警的相關(guān)指標(biāo)分界值、敏感度和特異性。通過Youden指數(shù)確定的最佳分界值分別為血漿PON1含量>46.79 nmol/L，GLU>3.04 mmol/L，AST<100 U/L，NEFA<0.82 mmol/L；敏感度分別為87.50%、93.80%、100%和75%，特異度分別為100%、83.3%、82.4%、94.1%。曲線下面積分別為0.953、0.929、0.941和0.894。

表3 分界值、敏感度、特異度陰性預(yù)測(cè)值、陽性預(yù)測(cè)值、陽性依然比、陰性依然比和ROC曲線下面積

4 討論

本研究顯示，酮病組奶牛血中PON1活性和含量較正常組均顯著降低，并與BHBA呈顯著負(fù)相關(guān)。這可能是圍產(chǎn)期奶牛由于能量輸出較大而得不到充分的能量補(bǔ)給而引起奶牛處于能量負(fù)平衡狀態(tài)，體脂動(dòng)員產(chǎn)生大量的脂肪酸在肝臟肝線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)β氧化過程中會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)[5]。過多的ROS和自由基耗竭抗氧化因子，使促氧化物與抗氧化物之間的動(dòng)態(tài)平衡失調(diào)，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，就容易導(dǎo)致氧化應(yīng)激狀態(tài)[6]。脂質(zhì)過氧化物可產(chǎn)生大量具有反應(yīng)活性和細(xì)胞毒性的中間產(chǎn)物，導(dǎo)致肝細(xì)胞死亡、壞死，并通過細(xì)胞損傷產(chǎn)生炎癥反應(yīng)或吸引炎癥細(xì)胞浸潤肝實(shí)質(zhì)[7]。當(dāng)肝臟損傷時(shí)，肝臟合成PON1減少，血中PON1活性會(huì)下降。這可能與機(jī)體氧化應(yīng)激與PON1活性成反比有關(guān)[8]。另外，NEFA本身就具有肝細(xì)胞毒性，通過增強(qiáng)腫瘤壞死因子等細(xì)胞因子的毒性，引起線粒體腫脹與通透性增加、肝細(xì)胞變性、壞死或凋亡[9]。本試驗(yàn)NEFA與PON1含量呈顯著負(fù)相關(guān)，這與以往的研究一致，PON1可能對(duì)奶牛脂肪肝具有一定的診斷作用[4]。同時(shí)，血中AST活性卻顯著的升高，PON1與AST存在顯著的負(fù)相關(guān)。這是由于AST存在于多種器官的細(xì)胞的胞漿或線粒體內(nèi)且尤以肝臟、心肌和骨骼肌中活性最高。當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)，細(xì)胞膜通透性增加，胞漿中酶釋放入血，血中酶活性會(huì)升高。因此，AST常作為肝脂沉積的標(biāo)志物來診斷脂肪肝[10]。

本試驗(yàn)初步對(duì)奶牛酮病相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，PON1含量應(yīng)高于46.79 nmol/L；GLU高于3.04 mmol/L；AST不應(yīng)高于100 U/ml；NEFA不應(yīng)高于0.82 mmol/L，試驗(yàn)表明，PON1、GLU、AST和NEFA均可用作預(yù)測(cè)奶牛酮病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估指標(biāo)。

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Warning Value of Plasma PON1 in Dairy Cows with Ketosis

CAO Yu, ZHANG Jiang, YANG Wei, XIA Cheng, ZHANG Hong-you, WANG Yan-hui, XU Chuang

(Collge of Animal Science and Veterinary Medicine, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319，China)

In order to predict early cow ketosis,postpartum dairy cows were randomly selected as experimental animals in Heilongjiang.Biochemical assay was used to determine PON1, GLU, NEFA, BHBA and AST to clarify the role of PON1 in the risk of ketosis in dairy cows. Results indicated that PON1 activity and level of PON1 were significantly decreased when compared with the control group(P<0.05). The activity of serum PON1 and level of PON1 were significantly correlated with the level of plasma GLU, AST and BHBA. According to the receiver operating characteristic curve (ROC) analysis, the ketosis warning values of plasma PON-1 content is more than 46.79 nmol/L, GLU is more than 3.04 mmol/L, AST is less then 100 U/L and NEFA is less than 0.82 mmol/L.This study verifv that the levels of PON1, GLU, AST and NEFA could be used as indicators to predict the risk of ketosis for dairy cows.

Dairy cow; Ketosis; PON-1; Correlation Analysis; Receiver Operating Characteristic

ZHANG Hong-you

2016-03-16.

國家科技部計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD12B05-2；2012BAD12B03-2；2013BAD21B01)；霍英東教育基金會(huì)高等院校青年教師基金(141021)

曹宇(1991- )，男，碩士生，研究方向?yàn)榕R床獸醫(yī)學(xué)，E-mail：1015009909@qq.com

張洪友，E-mail: zhy478@163.com

S823.91

A

0529-6005(2016)11-0038-02