綠茶提取物對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的作用機(jī)制探討

馮 強(qiáng),李 毅,王文洋,夏鵬程,楊憲勇,張?jiān)?/p>

(1.泰安市中心醫(yī)院 檢驗(yàn)科，山東 泰安271000;2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院)

*通訊作者

綠茶提取物對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的作用機(jī)制探討

馮 強(qiáng)1.2,李 毅1,王文洋1,夏鵬程1,楊憲勇1,張?jiān)?*

(1.泰安市中心醫(yī)院 檢驗(yàn)科，山東 泰安271000;2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院)

目的 研究綠茶提取物的抗腫瘤活性。方法 不同濃度的綠茶提取物作用于MCF-7細(xì)胞，通過(guò)觀察細(xì)胞形態(tài)，檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡。結(jié)果 綠茶提取物可以阻滯人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7生長(zhǎng)周期于G1 期；熒光染色顯示細(xì)胞凋亡率增高，電鏡觀察，出現(xiàn)細(xì)胞染色質(zhì)濃縮、核周邊集，線粒體形態(tài)正常等細(xì)胞凋亡的典型特征；綠茶提取物作用后可以導(dǎo)致MCF-7細(xì)胞中Caspase3蛋白活性增強(qiáng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。結(jié)論 綠茶提取物對(duì)乳腺癌細(xì)胞均有一定的抑制作用，進(jìn)一步篩選其有效成分可以用于腫瘤的預(yù)防與治療。

綠茶提取物；MCF-7；細(xì)胞凋亡；乳腺癌；抗腫瘤

(ChinJLabDiagn,2016,20:1999)

乳腺癌是一種嚴(yán)重影響婦女身心健康甚至危及生命的最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。在我國(guó)部分大城市，乳腺癌已居女性惡性腫瘤的首位[1]。有文獻(xiàn)表明，亞洲婦女罹患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)低于歐洲和美國(guó)婦女[2]，近年來(lái)多種研究證實(shí)，茶葉不僅能夠降脂、減肥、降壓、抗輻射之外，還含有抗病毒、抗腫瘤等天然有效成分，可抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展[3]。但是綠茶提取物是否能真正有抑制腫瘤作用，尤其是對(duì)乳腺癌的抑制作用及其原理尚未明確。本研究希望通過(guò)探討綠茶提取物對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的誘導(dǎo)凋亡的作用機(jī)制，以期為尋找新的抗腫瘤天然藥物提供新的思路和途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

乳腺癌細(xì)胞株MCF-7由本實(shí)驗(yàn)室保存。Annexin V-FITC 凋亡檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞周期試劑盒、TUNEL試劑盒購(gòu)于Becton Dickinson公司。

1.2 方法

1.2.1 倒置顯微鏡鏡及透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化 用綠茶提取物濃度為20、40、60 μg/ml處理細(xì)胞，RPMI1640 作為空白對(duì)照，細(xì)胞處理48 h 后，固定后醋酸雙氧鈾-枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡觀察。

1.2.2 MCF-7細(xì)胞周期和凋亡的檢測(cè) 配制濃度為1×106個(gè)/ml 的人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞懸液，分別加入20 μg/ml、40 μg/ml、60 μg/ml、100 μg/ml 綠茶提取物溶液，于24 h、48 h、72 h各時(shí)間點(diǎn)取每組細(xì)胞進(jìn)行MTT法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。同時(shí)，流式細(xì)胞儀上樣檢測(cè)，利用分析軟件CellQuest 計(jì)算細(xì)胞凋亡率；TUNEL法檢測(cè)腫瘤組織細(xì)胞凋亡情況。

1.2.3 Caspase-3蛋白檢測(cè) 采用鏈酶親合素生物素復(fù)合物 ( SABC )法加微波修復(fù)，按照說(shuō)明書操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件完成。各處理組均數(shù)與對(duì)照組比較用LSD-t檢驗(yàn).結(jié)果以mean±SD表示,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 綠茶提取物對(duì)MCF-7細(xì)胞形態(tài)的影響

倒置顯微鏡下，對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好，透明度大,折光性強(qiáng),細(xì)胞形態(tài)呈多邊形且連成片；隨著加入的綠茶提取物濃度的增加，細(xì)胞形逐漸出現(xiàn)皺縮，變圓，折光性變?nèi)?，?xì)胞數(shù)目逐漸減少。

電鏡下，對(duì)照組MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞核形狀不規(guī)則，核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，核仁明顯，胞質(zhì)內(nèi)核糖體豐富，線粒體外膜和內(nèi)嵴完整。隨著綠茶提取物濃度的增加，細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的線粒體損傷越來(lái)越嚴(yán)重，部分呈現(xiàn)空泡樣和髓鞘樣變。濃度達(dá)到60 μg/ml時(shí)，細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮，凝集呈半月形或團(tuán)塊狀，聚集在核膜內(nèi)緣，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)許多大小不等的空泡和自噬體，細(xì)胞外可查見(jiàn)大量細(xì)胞碎片。(圖1)

圖1 綠茶提取物對(duì)MCF-7細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的影響

2.2 綠茶提取物對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響

MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，綠茶提取物對(duì) MCF-7人乳腺癌細(xì)胞的抑制效果隨濃度升高而增加。100 μg/ml濃度處理 MCF-7人乳腺癌細(xì)胞時(shí)，抑制率高達(dá)53.47%。在24 h、48 h、72 h時(shí)，同一濃度的綠茶提取物抑制率逐漸升高，表明同一濃度的綠茶提取物的抑制率具有時(shí)間依賴性。(圖2-A)

應(yīng)用AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)綠茶提取物對(duì)MCF-7的凋亡率。對(duì)照組在24h凋亡率為57.8±0.52，實(shí)驗(yàn)組凋亡率為77.73±0.96，兩組間凋亡率差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。不同濃度綠茶提取物作用于乳腺癌細(xì)胞48 h后，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(圖2-B)

TUNEL法檢測(cè)腫瘤組織細(xì)胞凋亡情況，通過(guò)熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)綠茶提取物作用后的熒光明顯增強(qiáng)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)綠茶提取物作用于人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7 48 h 后， 40、60 μg/ml組 G1期及S期二倍體 DNA 含量變化顯著(P<0.05)，且各濃度組間比較差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。細(xì)胞周期出現(xiàn) G1 期阻滯現(xiàn)象，S期細(xì)胞相應(yīng)減少，亞G1峰呈遞增態(tài)勢(shì)。提示綠茶提取物可使細(xì)胞周期阻滯于G1 期。(圖2-C)

2.3 綠茶提取物對(duì)對(duì)MCF-7細(xì)胞中Caspase-3活性的影響

通過(guò)圖3可以看出，綠茶提取物作用MCF-7細(xì)胞后，隨著綠茶提取物濃度的提高，Caspase-3活力逐漸升高，具有劑量依賴性；并且同一濃度的綠茶提取物組的Caspase-3活力隨時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，具有時(shí)間依賴性。(圖3)

3 討論

茶葉是亞洲人最喜歡，也是最普遍飲用飲料。目前，大量研究表明，綠茶提取物具有抗氧化、防癌、抗腫瘤、抗輻射、抗病毒、增強(qiáng)機(jī)體抵抗力、降血糖和血脂、預(yù)防心血管疾病、抗衰老抑菌、除臭等多種功能[4]。

對(duì)腫瘤細(xì)胞周期的阻滯作用和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是綠茶提取物抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的重要機(jī)理。細(xì)胞調(diào)控機(jī)制的紊亂，細(xì)胞失控性增長(zhǎng),其結(jié)果導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(Epigallocatechin gallate，EGCG)可以通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)周期正常進(jìn)程而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),可使腫瘤細(xì)胞停留在某一期"當(dāng)癌細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯在G0期,達(dá)到某一程度和時(shí)間仍不能被解除使細(xì)胞無(wú)法進(jìn)入S期和M/G2時(shí)，將激活細(xì)胞內(nèi)的某機(jī)制啟動(dòng)程序,導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)法正常分化而死亡[5，6]。EGCG抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng),從而達(dá)到防癌抗癌的目的。細(xì)胞凋亡是在特定時(shí)空中發(fā)生的受機(jī)體嚴(yán)格調(diào)控的程序化細(xì)胞死亡過(guò)程。細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是一種正常的生物學(xué)老化現(xiàn)象。目前大多數(shù)化療藥物都是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡達(dá)到清除腫瘤細(xì)胞的作用。綠茶提取物抗腫瘤作用誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞、表皮癌細(xì)胞、鼻咽癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、大腸癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞凋亡已經(jīng)有很多人在研究[7]。我們的研究也證實(shí)綠茶提取物可以把瘤細(xì)胞周期的阻滯在G0/G1期，細(xì)胞增殖出現(xiàn)嚴(yán)重阻滯。Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能[8,9]。Caspase-3正常以酶原(32 KD)的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個(gè)大亞基(17 KD)和兩個(gè)小亞基(12 KD)組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。但在細(xì)胞凋亡的晚期和死亡細(xì)胞，caspase-3的活性明顯下降。

圖2 綠茶提取物對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

圖3 綠茶提取物對(duì)MCF-7細(xì)胞中Caspase-3活性的影響

目前，食品中的各種生物活性物質(zhì)在癌癥形成的各個(gè)階段均有特定的保護(hù)作用。飲食與癌癥發(fā)生的眾多途徑有關(guān)，包括細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期的控制與分化、血管生成、DNA 修復(fù)以及致癌物質(zhì)的代謝[10]。對(duì)于綠茶提取物，在抗癌、防癌方面具有諸多功效，綠茶作為天然植物，其機(jī)理的最終探明，將為茶葉及其組分藥用價(jià)值的開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用，并最終造福人類。

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Research of The mechanism on Green Tea Extracts to Breast Cancer Cell Line MCF-7

FENGQiang,LIYi,WANGWen-xiang，etal.

(TheCentralHospitalofTaian,Taian271000,China)

Objective Green tea extracts have many effects on anti-cancer,but the corresponding mechanism is still exploring.Methods In this experiment,different concentrations of green tea extracts were applied onto MCF-7 cells.Results Typical characteristics of cell apoptosis,such as chromatin condensation,perinuclear clustering and mitochondria morphism,were observed in SEM pictures.The flow cytometry detected that green tea extracts can facilitate MCF-7 apoptosis and could retard MCF-7 growth at G1 stage.Fluorescence staining reflects that green tea extracts increases apoptosis rate.Conclusion Therefore,green tea extracts can be used as similar demethylated,low-toxicity and even nontoxic natural plant drugs for antineoplastic.

green tea extracts;MCF-7;apoptosis;breast cancer;anticarcinoma

1007-4287(2016)12-1999-04

R737.9

A

2016-03-27)