不同基因型煙草體內(nèi)外毒理學(xué)效應(yīng)的初步分析

武 娟，魏克強(qiáng)，任建英

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006）

不同基因型煙草體內(nèi)外毒理學(xué)效應(yīng)的初步分析

武 娟，魏克強(qiáng)，任建英

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006）

利用Ames試驗(yàn)分析2個基因型的煙草品種CS-1和CS-2煙霧提取物（CSE）對TA97，TA98，TA100和TA102標(biāo)準(zhǔn)測試菌株的基因毒性；采用亞慢性毒性試驗(yàn)，對SD大鼠連續(xù)煙氣暴露56 d，觀察其肺組織的病理變化，檢測CS-1和CS-2對血清中SOD，GSH-Px活力和MDA含量的影響。結(jié)果表明，與CS-1相比，CS-2誘導(dǎo)的細(xì)菌回復(fù)突變數(shù)顯著降低；煙氣暴露56 d后，試驗(yàn)組大鼠肺組織及支氣管周圍大量炎癥細(xì)胞聚集、浸潤，肺泡腔不規(guī)則擴(kuò)大，支氣管管壁增厚；血清GSH-Px活性和MDA含量較對照組顯著增加（P＜0.05），而SOD活性低于對照組；這些指標(biāo)在CS-1與CS-2組間存在一定的差異。表明降低煙草中的有害化學(xué)成分、引入有益的醫(yī)藥成分，對減緩或降低煙氣的毒性效應(yīng)具有重要的意義。

香煙煙霧；Ames；大鼠；肺；丙二醛

我國的煙草生產(chǎn)和消費(fèi)均居于世界首位。有研究表明，吸煙與慢性阻塞性肺疾病、心血管疾病、肺癌等存在密切的相關(guān)性[1-2]。香煙燃吸涉及燃燒、裂解、蒸餾、聚合等復(fù)雜的物理化學(xué)過程[3]，釋放的煙霧（氣相和粒相）中含有4 700余種物質(zhì)，其中的1/3直接來自于煙草，致癌物多達(dá)40余種[4]。藥用植物中的一些成分可能對降低卷煙的危害具有重要的作用[5-6]。目前，通過煙草與藥用植物的遠(yuǎn)緣雜交，已成功培育出了含有多種有益醫(yī)藥成分的新型藥煙品種[7]。

本研究采用體外細(xì)菌誘變分析（Ames試驗(yàn)）和大鼠亞慢性毒性試驗(yàn)，初步分析了新型煙草的毒理學(xué)效應(yīng)，旨在為指導(dǎo)煙草品種的遺傳改良提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

CS-1為我國煙草栽培品種，CS-2為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草育種室培育的新型煙草品種，這2種測試所用的單料煙，均由山西昆明煙草有限責(zé)任公司卷制；鼠傷寒沙門氏菌組氨酸營養(yǎng)缺陷型標(biāo)準(zhǔn)菌株TA97，TA98，TA100和TA102，均由中國檢驗(yàn)檢疫研究院提供。健康、清潔級SD大鼠（雄性，6周齡，體質(zhì)量約180 g），購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 試劑

SOD，GSH-Px和MDA檢測試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器

光學(xué)顯微鏡（Olympus BX51，日本）；石蠟切片機(jī)（Leica RM2255，德國）；多功能酶標(biāo)儀（Spectra Max M5，美國）；高速冷凍離心機(jī)（KDC-140HR，安徽中科中佳）；高速勻漿機(jī)（S10，寧波新芝）等。

1.4 方法

1.4.1 Ames試驗(yàn)方法 參考GB 15193.4—2003《鼠傷寒沙氏菌門/哺乳動物微粒體酶試驗(yàn)》[8]進(jìn)行試驗(yàn)。

1.4.1.1 香煙煙霧提取物（CSE）的制備 其制備參照ISO標(biāo)準(zhǔn)[9]，先將香煙置于溫度22℃、濕度60%的烘箱48 h。然后采用溶液吸收法采集香煙煙霧：抽吸裝置為注射器，收集器為U型玻璃吸收管，2個吸收管中分別加無菌水和95%乙醇，用于收集煙霧的無機(jī)和有機(jī)成分。煙氣采集按照ISO3308標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[10]，即每隔2 s抽吸35 mL，抽吸時間間隔為58 s，且采集過程中沒有煙氣外露。重復(fù)該操作，10支煙所產(chǎn)生的煙霧溶入吸收管，最后將2個吸收管液體混合，定容至10 mL，此提取物的濃度為1.0支/mL[11]。

1.4.1.2 用多氯聯(lián)苯（PCB）誘導(dǎo)大鼠肝微粒體酶

多氯聯(lián)苯溶于玉米油中，大鼠腹腔注射（劑量為500 mg/kg），5 d后頸椎脫臼處死。在無菌超凈工作臺內(nèi)，解剖取出肝臟，去除肝臟周圍的結(jié)締組織，用冰冷的0.15 mol/LKCl溶液清洗，稱質(zhì)量，用電動勻漿器將其制成肝組織勻漿，4℃，9 000 r/min離心10 min，吸出上清液即為S9，分裝于無菌冷凝管中，置于-80℃低溫保存。

1.4.1.3 試驗(yàn)菌株生物學(xué)特性鑒定 依據(jù)GB 15193.4—2003[8]，對標(biāo)準(zhǔn)測試菌TA97，TA98，TA100和TA102進(jìn)行組氨酸依賴性、脂多糖屏障缺陷、四環(huán)素抗性、紫外線損傷修復(fù)基因缺陷、R因子及自發(fā)回復(fù)突變率鑒定。

1.4.1.4 采用平板摻入法[12]進(jìn)行檢測 CSE設(shè)5個劑量組（分別稀釋0，2，4，8，16倍），另外設(shè)置酒精和無菌水混合液為陰性對照（V∶V＝1∶1），敵克松和2-氨基芴為陽性對照。在添加代謝活化物（+S9）和不添加代謝活化物（-S9）的條件下，每個待測物進(jìn)行3次重復(fù)，37℃培養(yǎng)48 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.4.2 亞慢性毒性試驗(yàn)

1.4.2.1 煙氣暴露染毒 參考Zeng等[13]的方法，將SD大鼠隨機(jī)分為對照組（空氣暴露）、煙氣暴露試驗(yàn)組CS-1和CS-2，每組各9只，同時各組設(shè)置3個重復(fù)。將試驗(yàn)組大鼠放入自制玻璃吸煙箱內(nèi)（100 cm×80 cm×60 cm），每天上下午各熏一次，每次間隔時間為4 h，每次持續(xù)1 h、吸煙10支，連續(xù)56 d。暴露14，28，56 d后，各組分別隨機(jī)取9只大鼠，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，心臟采血，于4℃，3 000 r/min下離心10 min，取血清進(jìn)行分析。

1.4.2.2 肺組織H.E.染色 收集肺組織，用預(yù)冷的0.9%生理鹽水清洗后，取一小部分置于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，5 μm切片用伊紅-蘇木精染色，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織的病理變化[14]。

1.4.2.3 血清中SOD，GSH-Px和MDA含量測定按照試劑盒說明書進(jìn)行SOD，GSH-Px和MDA含量測定。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，所有數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用One-wayANOVA進(jìn)行單因素方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1生物學(xué)特性鑒定

試驗(yàn)菌株生物學(xué)特性鑒定結(jié)果表明，各菌株均符合生物學(xué)特性的要求。

2.2 平板摻入試驗(yàn)回復(fù)突變結(jié)果

采用平板摻入法分別檢測2種CSE對鼠傷寒沙門氏菌TA97，TA98，TA100和TA102菌株在-S9和+S9情況下的致突變性，回復(fù)突變菌落數(shù)越多其致突變活性越強(qiáng)，結(jié)果顯示，CSE加S9后的致突變活性均明顯高于不加S9的致突變活性。無論是-S9還是+S9，CS-1組的CSE對4種菌株的致突變活性普通高于CS-2。當(dāng)CSE的稀釋倍數(shù)為4時，在-S9的情況下，CS-2對TA97的回復(fù)突變能力較CS-1降低24.7%；當(dāng)CSE的稀釋倍數(shù)為8時，CSE在-S9和+S9情況下，CS-2對TA98，TA100和TA102的回復(fù)突變能力較CS-1分別降低56.7%，46.1%；38.3%，21.5%；26.1%，12.3%。表明CS-2的致突變性顯著低于CS-1（圖1）。

2.3 大鼠肺組織病理變化

病理觀察結(jié)果顯示，對照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺組織中無明顯炎癥細(xì)胞浸潤；小支氣管壁結(jié)構(gòu)完整且無增厚現(xiàn)象（圖2-A）。試驗(yàn)大鼠煙熏暴露14 d后呈現(xiàn)出病理改變，支氣管壁周圍及肺間質(zhì)間有炎癥細(xì)胞浸潤（圖2-B，E）。煙氣暴露時間延長至28 d后，炎癥細(xì)胞聚集、浸潤愈加嚴(yán)重，肺泡腔不規(guī)則擴(kuò)大，部分肺泡間隔斷裂，但支氣管管壁無明顯變化（圖2-C，F(xiàn)）。煙熏56 d后，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡間隔斷裂愈加嚴(yán)重，形成較大的囊腔。支氣管管壁黏膜皺壁增多并突入管腔內(nèi)，導(dǎo)致官腔狹窄。CS-1組肺泡腔擴(kuò)大損傷程度明顯比CS-2組嚴(yán)重（圖2-D，G）。

2.4 不同香煙煙霧暴露對大鼠SOD，GSH-Px和MDA的影響

從圖3可以看出，煙氣暴露56 d后，CS-1組SOD活性顯著低于對照組，而CS-1和CS-2組的GSH-Px活力均顯著高于對照組（P＜0.05）；但試驗(yàn)組CS-1與CS-2組的SOD，GSH-Px活力差異均不顯著（P＞0.05）。煙氣暴露28 d后，試驗(yàn)組大鼠血清中的MDA含量，隨著煙氣暴露時間的延長均顯著高于對照組（P＜0.05）。煙氣暴露56 d后，CS-1組的MDA含量較CS-2組提高了14.5%，表明CS-1組大鼠脂質(zhì)損傷程度比CS-2組嚴(yán)重。

3 討論

有研究顯示，香煙煙霧含多種誘變劑和致癌劑，吸煙與人類30%的腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[5，15]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，CS-1與CS-2煙霧的毒性效應(yīng)存在一定的差異。在煙霧提取物的Ames試驗(yàn)中，CS-2的細(xì)菌誘變數(shù)量較同劑量的CS-1低，對TA98的致突變活性降低程度最大，達(dá)到56.7%（-S9）和46.1%（+S9）。表明新型煙草能大幅度降低香煙煙霧的致突變性。亞慢性毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)大鼠經(jīng)煙氣暴露56 d后肺組織及支氣管周圍炎癥細(xì)胞聚集、浸潤[16]，肺泡腔不規(guī)則擴(kuò)大，出現(xiàn)支氣管管壁增厚現(xiàn)象，CS-1組肺泡腔破壞及支氣管管壁增厚情況較CS-2組嚴(yán)重。

有研究表明，香煙煙霧中富含自由基，每噴出的一口煙霧中大約含1017個氧化劑分子[17]；當(dāng)吸煙者體內(nèi)的自由基含量超過抗氧化酶清除能力時，會發(fā)生氧化應(yīng)激[18]，導(dǎo)致生物大分子的氧化損傷，促發(fā)多種疾病的發(fā)生。因此，氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物是反映香煙煙霧危害的重要指標(biāo)[19]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，香煙煙霧暴露56 d后，試驗(yàn)組大鼠血清的SOD活性降低，而GSH-Px活力、MDA含量顯著高于對照組（P＜0.05），這與黃文等[20]的研究結(jié)果一致；CS-2組大鼠的SOD和GSH-Px活力稍高于CS-1組，而MDA的含量低于CS-1組，但2組間均無顯著性差異，這可能與煙熏劑量、染毒時間、受試動物等因素有關(guān)。同時也表明，通過育種進(jìn)一步降低煙草的有害化學(xué)成分、引入有益的醫(yī)藥成分可能是減緩或降低煙氣毒害作用的有效措施。

志謝：感謝山西農(nóng)業(yè)大學(xué)魏治中教授、山西昆明煙草有限責(zé)任公司總經(jīng)理陳景云及技術(shù)中心總監(jiān)樊杰先生為本研究提供的大力幫助！

［1］Yun Y H，Jung K W，Bas J M，et al.Cigarette smoking and cancer incidence risk in adult men：National health insurance corporation study[J].Cancer Detection&Prevention，2004，29（3）：15-24.

［2］陳利平，寧維，李瑜，等.煙草特有亞硝胺的研究進(jìn)展[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，41（12）：7-11.

［3］Baker R R.Smoke generation inside a burning cigarette：Modifying combustion todevelop cigarettes that maybe less hazardous tohealth [J].Progressin Energy and Combustion Science，2006，32：373-385.

［4］王瑞新.煙草化學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2003：207-218.

［5］韋獻(xiàn)飛，唐榮蘭，甘運(yùn)生，等.中草藥保健香煙的減毒及抗突變作用初步研究[J].癌變·畸變·突變，2007（1）：70-72.

［6］黃天輝，張靜，田兆福，等.中草藥添加劑降低卷煙有害物質(zhì)研究進(jìn)展[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，44（4）：4-8.

［7］魏克強(qiáng)，楊俊仙，魏治中.煙草與紫蘇科間遠(yuǎn)緣雜種后代化學(xué)成分及醫(yī)藥成分的研究 [J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2010，22（5）：801-806.

［8］中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.GB 15193.4—2003 鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗(yàn) [S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003：34-44.

［9］陸葉珍.卷煙煙氣冷凝物加S9與不加S9細(xì)胞-遺傳毒性體外試驗(yàn)的比較研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2010.

［10］楊丹蕾，徐永健，張珍祥，等.一氧化氮對香煙煙霧提取物誘導(dǎo)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞核因子kB活化的影響[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)，2003（1）：7-9.

［11］李威.香煙導(dǎo)致A549細(xì)胞遺傳物質(zhì)損傷試驗(yàn)研究 [D].武漢：武漢科技大學(xué)，2012.

［12］林汝法，王瑞，周運(yùn)寧.苦蕎提取物的毒理學(xué)安全性[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2001，16（1）：116-121.

［13］Zeng L X，Dong J C，Yu W Q，et al.Baicalin attenuates inflammation by inhibiting NF-kB activation in cigarette smoke induced in-flammatory models[J].Pulmonary Pharmacology&Therapeutics，2010，23：411-419.

［14］寧維，陳利平，李瑜，等.卷煙煙氣體內(nèi)安全評價方法研究[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，42（9）：152-156.

［15］王娟娟，陳海軍，許自成，等.輻射加工對煙草和卷煙質(zhì)量的影響[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，44（9）：7-10.

［16］杜祥月，李永亮，張俊，等.肺氣虛證小鼠模型造模方法及其對小鼠免疫功能的影響[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2014，29（5）：92-98.

［17］Macnee W.Pulmonary and systemic oxidant/antioxidant imbalance in chronic obstructive pulmonary disease[J].Proceeding of the American Thoracic Society，2005（2）：50-60.

［18］Thirumalai T，Therasa Viviyan S，Elumalai E K，et al.Effect in vivo of cigarette smoke on lipid peroxidation and antioxidant status in Male albino Mice[J].Journal of Pharmaceutical Scienced and Research，2010，2（9）：579-582.

［19］黃星培，王曉梅，王林，等.不同濃度香煙煙霧對小鼠SOD、GSH-Px和MDA的影響 [J].職業(yè)衛(wèi)生與疾病，2001，16（1）：35-36.

［20］黃文，孟華千，崔香麗，等.香煙煙霧對大鼠SOD、MDA和GSH-Px水平的影響及硒強(qiáng)化沙棘油的保護(hù)作用[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，35（4）：350-352.

Primary Analysis on Toxicology Effects of Different Genotypes Tobacco in vitro and in vivo

WU Juan，WEI Ke-qiang，REN Jian-ying
（College of Life Sciences，Shanxi University，Taiyuan 030006，China）

The genetic improvement of tobacco may reduce or relieve the toxic effect of cigarette smoke.Two different cigarette smoke extracts（CSE）of CS-1 and CS-2 were prepared for Ames test.In the flat-plate incorporation test of Salmonella typhimurium,the average number of spontaneous revertants of TA97，TA98，TA100 and TA102 was calculated.During the subchronic toxicity test,SD rats were exposed to cigarette smoke for 56 d.Lung tissue and serum of each group were sampled for histopathology and oxidative stress, including SOD,GSH-Px and MDA,by routine methods.The results showed that in the Ames test,the mutagenic properties of CS-2 was lower than CS-1.After 56 d smoke exposure,pathological features such as inflammatory cells infiltration and airway wall thickness were observed;the activity of GSH-Px and the content of MDA were significantly increased in experimental rats compared with the control（P＜0.05）,and the activity of SOD were lower in experimental rats than control group.There were some differences in these indicators between CS-1 and CS-2.The results indicated that the introduction of medicinal plant ingredients into tobacco had a significant meaning in reducing or relieving the toxicity of tobacco.

cigarette smoke;Ames；rat;lung;MDA

S572

A

1002-2481（2016）05-0596-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.05.07

2015-12-25

國家煙草專賣局重點(diǎn)科技項(xiàng)目（110199901005）；山西省回國留學(xué)人員科研資助項(xiàng)目（2013-024）

武 娟（1990-），女，山西壽陽人，在讀碩士，研究方向：動物分子細(xì)胞生物學(xué)。魏克強(qiáng)為通信作者。