熱應(yīng)激對(duì)奶牛乳中活性蛋白的影響

■ 周 旭 閔 力 趙圣國(guó) 鄭 楠 王加啟 臧長(zhǎng)江 楊開(kāi)倫*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部奶產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（北京），北京 100193)

5～20℃的環(huán)境溫度是奶牛發(fā)揮正常生產(chǎn)性能的適溫區(qū)，25～26℃是奶牛維持正常體溫的上限，當(dāng)奶牛處于高溫、高濕環(huán)境下，動(dòng)物產(chǎn)生的熱負(fù)荷不能與自身散熱能力相平衡，此時(shí)機(jī)體所作出的非特異性生理反應(yīng)稱(chēng)為熱應(yīng)激。熱應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致奶牛生理、生化指標(biāo)發(fā)生變化，影響機(jī)體激素的分泌，降低奶牛機(jī)體抵抗力，增加乳房炎發(fā)病率，嚴(yán)重影響奶牛生產(chǎn)性能。關(guān)于熱應(yīng)激對(duì)奶牛生產(chǎn)性能、血液生理生化、繁殖性能以及瘤胃內(nèi)環(huán)境等方面的影響國(guó)內(nèi)外已有很多相關(guān)報(bào)道，而對(duì)熱應(yīng)激條件下泌乳奶牛乳中活性蛋白變化的研究較少。因此，本試驗(yàn)通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)環(huán)境溫度和環(huán)境濕度，測(cè)定泌乳中期奶牛各項(xiàng)生理指標(biāo)及牛奶中乳活性蛋白，探討熱應(yīng)激條件下奶牛乳中活性蛋白的變化及原因，為緩解奶牛熱應(yīng)激和提高牛奶品質(zhì)調(diào)控技術(shù)的開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)在上海光明荷斯坦乳業(yè)有限公司的奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)完成。試驗(yàn)共選取23頭泌乳中期荷斯坦奶牛，試驗(yàn)分為試驗(yàn)Ⅰ期(2016年6月26日～2016年6月30日)和試驗(yàn)Ⅱ期(2016年7月27日～2016年7月30日)兩個(gè)階段。試驗(yàn)分組見(jiàn)表1。試驗(yàn)期選用溫濕度表記錄每日8:00、14:00和20:00牛舍中部的攝氏溫度和相對(duì)濕度，求3次平均值，根據(jù)溫濕度指數(shù)(temperaturehumidity index，THI)實(shí)際監(jiān)控結(jié)果以及呼吸頻率、直腸溫度等相應(yīng)生理指標(biāo)，依據(jù)以下公式計(jì)算THI。

式中：T——測(cè)定的攝氏溫度(℃)；

R——測(cè)定的相對(duì)濕度(%)。

表1 奶牛試驗(yàn)分組

1.2 飼養(yǎng)管理和試驗(yàn)日糧

試驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)在雙側(cè)均含噴淋和風(fēng)扇的拴系式牛舍中，每日3次(6:00、12:00和18:00)飼喂全混合日糧(Total mixed rations，TMR)，所有試驗(yàn)動(dòng)物自由采食，自由飲水。每日3次至擠奶廳機(jī)器擠奶。整個(gè)試驗(yàn)期奶牛飼養(yǎng)管理和試驗(yàn)日糧基本保持一致，見(jiàn)表2。

表2 試驗(yàn)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.3 樣品采集和樣品測(cè)定

1.3.1 干物質(zhì)采食量(DMI)和產(chǎn)奶量的測(cè)定

分別于試驗(yàn)Ⅰ期和試驗(yàn)Ⅱ期連續(xù)測(cè)定奶牛的飼糧采食量。各組奶牛的飼糧等額定量投放。每次飼喂時(shí)，待奶牛停止進(jìn)食后，分別收集奶牛的剩料，將各組剩余飼料稱(chēng)量、記錄。試驗(yàn)期間，每日記錄產(chǎn)奶量。分別于試驗(yàn)Ⅰ期和試驗(yàn)Ⅱ期兩個(gè)階段采集奶樣，分早中晚3次，按4∶3∶3比例混合后，一式兩份分裝，一份加有防腐劑4℃保存用于測(cè)定乳常規(guī)，另一份-20℃保存作備樣。

1.3.2 乳成分和乳中活性蛋白含量的測(cè)定

利用Foss公司Milk ScanTM FT 6000乳成分分析儀對(duì)牛奶中的乳脂率、乳蛋白、乳糖、乳中尿素氮(MUN)和乳中固形物等進(jìn)行測(cè)定；體細(xì)胞數(shù)(SCC)由Fossomat?ic 5000系列體細(xì)胞分析儀完成測(cè)定；用Bethyl公司檢測(cè)試劑盒，運(yùn)用雙抗夾心ELISA法定量測(cè)定牛奶中牛血清蛋白(BSA)、免疫球蛋白(immunoglobulins，Ig)、乳鐵蛋白(lactoferrin，Lf)含量和Cloud-Clone公司ELISA試劑盒測(cè)定溶菌酶(lysozyme，LZM)含量；用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定了α-乳白蛋白(α-Lactoalbumin，α-La)和β-乳球蛋白(β-Lactoblobulin，β-Lg)的含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)由Excel整理后，使用SAS 9.0進(jìn)行分析，其中P＜0.01為差異極顯著評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，P＜0.05為差異顯著評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 牛舍溫度與THI指數(shù)的變化(見(jiàn)圖1)

圖1 試驗(yàn)期THI變化

5～25℃的環(huán)境溫度是奶牛的最適溫度，當(dāng)牛舍溫度高于25℃，或者THI＞72，即引起奶牛的熱應(yīng)激。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)Ⅱ期牛舍溫度超過(guò)奶牛的最適溫度，平均氣溫在33.56～35.84℃。試驗(yàn)Ⅰ期牛舍在8:00、14:00和20:00 THI平均值分別為72、75和74，說(shuō)明試驗(yàn)Ⅰ期奶牛處于輕度熱應(yīng)激狀態(tài)；試驗(yàn)Ⅱ期牛舍在8:00、14:00和20:00 THI平均值分別為87、89和87，說(shuō)明試驗(yàn)Ⅱ期奶牛處于中度熱應(yīng)激狀態(tài)。

2.2 熱應(yīng)激對(duì)泌乳中期奶牛采食量和泌乳量的影響

表3 試驗(yàn)期奶牛生產(chǎn)性能(kg/d)

由表3可知，試驗(yàn)Ⅱ期奶牛采食量極顯著低于試驗(yàn)Ⅰ期采食量(P＜0.01)，平均降低14.63%。試驗(yàn)Ⅱ期奶牛日均產(chǎn)奶量極顯著低于試驗(yàn)Ⅰ期奶牛日均產(chǎn)奶量(P＜0.01)，平均降低了20.06%。

2.3 熱應(yīng)激對(duì)乳品質(zhì)的影響（見(jiàn)表4）

表4 熱應(yīng)激對(duì)乳品質(zhì)的影響

由表4可見(jiàn)，試驗(yàn)Ⅱ期奶牛乳脂率水平顯著低于試驗(yàn)Ⅰ期(P＜0.05)，平均降低了16.28%。雖然與試驗(yàn)Ⅰ期相比試驗(yàn)Ⅱ期沒(méi)有顯著改變?nèi)榈鞍茁?，但試?yàn)Ⅱ期的乳中總蛋白產(chǎn)量極顯著低于試驗(yàn)Ⅰ期(P＜0.01)，平均降低了13.45%。測(cè)定還發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)Ⅱ期在導(dǎo)致乳中總蛋白產(chǎn)量下降的同時(shí)還導(dǎo)致MUN水平極顯著升高(P＜0.01)，平均升高了17.8%。試驗(yàn)Ⅱ期的體細(xì)胞數(shù)顯著高于試驗(yàn)Ⅰ期(P＜0.05)，平均升高了81.7%。乳中其他成分無(wú)顯著性差異。

2.4 熱應(yīng)激對(duì)乳中活性物質(zhì)的影響

表5 熱應(yīng)激條件下乳中活性蛋白含量的變化

由表5可知，試驗(yàn)Ⅱ期奶牛BSA顯著高于試驗(yàn)Ⅰ期(P＜0.05)，試驗(yàn)Ⅱ期奶牛α-La與試驗(yàn)Ⅰ期相比差異極顯著(P＜0.01)。試驗(yàn)Ⅱ期奶牛乳中免疫球蛋白(IgG、IgA和IgM)與試驗(yàn)Ⅰ期相比無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

3 討論

3.1 奶牛熱應(yīng)激時(shí)牛場(chǎng)THI的變化

有研究表明，使用試驗(yàn)當(dāng)天的環(huán)境溫度和環(huán)境濕度對(duì)熱應(yīng)激奶牛生產(chǎn)性能進(jìn)行評(píng)估效果最好。因此，本研究也使用試驗(yàn)當(dāng)天的THI對(duì)熱應(yīng)激奶牛牛奶中乳成分及乳中活性蛋白的變化進(jìn)行評(píng)估。在實(shí)際生產(chǎn)中，THI是評(píng)判奶牛熱應(yīng)激程度的一項(xiàng)重要指標(biāo)，當(dāng)THI低于72時(shí)，奶牛不發(fā)生熱應(yīng)激；當(dāng)THI超過(guò)72時(shí)，表明奶牛發(fā)生熱應(yīng)激。其中，72＜THI≤78說(shuō)明奶牛處于輕度熱應(yīng)激；78＜THI≤88說(shuō)明奶牛處于中度熱應(yīng)激；THI＞88，奶牛發(fā)生嚴(yán)重?zé)釕?yīng)激。而Zimbleman等研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)THI＞68時(shí)高產(chǎn)奶牛已經(jīng)開(kāi)始出現(xiàn)熱應(yīng)激反應(yīng)。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)牛舍相對(duì)溫度和相對(duì)濕度的實(shí)時(shí)測(cè)定，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)Ⅰ期和試驗(yàn)Ⅱ期，牛舍THI均高于72，綜合以上數(shù)據(jù)可知，試驗(yàn)Ⅰ期奶牛處于輕度熱應(yīng)激狀態(tài)，試驗(yàn)Ⅱ期奶牛處于中度熱應(yīng)激狀態(tài)。

3.2 泌乳中期奶牛泌乳量與熱應(yīng)激的關(guān)系

熱應(yīng)激給全球乳業(yè)造成了巨大的損失，具體表現(xiàn)為泌乳量下降所造成的經(jīng)濟(jì)損失。熱應(yīng)激程度越高，泌乳奶牛受熱應(yīng)激的影響越嚴(yán)重。本研究發(fā)現(xiàn)，與輕度熱應(yīng)激時(shí)奶牛的泌乳量相比，熱應(yīng)激中期奶牛的泌乳量會(huì)極顯著下降。由此可見(jiàn)，熱應(yīng)激造成泌乳量損失是巨大的。分析奶牛泌乳量下降的原因，除熱應(yīng)激導(dǎo)致動(dòng)物干物質(zhì)采食量降低外，物質(zhì)代謝、生理變化等綜合效應(yīng)也會(huì)直接/間接導(dǎo)致泌乳量下降。Snachez等、Belya等以及Collier等認(rèn)為，熱應(yīng)激奶牛食欲減退，主要是由于在自由采食的條件下，粗料采食量的下降和精粗料利用率的降低，泌乳奶牛缺少較高的營(yíng)養(yǎng)水平來(lái)維持高產(chǎn)奶量，而且熱應(yīng)激奶牛自身的能量消耗會(huì)明顯增加，處于嚴(yán)重的能量負(fù)平衡狀態(tài)，機(jī)體內(nèi)分泌功能發(fā)生改變，直接影響奶牛的泌乳性能，降低奶牛產(chǎn)奶量。

3.3 泌乳中期奶牛乳品質(zhì)與熱應(yīng)激的關(guān)系

熱應(yīng)激不僅會(huì)降低奶牛的泌乳量，還可導(dǎo)致牛奶中的乳脂率和乳蛋白率等含量下降，降低牛奶品質(zhì)。據(jù)Beede等報(bào)道，奶牛的乳蛋白合成量隨氣溫的升高逐漸降低，高溫與乳脂率、非脂固形物呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.23、-0.61。Ravagnolo等提出，當(dāng)發(fā)生熱應(yīng)激時(shí)，THI每升高1個(gè)單位，乳脂和乳蛋白分別下降12 g和9 g。在本試驗(yàn)中，中度熱應(yīng)激牛奶中乳脂率顯著低于輕度熱應(yīng)激，但乳蛋白率與輕度熱應(yīng)激相比差異不顯著。胰島素-葡萄糖理論認(rèn)為，乳脂合成過(guò)程需要乙酸作為前體物質(zhì)，糖異生需要丙酸作為前體物質(zhì)。熱應(yīng)激奶牛由于攝入較多的高精飼糧，瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生大量丙酸，刺激胰島素分泌，使更多養(yǎng)分用于體組織而不是乳腺組織代謝，最終導(dǎo)致乳脂率降低。有研究認(rèn)為，熱應(yīng)激導(dǎo)致奶牛的乳蛋白含量降低是由于熱應(yīng)激通過(guò)誘導(dǎo)乳腺細(xì)胞的凋亡，減少可用于乳蛋白合成的乳腺細(xì)胞的數(shù)量來(lái)影響乳蛋白的含量和產(chǎn)量。本試驗(yàn)中，中度熱應(yīng)激導(dǎo)致乳中總蛋白產(chǎn)量下降，但乳蛋白率無(wú)顯著變化。

乳中尿素氮屬于非蛋白氮中的一種，尿素是機(jī)體蛋白質(zhì)分解代謝的產(chǎn)物。研究表明：熱應(yīng)激導(dǎo)致奶牛蛋白質(zhì)分解代謝增強(qiáng)。在本試驗(yàn)中，中度熱應(yīng)激期奶牛MUN含量極顯著高于輕度熱應(yīng)激期，這是由于隨著熱應(yīng)激程度加深瘤胃內(nèi)一部分氨合成微生物蛋白的量降低，過(guò)量的氨被瘤胃壁吸收后通過(guò)血液循環(huán)進(jìn)入肝臟用于合成尿素，生成的尿素一部分從尿液中排出，另一部分進(jìn)入血液、體組織和乳中，引起血漿和乳中MUN含量升高。

正常的牛奶中SCC一般在20～30萬(wàn)/ml，超過(guò)此范圍，乳中各種成分發(fā)生變化，從而影響生奶質(zhì)量及乳制品風(fēng)味。熱應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致牛奶SCC增加，引起奶牛產(chǎn)奶量下降。據(jù)報(bào)道，牛奶中SCC在20萬(wàn)/ml的基礎(chǔ)上每增加10萬(wàn)/ml，產(chǎn)奶量損失2.5%。Kelly等發(fā)現(xiàn)，隨著SCC增加，乳中蛋白質(zhì)的組成發(fā)生變化，并且乳蛋白含量減少。本次試驗(yàn)結(jié)果表明，熱應(yīng)激越嚴(yán)重，奶牛乳中SCC越高，總蛋白含量越低。

由以上討論可知，中度熱應(yīng)激會(huì)使得泌乳中期奶牛乳成分出現(xiàn)差異，最終影響牛奶品質(zhì)。

3.4 泌乳中期奶牛乳中活性蛋白與熱應(yīng)激的關(guān)系

乳中活性蛋白包括α-La、β-Lg、IgG、IgA、IgM、Lf及LZM等多種生物活性蛋白。熱應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致牛奶中乳清蛋白發(fā)生變化，影響乳中活性蛋白的含量。Urech報(bào)道，高SCC可使乳中的BSA升高。本試驗(yàn)中，與輕度熱應(yīng)激相比中度熱應(yīng)激奶牛乳中BSA含量顯著升高，這可能是由于熱應(yīng)激導(dǎo)致奶牛SCC升高，破壞了乳腺上皮細(xì)胞的通透性，血-乳滲透性增加，使來(lái)源于血液的BSA等流入，進(jìn)而增加了乳中BSA的含量。α-La在乳腺中乳糖的生物合成上起著輔酶的作用，控制著乳中乳糖的含量，是泌乳的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子。α-La的濃度與乳蛋白、乳脂和乳糖的濃度有關(guān)，乳糖的分泌通過(guò)滲透壓的影響進(jìn)而對(duì)泌乳產(chǎn)生影響。Bernabucci等和Gellrich等發(fā)現(xiàn)，牛奶中α-La的濃度在夏季熱應(yīng)激時(shí)最高。Brodziak等通過(guò)研究不同季節(jié)對(duì)不同品種奶牛乳清蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)荷斯坦奶牛、西蒙塔爾奶牛和娟姍奶牛乳中α-La含量均在夏季熱應(yīng)激時(shí)最高。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)中，度熱應(yīng)激期奶牛乳中α-La含量極顯著高于輕度熱應(yīng)激期。有研究指出：通過(guò)胰島素灌注葡萄糖可以改變血液中血糖濃度，使泌乳調(diào)節(jié)因子α-La含量增加。熱應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致奶牛胰島素升高，進(jìn)而我們推測(cè)熱應(yīng)激可能通過(guò)胰島素濃度升高導(dǎo)致α-La含量增加，其具體的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。關(guān)于熱應(yīng)激對(duì)乳中免疫蛋白(IgG、IgA和IgM)含量的影響，國(guó)內(nèi)外的學(xué)者進(jìn)行了大量的研究。Ramendra和Conesa等認(rèn)為，熱應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致牛奶中IgA、IgG含量減少。然而在本試驗(yàn)中，輕度熱應(yīng)激與中度熱應(yīng)激乳中免疫球蛋白(IgG、IgA和IgM)含量并無(wú)顯著差異。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)中，與輕度熱應(yīng)激相比，中度熱應(yīng)激導(dǎo)致奶牛采食量下降，產(chǎn)奶量下降，導(dǎo)致牛奶中乳成分的變化，乳脂顯著下降，體細(xì)胞數(shù)和乳尿素氮升高。此外，隨著熱應(yīng)激程度的加深，牛奶中BSA、α-La顯著升高。

（參考文獻(xiàn)刊略，需者可函索18612231902@163.com）