熱應(yīng)激對畜禽腸道黏膜屏障功能影響及其損傷修復(fù)研究進(jìn)展

■周加義 高春起 嚴(yán)會超 王修啟

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院廣東省動物營養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東廣州 510642）

腸道是機(jī)體連通外界的媒介，具有消化、吸收營養(yǎng)物質(zhì)及抵御外來病原體和毒素侵襲的雙重作用。腸道黏膜每天會接觸大量有害物質(zhì)，正常情況下，腸道黏膜屏障可有效阻止這些有害物質(zhì)穿過上皮層進(jìn)入機(jī)體內(nèi)其它組織器官和血液循環(huán)，以保證機(jī)體代謝的正常進(jìn)行。

然而，伴隨著集約化條件下畜禽養(yǎng)殖密度的增加及全球氣候逐步變暖，熱應(yīng)激已成為影響畜禽夏季生產(chǎn)性能的重要因素。有研究表明，腸道是應(yīng)激反應(yīng)的中心器官[1]，尤其對熱應(yīng)激極為敏感[2]。當(dāng)畜禽處于持續(xù)高溫下，機(jī)體出于自我保護(hù)的目的，會重分配體內(nèi)血液流量，由此帶來的后果是流經(jīng)胃腸道的血量急劇減少，胃腸道嚴(yán)重缺血缺氧，導(dǎo)致上皮細(xì)胞脫落、壞死，屏障功能被破壞，黏膜通透性增加。此時(shí)病原菌和毒素等便可通過受損的腸道黏膜進(jìn)入血液循環(huán)，引起有害菌的遷移和移位，進(jìn)而誘發(fā)腸炎、敗血癥及多臟器功能衰竭綜合征[3]。

因而尋找可有效緩解熱應(yīng)激對腸道屏障損傷的功能性物質(zhì)，已成為研究者和養(yǎng)殖者亟待解決的難題。目前，研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酰胺、γ-氨基丁酸、纖維寡糖、阿魏酸等功能性物質(zhì)對熱應(yīng)激都有一定程度的緩解功效[4-7]。本文總結(jié)了近年來熱應(yīng)激對腸道屏障功能的影響及其營養(yǎng)調(diào)控的研究進(jìn)展，以為解決這一問題提供思路。

1 熱應(yīng)激對腸道黏膜屏障功能的影響

傳統(tǒng)的腸道黏膜屏障主要指腸黏膜上皮細(xì)胞及其緊密連接等構(gòu)成的機(jī)械屏障。隨著研究的深入，腸道黏膜免疫屏障、化學(xué)屏障和微生物屏障陸續(xù)被揭示。這4種屏障功能（如圖1所示）以完整的腸黏膜上皮、腸道內(nèi)正常菌群、腸道內(nèi)分泌物等為依托，通過不同的分子調(diào)控機(jī)制及信號通路構(gòu)成一個(gè)有機(jī)整體發(fā)揮作用，形成了抵御體外抗原物質(zhì)、有害微生物侵襲的第一道防線。其中最為關(guān)鍵的是腸道黏膜機(jī)械屏障和免疫屏障[7]。

圖1 腸道屏障的組成[8]

目前，評估畜禽腸道黏膜屏障功能的方法主要包括腸道通透性、血漿或血清中內(nèi)毒素、細(xì)菌移位狀況測定，以及腸道黏膜結(jié)構(gòu)觀察等。通過這些指標(biāo)的測定可間接反映腸道黏膜屏障受損情況。特別是腸道黏膜通透性異常與否被認(rèn)為是反映腸道屏障功能最主要的指標(biāo)。

1.1 機(jī)械屏障

腸道上皮細(xì)胞間緊密連接的通透性決定腸黏膜的機(jī)械屏障功能[9]。其中閉合小環(huán)蛋白(ZO)是緊密連接支持結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，閉合蛋白（claudins）為緊密連接的結(jié)構(gòu)骨架[10]。這些緊密連接蛋白分子的密閉程度會因外界刺激而發(fā)生改變[11]。在熱應(yīng)激狀態(tài)下，豬小腸黏膜內(nèi)緊密連接蛋白ZOs和claudins等表達(dá)量降低，并且在黏膜內(nèi)會重新分配和定位[12]，導(dǎo)致腸道緊密連接松弛，上皮內(nèi)組織直接暴露在抗原或細(xì)菌面前（如圖2所示）。

高溫應(yīng)激可使畜禽腸黏膜機(jī)械屏障功能受損，導(dǎo)致腸道通透性增加，腸黏膜中某些組分改變，因此通過測定這些指標(biāo)可間接反映小腸黏膜的緊密連接狀況。有研究者對肉仔雞[13]和生長豬[14]熱應(yīng)激處理后均發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對異硫氰酸熒光素右旋糖酐（FD4）的滲透率增加，跨膜電阻（TER）降低，說明腸道黏膜機(jī)械屏障受到了損傷。此外哺乳動物小腸黏膜絨毛上皮細(xì)胞中特異性表達(dá)的二胺氧化酶（DAO）含量變化也是反映小腸黏膜機(jī)械屏障功能較為理想的指標(biāo)。劉鳳華[15]發(fā)現(xiàn)中國實(shí)驗(yàn)用小型豬高溫刺激10 d后小腸黏膜受損嚴(yán)重，絨毛高度下降，并且黏膜上皮細(xì)胞釋放大量的DAO進(jìn)入血液，使血中DAO含量升高，十二指腸、空腸黏膜中DAO含量顯著下降，說明高溫應(yīng)激引起小腸黏膜組織損傷，導(dǎo)致黏膜機(jī)械屏障被破壞。

圖2 腸道機(jī)械屏障[8]

1.2 免疫屏障

腸道黏膜免疫屏障主要由腸道相關(guān)淋巴樣組織（GALT）、腸系膜淋巴結(jié)（ETC）、分泌型抗體構(gòu)成，其中腸道相關(guān)淋巴樣組織主要包括上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞（IEL）、固有層淋巴細(xì)胞（LPL）和派氏集合淋巴結(jié)（PP）及散布于整個(gè)腸壁中的巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，分泌型抗體的主要成分是免疫球蛋白A（IgA）（如圖3所示），它們通過腸道免疫系統(tǒng)細(xì)胞群的細(xì)胞免疫作用及體液免疫作用保護(hù)腸道免受外來抗原的破壞和異常的免疫應(yīng)答[17]。

圖3 腸道免疫屏障[16]

Toll樣受體（TLRs）作為先天免疫系統(tǒng)中廣泛表達(dá)的免疫蛋白，可激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）和細(xì)胞因子（cytokines）等靶基因參與腸道炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答[18-19]。此外，IEL可通過分泌多種細(xì)胞因子發(fā)揮抗菌、抗毒素作用，在腸道免疫屏障中起到免疫監(jiān)控和免疫防御的作用，而LPL包括B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，可產(chǎn)生大量分泌型抗體或直接吞噬病原體加強(qiáng)腸道黏膜免疫屏障。因此，TLRs表達(dá)水平的高低、腸道內(nèi)免疫細(xì)胞的種類和數(shù)量變化均可用于評價(jià)腸道黏膜免疫屏障情況。Liu等[20]和Deng等[21]研究表明，溫?zé)釕?yīng)激可降低腸道黏膜內(nèi)TLR2和TLR4的表達(dá)，減少回腸IEL等免疫細(xì)胞的數(shù)量，表明熱應(yīng)激能使腸道黏膜免疫屏障功能減弱。張相偉[22]也發(fā)現(xiàn)隨著熱應(yīng)激時(shí)間的延長，雞腸道IEL數(shù)量和分泌型免疫球蛋白A（sIgA）細(xì)胞平均光密度逐漸降低，提示熱應(yīng)激通過減少腸道免疫細(xì)胞的數(shù)量和免疫因子的分泌，進(jìn)而降低動物腸黏膜免疫屏障功能。

熱應(yīng)激還可引發(fā)肉仔雞小腸多灶性淋巴漿細(xì)胞性腸炎，并使感染沙門氏菌肉仔雞的腸道免疫屏障遭到破壞，導(dǎo)致沙門氏菌通過腸道黏膜遷移到脾臟，加重小腸壁炎性浸潤[23]。Niu等[24]在38℃高溫環(huán)境下持續(xù)飼養(yǎng)肉仔雞，同樣發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激可使巨噬細(xì)胞的吞噬能力顯著下降，破壞肉仔雞的腸道免疫屏障。

1.3 化學(xué)屏障

腸道化學(xué)屏障主要由覆蓋在腸上皮細(xì)胞上的含一定數(shù)量微生物的疏松黏液外層和含少量微生物的黏液內(nèi)層組成[25]。腸道分泌的消化液可稀釋毒素，沖洗腸腔，并使致病菌難以黏附或定植于腸上皮。腸道中某些分泌型細(xì)胞，如杯狀細(xì)胞可分泌含糖蛋白和糖脂的黏液，這些成分能使細(xì)菌與糖蛋白和糖脂結(jié)合后隨糞便排出[26]，也有一些細(xì)胞分泌的黏液含有補(bǔ)體成分可增加溶酶菌及免疫球蛋白的抗菌作用。Shi等[27]發(fā)現(xiàn)蛋雞熱應(yīng)激后，小腸絨毛內(nèi)杯狀細(xì)胞的數(shù)量呈下降的趨勢，導(dǎo)致黏液分泌不足，腸道化學(xué)屏障作用減弱。Xue[28]將35日齡蛋雞在高溫條件下飼養(yǎng)1～10 d，結(jié)果顯示，短時(shí)間熱應(yīng)激處理后黏膜中杯狀細(xì)胞數(shù)量增加，但隨著熱應(yīng)激時(shí)間的延長，杯狀細(xì)胞數(shù)量也呈現(xiàn)下降趨勢。此外，小腸絨毛刷狀緣堿性磷酸酶（ALP）可清除腸道有害微生物產(chǎn)生的脂多糖等內(nèi)毒素作用，發(fā)揮腸道黏膜化學(xué)屏障功能[29]。Li等[30]證實(shí)高溫處理蛋雞后ALP活性顯著降低，與Pearce等[31]在豬上的研究結(jié)果相一致。

1.4 微生物屏障

小腸黏膜微生物屏障是由腸道共生菌與宿主形成的相互作用、相互依賴的微生態(tài)平衡系統(tǒng)。這些共生菌參與了腸道中大部分的新陳代謝活動，影響腸上皮細(xì)胞的更新過程，同時(shí)其能在腸道黏膜表面形成一道保護(hù)性的微生物屏障，阻止致病菌在腸上皮細(xì)胞的黏附和定植。

越來越多的證據(jù)表明，腸道微生物對于腸道穩(wěn)態(tài)的維持至關(guān)重要。當(dāng)畜禽處于熱應(yīng)激條件下，腸道菌群結(jié)構(gòu)平衡失調(diào)，微生物系統(tǒng)遭到破壞，有害微生物便開始在腸道中定植[32-33]。Song等[13]和He等[34]均發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激可使肉雞腸道內(nèi)雙歧桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量降低，大腸桿菌、沙門氏菌及莢膜梭菌的數(shù)量增加。此外，Li等[33]通過對高溫處理的蛋雞各腸段微生物區(qū)系進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激對空腸的微生物菌群影響最為明顯。而其在肉雞上的試驗(yàn)則表明熱應(yīng)激條件下回腸中菌群的多樣性較為豐富，隨著熱應(yīng)激的持續(xù)，對回腸的菌群影響較大，共生菌群以外的菌群較為豐富[35]。說明高溫應(yīng)激對功能不同的雞各腸段微生物區(qū)系影響存在差異，但是均會增加腸道外來菌群的種類和數(shù)量。

2 緩解熱應(yīng)激損傷腸道黏膜屏障的營養(yǎng)調(diào)控

熱應(yīng)激破壞腸道黏膜屏障，降低畜禽生產(chǎn)性能，給畜牧業(yè)造成了巨大損失。因此，研究熱應(yīng)激狀態(tài)下畜禽腸道黏膜屏障功能的變化及其緩解措施較為重要。近年來，通過營養(yǎng)調(diào)控措施緩解畜禽熱應(yīng)激取得了較大進(jìn)展，包括補(bǔ)充某些功能性氨基酸、寡糖、微量元素和中草藥飼料調(diào)劑等，均有較好的效果。

2.1 功能性氨基酸

2.1.1 谷氨酰胺

谷氨酰胺是腸上皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞主要的能量來源，可滿足上皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞快速增殖和修復(fù)的需要，充分保證腸道正常發(fā)育。當(dāng)畜禽處于熱應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，內(nèi)源性谷氨酰胺不能滿足機(jī)體需要，額外添加谷氨酰胺對促進(jìn)腸道屏障修復(fù)有一定積極作用[36]。Dai等[37]的研究表明，在熱應(yīng)激組肉雞飼糧中外源添加0.5%和1.0%的谷氨酰胺后，可增加肉雞絨毛高度，緩解腸道結(jié)構(gòu)損傷[37]。康磊等[38-39]研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加谷氨酰胺可顯著提高不同日齡熱應(yīng)激肉雞十二指腸、空腸、回腸黏膜上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的數(shù)量及sIgA含量，降低血液中內(nèi)毒素、白介素-1和腫瘤細(xì)胞壞死因子的含量，可改善熱應(yīng)激肉雞的腸道免疫性能。谷氨酰胺改善熱應(yīng)激條件下家禽黏膜屏障的研究較多，而在豬和反芻動物上的研究較少，具體效果有待研究證實(shí)。

谷氨酰胺可降低熱應(yīng)激引起的腸黏膜通透性變化，維護(hù)腸上皮細(xì)胞的緊密連接結(jié)構(gòu)，進(jìn)而抑制細(xì)菌的入侵，并大幅度增強(qiáng)腸道黏膜免疫性能，提高淋巴細(xì)胞、吞噬細(xì)胞功能[40]。有報(bào)道稱谷氨酰胺是通過PI3K/Akt信號通路來調(diào)控細(xì)胞內(nèi)緊密連接的完整性[41]，進(jìn)而影響到腸道黏膜屏障功能的；也有研究者認(rèn)為其是通過下調(diào)NF-κB信號通路來實(shí)現(xiàn)[42]。

2.1.2 γ-氨基丁酸

γ-氨基丁酸（GABA）是一種天然存在的非蛋白質(zhì)氨基酸，作為哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在的一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有較好的抗應(yīng)激作用。Chen等[43-44]研究表明，熱應(yīng)激可破壞雛雞小腸的正常黏膜組織結(jié)構(gòu)的完整性，降低消化酶活性，減弱腸道黏膜的免疫屏障，而GABA可有效緩解熱應(yīng)激造成的這些損傷，保護(hù)腸黏膜的完整性，并且在一定程度上能促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖，維持小腸黏膜正常的免疫能力。

GABA在熱應(yīng)激情況下對動物腸道正常結(jié)構(gòu)和功能的維持，可能存在兩個(gè)途徑：一方面可能是通過直接轉(zhuǎn)化成谷氨酰胺，進(jìn)而增強(qiáng)腸道黏膜的修復(fù)速度，緩解小腸結(jié)構(gòu)的改變，維護(hù)小腸的物理屏障[45]。另一方面，GABA可能通過促進(jìn)小腸黏膜中白細(xì)胞介素7（IL-7）和分泌型免疫球蛋白A（sIgA）的分泌，進(jìn)而增強(qiáng)腸道免疫屏障的功能[46]。

2.2 功能性寡糖——纖維寡糖

功能性寡糖具有促進(jìn)有益菌增殖、改善腸道菌群、激活機(jī)體免疫系統(tǒng)等多種生理功能，主要包括甘露寡糖、果寡糖、殼寡糖等。纖維寡糖作為一種新型的功能性寡糖，來源豐富，價(jià)格低廉，應(yīng)用前景較好。有研究表明，在熱應(yīng)激處理的肉仔雞飼糧中添加纖維寡糖可降低旁細(xì)胞通路的通透性，緩解熱應(yīng)激造成的腸道黏膜屏障損傷[5]。Xu[47]研究指出，在生長豬飼糧中添加0.2%的纖維寡糖可以提高生長豬的生長性能，刺激結(jié)腸腸道有益菌的增殖并抑制有害菌的增殖，改善結(jié)腸黏膜屏障。此外，Hong等[48]也證實(shí)纖維寡糖可緩解熱應(yīng)激對腸道黏膜屏障功能的損傷，且纖維寡糖與益生菌組合添加效果更好。

2.3 中草藥飼料調(diào)劑

阿魏酸屬酚酸，是阿魏、川芎、當(dāng)歸等中草藥的有效成分之一，具有抗氧化、抗炎、抗癌等多種功效。He等[49]發(fā)現(xiàn)，阿魏酸可有效抑制熱應(yīng)激誘導(dǎo)的小腸黏膜通透性增加，改善熱應(yīng)激誘導(dǎo)的小腸緊密連接結(jié)構(gòu)的破壞，并證實(shí)阿魏酸是通過抑制MAPK和NF-κB信號通路的激活，減少炎性因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β的釋放，從而達(dá)到緩解熱應(yīng)激誘導(dǎo)的腸黏膜屏障損傷的作用。

徐光科[50]研究表明，蕾香、蒼術(shù)等有效成分組成的清涼顆粒可有效調(diào)節(jié)高溫下雞免疫器官中上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞、杯狀細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)熱應(yīng)激小腸黏膜內(nèi)IgA的表達(dá)。劉鳳華[15]研究發(fā)現(xiàn)，清涼顆?？赏ㄟ^減少熱應(yīng)激生長豬小腸上皮結(jié)構(gòu)損傷，加快黏膜上皮細(xì)胞更新與修復(fù)，維持腸道屏障的完整性。同時(shí)，通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，這種抗損傷機(jī)制除了與表皮生長因子/表皮生長因子受體（EGF/EGFR）在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)增加有關(guān)外，還與細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（ERK1/ERK2）介導(dǎo)的信號通道密切相關(guān)。

2.4 其它營養(yǎng)調(diào)控

緩解熱應(yīng)激的營養(yǎng)調(diào)控物質(zhì)種類及數(shù)量繁多，除上面幾種外，還包括一些活性多肽（如EGF）、微量元素（如鋅制劑）、益生元、酶制劑等都有改善腸道屏障功能的作用，但其緩解機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

3 總結(jié)與展望

腸道機(jī)械、免疫、化學(xué)、微生物這4種屏障相互關(guān)聯(lián)、相互滲透，構(gòu)成了腸道黏膜屏障這一有機(jī)整體，保護(hù)機(jī)體不受外來病原菌入侵。高溫作為一種最為常見的環(huán)境應(yīng)激因子之一，對畜禽腸道黏膜屏障的完整性造成了極大破壞。目前，關(guān)于熱應(yīng)激影響腸道黏膜屏障及其通過營養(yǎng)調(diào)控的損傷修復(fù)機(jī)制尚不明確，特別是對參與屏障功能的MAPK、ERK、NF-κB等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程及各信號之間的關(guān)聯(lián)方式均有待進(jìn)一步研究。未來腸道黏膜屏障功能的營養(yǎng)調(diào)控機(jī)制將趨于向多動物類型、多組織器官、多細(xì)胞系和類腸團(tuán)模型相結(jié)合等多層次方向發(fā)展。相信通過深入、系統(tǒng)研究，終將揭開熱應(yīng)激損傷腸道黏膜屏障及其調(diào)控機(jī)制的神秘面紗，從而為動物腸道健康的改善提供科學(xué)依據(jù)。