1，8-萘二甲酰亞胺衍生物NA-17對肝癌細(xì)胞株HepG2的體外抗腫瘤作用研究

吳亦明

(1. 廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣西桂林541006；2. 廣西師范大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，廣西桂林541004)

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1，8-萘二甲酰亞胺衍生物NA-17對肝癌細(xì)胞株HepG2的體外抗腫瘤作用研究

吳亦明

1，李亮萍2，曾淑蘭2，李曉紅2，周祖平1，彭 艷2

(1. 廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣西桂林541006；2. 廣西師范大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，廣西桂林541004)

本文對1，8-萘二甲酰亞胺衍生物NA-17(N-(3,4-亞甲二氧苯乙基)-4-(3-N,N-二甲氨基)丙胺基-1,8-萘二甲酰亞胺)在肝癌細(xì)胞中的抗腫瘤活性進(jìn)行了研究。對多種腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤活性篩選表明NA-17對腫瘤細(xì)胞具有一定的選擇性，其中對肝癌細(xì)胞(HepG2)有較好的抑制效果，但對正常肝細(xì)胞(HL-7702)毒性較低。初步的機(jī)制研究顯示，NA-17通過誘發(fā)HepG2細(xì)胞發(fā)生早期凋亡殺死HepG2細(xì)胞，但對細(xì)胞周期無明顯影響，進(jìn)一步的分子機(jī)制研究表明NA-17通過下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)凋亡蛋白Bak的表達(dá)，從而誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡。

NA-17；細(xì)胞凋亡；HepG2；選擇性抑制；抗腫瘤活性

0 引言

癌癥惡性程度高、易轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)率高、治愈率低，已經(jīng)成為威脅人類健康的頭號殺手[1]。目前，尋找積極有效的癌癥治療方法已經(jīng)成為科研工作者的研究重點(diǎn)，特別是研發(fā)高效、低毒的抗癌藥物尤為重要[2]。肝癌是我國最為常見且致死率很高的惡性腫瘤。肝癌早期癥狀不明顯或無癥狀，當(dāng)出現(xiàn)臨床癥狀時(shí)已是晚期，因此防治形勢十分嚴(yán)峻。現(xiàn)階段治療肝癌的主要手段存在明顯不足，臨床用藥對于肝癌的治療作用不盡如人意，藥效較低，且伴隨著較高的毒副作用。因此，研發(fā)特異性針對肝癌細(xì)胞的高效、低毒抗腫瘤藥物十分重要。

圖1 NA-17結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structure of NA-17

萘酰亞胺類衍生物具有特殊的平面剛性結(jié)構(gòu)[3]，使其擁有較強(qiáng)的嵌入DNA的能力，在抗腫瘤研發(fā)領(lǐng)域備受關(guān)注。美國的Lee及Tarasova研究小組成功合成了pyrrolobenzodiazepine[4]、polyamide hairpin、咪唑并吖啶和萘二甲酰亞胺的復(fù)合物，經(jīng)檢測都表現(xiàn)出很好的抗腫瘤活性。安萘菲特、米托萘胺、依利萘法德和雙萘法德這幾種萘酰亞胺類衍生物已經(jīng)進(jìn)入臨床研究[5]，由此可見萘二甲酰亞胺類衍生物的抗腫瘤活性研究前景良好[6]。

本文研究一種新合成的1，8-萘二甲酰亞胺衍生物NA-17[7](N-(3,4-亞甲二氧苯乙基)-4-(3-N,N-二甲氨基)丙胺基-1,8-萘二甲酰亞胺)(如圖1)對肝癌細(xì)胞HepG2的增殖抑制作用及其作用機(jī)制，為其進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

FACS Aria Ⅱ流式細(xì)胞儀(BD公司)；M1000多功能酶標(biāo)儀(Tecan公司)；114臺式離心機(jī)(Sigma公司)；TH4-200倒置顯微鏡(OLYMPUS)；QL-901振蕩器(海門其林貝爾)；3111 CO2培養(yǎng)箱(Thermo)；ZHJH-C1112B超凈工作臺(CLEAN BENCH)；MLS-3020高壓滅菌鍋(AUTD CLAVE)；IS4000R化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Kodak)；TS-100水平脫色搖床(ORBITAL)；LSM710共聚焦倒置顯微鏡(ZEISS)；DYCZ-24DN電泳儀(北京六一儀器廠)。

DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)；胎牛血清(Gibco公司)；EDTA-胰蛋白酶、噻唑藍(lán)(MTT)、RNAase A(Sigma公司)；PI染料、BCA蛋白濃度測定試劑盒、Hoechst 33258(碧云天)；二甲基亞砜(DMSO)(分析純)(西隴化工)。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和傳代

HepG2細(xì)胞用含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d，用EDTA-胰蛋白酶消化傳代，選取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，每孔180 μL (1×105個(gè)/mL) 細(xì)胞懸浮液接種于96孔板，置于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞完全貼壁后開始加藥。用含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液將NA-17原液稀釋成多個(gè)不同的濃度。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對照組和給藥組，空白組中加入體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液和細(xì)胞，以及體積分?jǐn)?shù)1%的DMSO；給藥組中加入NA-17稀釋液。加樣完畢將96孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，加入20 μL MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，移除上清，每孔加入100 μL DMSO，震蕩5～8 min，在酶標(biāo)儀上檢測490 nm吸光值。利用公式計(jì)算腫瘤細(xì)胞生長抑制率，并通過SPSS軟件計(jì)算其IC50值，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后取平均值。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，每孔400 μL(1×105個(gè)/mL)細(xì)胞接種于6孔板中，置于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞完全貼壁后加入不同濃度的NA-17稀釋液。實(shí)驗(yàn)設(shè)4個(gè)組：空白對照組、1/2 IC50濃度組、IC50濃度組和3/2 IC50濃度組。培養(yǎng)48 h，胰蛋白酶消化細(xì)胞后收集細(xì)胞，用冰PBS清洗2次，加入9 mL 體積分?jǐn)?shù)70%冰乙醇和1 mL冰PBS，吹打均勻，-20 ℃固定過夜。2 000 r/min離心5 min，棄上清液，冰PBS清洗細(xì)胞1～2次，棄PBS洗液，用0.5 mL的50 mg/L RNase懸浮細(xì)胞，置37 ℃水浴30 min后，每組再加入25 μL PI，避光染色5～10 min，上機(jī)檢測。

1.5 Hoechst染色檢測細(xì)胞凋亡

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，每孔400 μL(1×105個(gè)/mL)細(xì)胞接種于6孔板中，置于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞完全貼壁后加入不同濃度的NA-17稀釋液。實(shí)驗(yàn)設(shè)4個(gè)組：空白對照組、1/2 IC50濃度組、IC50濃度組和3/2 IC50濃度組。培養(yǎng)24 h后，吸盡上清液，每孔加入固定液500 μL，固定10 min。棄固定液，用PBS清洗2次，每孔加入500 μL Hoechst 33258染色液染色5 min。移除染色液，用PBS清洗2次，置于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況。

1.6 Western blot檢測蛋白表達(dá)量

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，每孔800 μL(1×106個(gè)/mL)細(xì)胞接種于70 mm培養(yǎng)皿，置于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞完全貼壁后加入不同濃度的NA-17稀釋液。檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)48 h，檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)24 h。用胰蛋白酶消化細(xì)胞后，收集細(xì)胞，用冰PBS清洗細(xì)胞2次，加入200～400 μL 細(xì)胞裂解液(RIPA)，超聲裂解30 min。12 000 r/min，4 ℃離心15 min，小心吸取上清液，移入干凈EP管中。用BCA蛋白定量試劑盒測定提取蛋白的濃度后，每管蛋白提取液按4∶1的體積比加入溴酚藍(lán)蛋白上樣緩沖液，100 ℃沸水中變性5 min。制作質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% SDS-PEGA凝膠，保證每個(gè)泳道中樣品總蛋白量均為30 μg，并加入蛋白Marker，濃縮膠80 V恒壓電泳50 min；分離膠120 V恒壓電泳90 min。依據(jù)所需要檢測的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量切割凝膠，以三明治結(jié)構(gòu)放置轉(zhuǎn)膜夾，250 mA恒流轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間隨蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的不同而改變，相對分子質(zhì)量越大轉(zhuǎn)膜時(shí)間越長。取出PVDF膜后用TBST洗膜2次，每次5 min，放入對應(yīng)一抗稀釋液中，4 ℃孵育過夜。取出PVDF膜用TBST洗膜2次，每次5 min，放入與一抗同源的二抗稀釋液中孵育1～2 h。孵育完畢后用TBST清洗PVDF膜2次，每次5 min，配置曝光液，曝光拍照，分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 NA-17對腫瘤細(xì)胞增殖的影響

設(shè)定給藥濃度為1、5、10、20 μmol/L，處理48 h后，通過MTT法測定OD值，并計(jì)算NA-17作用不同腫瘤細(xì)胞株的抑制率及IC50值。

2.1.1 量效作用關(guān)系

檢測NA-17在不同給藥濃度條件下對腫瘤細(xì)胞的抑制率，繪制NA-17對不同腫瘤細(xì)胞作用的量效濃度曲線(如圖2)。由結(jié)果可以看出，隨著給藥濃度增大，NA-17對HepG2細(xì)胞的增殖表現(xiàn)出顯著的抑制作用，且呈現(xiàn)出較好的腫瘤選擇性。

圖2 NA-17對不同腫瘤細(xì)胞株的抑制率Fig.2 Cell proliferation inhibition effect of NA-17 in different cancer cell lines

2.1.2 NA-17作用腫瘤細(xì)胞株的IC50值

對不同的腫瘤細(xì)胞株進(jìn)行篩選，計(jì)算對應(yīng)的IC50值，并用順鉑(CDDP)處理相同細(xì)胞株作為對照，比較NA-17與順鉑對同種腫瘤細(xì)胞的作用效果差異。如圖3所示，NA-17對肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞抑制作用(IC50=8.18±0.40 μmol/L)與順鉑的作用基本相當(dāng)，但對正常肝臟HL-7702細(xì)胞的毒性(IC50=26.05±1.56 μmol/L)遠(yuǎn)小于順鉑的毒性，并展現(xiàn)出明顯的腫瘤選擇性抑制作用。

圖3 NA-17對不同腫瘤細(xì)胞的IC50值Fig.3 IC50 values of NA-17 in different cancer cell lines

2.2 NA-17對HepG2細(xì)胞周期的影響

細(xì)胞周期是機(jī)體調(diào)控細(xì)胞生長增殖的重要環(huán)節(jié)，如果細(xì)胞周期異常，可能導(dǎo)致細(xì)胞生長停滯或死亡。為了研究NA-17對HepG2細(xì)胞周期的影響，我們對HepG2細(xì)胞用不同濃度的NA-17給藥(4、8、12 μmol/L)處理48 h，收集細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞分析，檢測結(jié)果如圖4、圖5。

圖4 NA-17對HepG2細(xì)胞周期影響Fig.4 Effect of NA-17 on cell cycle distribution in HepG2 cells

圖5 經(jīng)NA-17處理后HepG2細(xì)胞周期變化Fig.5 Change in cell cycly of HepG2 cells afterNA-17 treatment

圖6 NA-17對周期調(diào)控蛋白表達(dá)的影響Fig.6 The effect of NA-17 on cell cycle proteins

由圖4和圖5可知，隨著NA-17給藥濃度的增加，HepG2細(xì)胞周期中處于各個(gè)時(shí)期的細(xì)胞數(shù)量都沒有明顯的變化(如圖5)。這一結(jié)果與分子水平的研究結(jié)果一致(如圖6)，經(jīng)過藥物處理后，周期調(diào)控的相關(guān)蛋白如G1期調(diào)控蛋白CDK4/Cyclin D1[8]、S期調(diào)控蛋白CDK2/Cyclin A2[9]的表達(dá)量都沒有明顯變化，即NA-17對HepG2細(xì)胞周期沒有明顯影響，可見其不是通過引起細(xì)胞周期阻滯的方式發(fā)揮抗腫瘤作用的。

2.3 NA-17對HepG2細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞凋亡亦稱細(xì)胞程序性死亡，是由胞內(nèi)凋亡基因調(diào)控，主動、高度有序、可被調(diào)控的死亡過程，是維持機(jī)體正常的代謝調(diào)控所必需的調(diào)控過程。凋亡大致分為兩大類信號調(diào)控機(jī)制：外源性細(xì)胞凋亡通路(即死亡受體信號通路)和內(nèi)源性細(xì)胞凋亡通路(即線粒體信號通路)[10-12]。為了研究NA-17能否誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，對HepG2細(xì)胞用不同給藥濃度(4、8、12 μmol/L)處理24 h后，用Hoechst 33258進(jìn)行染色，使用激光共聚焦顯微拍照檢測(如圖7)。

圖7 Hoechst 33258染色實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證細(xì)胞凋亡Fig.7 Cell apoptosis identified by Hoechst 33258 staining

圖8 NA-17對Bcl-2家族蛋白表達(dá)的影響Fig.8 The effect of NA-17 on expression of Bcl-2 protein family

熒光顯微鏡下觀察到，經(jīng)Hoechst 33258染色后，空白組HepG2細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)呈正常的藍(lán)色；而經(jīng)過NA-17處理后的HepG2細(xì)胞，隨著給藥濃度的增加，其細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)出現(xiàn)致密濃染、或碎塊化致密濃染的情況愈發(fā)明顯，說明經(jīng)過處理后，HepG2細(xì)胞的染色質(zhì)逐漸皺縮碎裂，細(xì)胞發(fā)生凋亡。因此，證明NA-17能夠誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡。

Western Blot檢測結(jié)果(如圖8)也證實(shí)，隨著加藥濃度的增加，HepG2細(xì)胞內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL表達(dá)量呈一定程度的下降趨勢，促凋亡蛋白Bak表達(dá)量略有上升[13]，NA-17誘發(fā)HepG2細(xì)胞發(fā)生內(nèi)源性細(xì)胞凋亡。

3 討論

本文對1，8-萘二甲酰亞胺衍生物NA-17的生物活性進(jìn)行了初步研究，結(jié)果顯示其對腫瘤細(xì)胞有較好的抑制作用，尤其是對肝癌細(xì)胞(HepG2)有較高的抑制作用，表現(xiàn)出明顯的選擇性抑制。同時(shí)與作為參照的順鉑相比，其對HepG2細(xì)胞的抑制作用與順鉑基本相同，但其對肝臟正常細(xì)胞(HL-7702)毒性明顯小于順鉑，因此有較好的成藥前景。為了探究NA-17抑制HepG2細(xì)胞的作用機(jī)制，我們分別研究了NA-17對細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HepG2細(xì)胞在經(jīng)過NA-17處理后，處于G1期、S期、G2期的細(xì)胞數(shù)量都沒有明顯的變化，同時(shí)Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，關(guān)鍵周期調(diào)控蛋白如Cyclin A2、CDK2、Cyclin D1和CDK4的表達(dá)量均沒有明顯的變化，因此NA-17不是通過周期阻滯的方式來體現(xiàn)其抗腫瘤活性。經(jīng)過Hoechst 33258染色后，隨著加藥濃度的增加，HepG2細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)致密濃染顯著增加，說明細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)逐漸皺縮碎裂，細(xì)胞發(fā)生凋亡，因此能夠確定NA-17能誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡。利用Western Blot方法，檢測到經(jīng)過NA-17處理后，抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL的表達(dá)量呈現(xiàn)下降的趨勢，促凋亡蛋白Bak等的表達(dá)量略有上升。這一結(jié)果有力地證明了NA-17通過線粒體凋亡通路誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡，抑制肝癌細(xì)胞生長增殖。凋亡通路的下游信號通路眾多且相互影響，我們將繼續(xù)深入研究NA-17對其下游信號調(diào)控通路的影響，盡可能全面地闡述NA-17抑制肝癌細(xì)胞(HepG2)的作用機(jī)制。

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(責(zé)任編輯 王龍杰)

The Anti-Tumor Mechanism of 1，8-Naphthalate Formyl Imide Derivative NA-17 in HepG2 Cells

WU Yiming1， LI Liangping2， ZENG Shulan2， LI Xiaohong2， ZHOU Zuping1， PENG Yan2

(1. College of Life Sciences，Guangxi Normal University，Guilin Guangxi 541006，China； 2. College of Chemistry & Pharmaceutical Sciences，Guangxi Normal University，Guilin Guangxi 541004，China)

The antitumor effects of a novel 1，8-naphthalate formyl imide derivative NA-17 in human liver cancer cells was researched. The inhibition effects of NA-17 in various human cancer cell lines showed that NA-17 exhibited highly selective inhibition in human liver cancer cell line HepG2, but with low toxicity to normal hepatic cell HL-7702. Preliminary research indicated that NA-17 induced apoptosis to suppress proliferation in HepG2 cells. Further studies showed that NA-17 induced the increase in the levels of Bak， while the decrease in Bcl-2 and Bcl-xL to trigger cell apoptosis.

NA-17; apoptosis; HepG2; selective inhibition; antineoplastic activity

10.16088/j.issn.1001-6600.2016.03.014

2015-11-24

廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2014GXNSFAA118165，2015GXNSFDA139010)；教育部創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(IRT1225)；廣西醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)人才小高地資助項(xiàng)目(1309，1312，1507)；藥用資源化學(xué)與藥物分子工程省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任基金資助項(xiàng)目(CMEMR2015-A09，CMEMR2014-A11)；廣西研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(JGY2015023)；八桂學(xué)者計(jì)劃資助項(xiàng)目

彭艷(1968—)，女，遼寧錦州人，廣西師范大學(xué)教授，博士。E-mail： pengyan630@gxnu.edu.cn

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-6600(2016)03-0102-07