乙型肝炎病毒X蛋白的優(yōu)勢氨基酸序列與熱點突變位點的生物信息學(xué)分析

王葳，何永剛，浦永蘭，潘少坤,3，謝幼華

1. 復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點實驗室，上海 200032； 2. 太倉市第一人民醫(yī)院感染科，太倉 215400； 3. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔預(yù)防科，上海 200011

·論著·

乙型肝炎病毒X蛋白的優(yōu)勢氨基酸序列與熱點突變位點的生物信息學(xué)分析

王葳1，何永剛1，浦永蘭2，潘少坤1,3，謝幼華1

1. 復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點實驗室，上海 200032； 2. 太倉市第一人民醫(yī)院感染科，太倉 215400； 3. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔預(yù)防科，上海 200011

乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)全長154個氨基酸，與肝癌發(fā)生密切相關(guān)。為確定HBx的優(yōu)勢氨基酸序列和熱點突變位點，在GenBank中下載所有HBx的氨基酸序列13 950條，剔除插入突變、缺失突變和起始密碼子非甲硫氨酸的序列，最后保留7 126條。通過分析這7 126條序列，計算出HBx每個位點的氨基酸分布情況，出現(xiàn)頻率最高的氨基酸為該位點的優(yōu)勢氨基酸，其他氨基酸為突變氨基酸。154個位點的優(yōu)勢氨基酸組成HBx優(yōu)勢氨基酸序列。突變率>10.0%的熱點突變位點有32個。其中第36、42、44、87、88和127位氨基酸有4種(突變率>1.0%)以上突變形式，具有較高的多態(tài)性。與肝癌密切相關(guān)的K130M/V131I雙突變率為34.7%。通過7 126條HBx序列與優(yōu)勢序列的同源性比較，隨機選出其中50條序列(2條與優(yōu)勢序列同源性<75%，48條同源性為76%～99%)，與23條參考序列及優(yōu)勢序列共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。結(jié)果顯示，HBx優(yōu)勢氨基酸序列屬于基因型C，這與基因型C為全球主要流行型一致。本研究首次系統(tǒng)性分析了GenBank中HBx的優(yōu)勢序列，確定了32個HBx熱點突變位點和6個多態(tài)性較高的位點，為基于HBx突變的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。

乙型肝炎病毒X蛋白；熱點突變；優(yōu)勢序列

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染引起的慢性肝炎、肝硬化(liver cirrhosis，LC)和肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球性的公共衛(wèi)生威脅，給患者尤其是發(fā)展中國家的患者帶來沉重負擔[1]。HBV X蛋白(HBV X protein，HBx)全長154個氨基酸，對HBV的感染和復(fù)制極為重要，是HBV誘發(fā)HCC的重要原因之一，且其相關(guān)突變與HCC病情進展密切相關(guān)[2]。HBx的熱點突變位點主要集中在第26～45位氨基酸，其他突變位點較為散發(fā)[3]。HBx基因與核心啟動子(core promoter，Cp)重疊。在Cp區(qū)常見的A1762T/G1764A雙突變可導(dǎo)致HBx突變(K130M/V131I)，與HCC密切相關(guān)[4-5]。因此，研究HBx的熱點突變及頻率有可能為發(fā)現(xiàn)新的HCC相關(guān)突變位點提供依據(jù)和啟示。本研究利用生物信息學(xué)方法系統(tǒng)分析了GenBank中HBx的優(yōu)勢氨基酸序列、點突變發(fā)生率和基因型，為基于HBx突變的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

使用MEGA6、GenBank、Prism 6等軟件。參考序列及基因型(序列號-基因型)如下：X02763.1-A、CAA36231.1-A、AAD40216.1-A、D00329.1-B、AB073846.1-B、BAK32996.1-B、CAA28288.1-C、AAM95244.1-C、BAA32912.1-C、CAA46360.1-D、AAA45504.1-D、CAA59513.1-D、CAA53341.1-E、BAA89320.1-E、CAA49453.1-F、BAB17959.1-F、AAG49731.1-F、AAF34736.1-G、BAB82385.1-G、AAL99435.1-G、AAM09038.1-H、AAM09050.1-H、AAM09062.1-H。

1.2 方法

1.2.1 HBx氨基酸序列的下載和篩選 在GenBank中下載所有HBx的氨基酸序列13 950條。剔除插入突變(>154個氨基酸)和缺失突變(<154個氨基酸)的序列，保留7 148條；再剔除起始氨基酸為非甲硫氨酸(methionine，M)的序列，保留7 128條。通過MEGA中的Align比對，剔除2條同時存在插入突變和缺失突變的長度為154個氨基酸的序列，最終保留7 126條HBx全長序列用于分析。

1.2.2 HBx優(yōu)勢氨基酸序列和熱點突變位點的確定 通過計算得出7 126條HBx全長序列上每個位點的20種氨基酸的出現(xiàn)頻率，指定出現(xiàn)頻率最高的氨基酸為優(yōu)勢氨基酸，其余氨基酸為突變氨基酸，其出現(xiàn)頻繁為該氨基酸的突變率。將每個位點優(yōu)勢氨基酸組成的虛擬序列定義為優(yōu)勢序列。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建 通過對7 126條HBx全長序列與優(yōu)勢序列的同源性比較，得出每條序列與優(yōu)勢序列的同源性關(guān)系。隨機選出與優(yōu)勢序列同源性遞增的50條序列(2條同源性<75%和48條同源性為76%～99%的序列中，每升高1%選擇兩個序列)，與23條參考序列(A～H共8種基因型)和優(yōu)勢序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。使用近鄰結(jié)合法(neighbor-joining，NJ)，并用Bootstraping測試5 000次，其中重復(fù)性>70%者顯示在節(jié)點上。

2 結(jié)果

2.1 HBx氨基酸序列的下載和篩選

為獲得用于分析的HBx氨基酸序列，在GenBank中搜索關(guān)鍵詞HBV X，設(shè)置條件為Protein，得到13 950條序列；剔除>154個氨基酸的序列(n=616)和<154個氨基酸的序列(n=6 186)，得到7 148條序列；再剔除起始氨基酸為非甲硫氨酸的序列(n=20)及同時存在插入和缺失突變的長度為154個氨基酸的序列(n=2)，得到7 126條序列(圖1)，用于后續(xù)分析。

圖1 HBx氨基酸序列篩選流程圖

Fig.1 Flowchart for screening of HBx protein sequences downloaded from GenBank

2.2 HBx優(yōu)勢氨基酸序列的構(gòu)建和熱點突變位點

分析7 126條HBx每一位點上20種氨基酸的出現(xiàn)頻率，指定出現(xiàn)頻率最高的氨基酸為優(yōu)勢氨基酸，將154個優(yōu)勢氨基酸組成的虛擬序列定義為HBx優(yōu)勢序列(圖2)。相對優(yōu)勢序列，除起始氨基酸甲硫氨酸外，將7 126條HBx中第2～154位的每個位點除優(yōu)勢氨基酸以外的其他氨基酸均定義為突變氨基酸，分別計算每個位點的突變率。結(jié)果顯示，就全序列而言，突變率為0.2%～60.6%。其中82個位點的氨基酸突變率<1.0%；24個位點的氨基酸突變率為1.0%～4.9%；15個位點的氨基酸突變率為5.0%～9.9%；11個位點的氨基酸突變率為10.0%～19.9%；8個位點的氨基酸突變率為20.0%～29.9%；5個位點的氨基酸突變率為30.0%～39.9%；5個位點的氨基酸突變率為40.0%～49.9%；1個位點的氨基酸突變率為50.0%～59.9%(第36位為54.2%)；2個位點的氨基酸突變率為60.0%～69.9%(第30位為60.5%、第88位為60.6%)。

Each residue position and deduced dominant amino acid of HBx are displayed in the horizontal coordinate, and the mutation rate in each residue position is displayed in the vertical coordinate.

圖2 HBx優(yōu)勢氨基酸序列和各位點的突變率

Fig.2 Deduced dominant amino acid sequence of HBx and mutation rate in each residue position

HBx氨基酸序列中有32個位點的總突變率>10.0%(表1)。這32個突變位點中，主要突變(單個氨基酸突變率>1.0%)形式只有1個的位點有12個：C6Y、G22S、P33S、L34F、P38S、S39P、S43P、P46S、H94Y、V116L、D119E和K130M；主要突變形式有2個的位點有9個：L5V/M、A12S/T、R26C/S、S31P/A、P40A/S、A47T/S、R78C/Y、V131I/L和S144A/V；主要突變形式有3個的位點有5個：V30L/F/I、H86R/P/S、A102V/G/T、S101P/A/F和K118T/N/A；主要突變形式有4個的位點只有1個：P42S/A/L/T；主要突變形式有5個的位點有4個：A44V/I/G/L/T、V88N/I/F/S/A、T36A/P/D/S/G和I127T/V/S/L/M；主要突變形式有6個的位點只有1個：Q87R/G/H/W/L/M(表2)。

上述HBx熱點突變位點中，K130M/V131I雙突變率為34.7%，K130M單突變率為1.5%，V131I單突變率為3.1%。32個熱點突變位點中，第36、42、44、87、88和127的突變種類在4種以上(突變率>1.0%)，這6個熱點突變位點表現(xiàn)出較高的單氨基酸多態(tài)性。

The relationships of the different amino acid sequences of HBx are indicated by phylogenetic tree constructed using the neighbor-joining (NJ) method, implemented in the MEGA6 package. The phylogenetic tree test is bootstrapped (5 000 replicates). The bootstrap values are shown below or above the branches. Each reference sequence (n=27) is represented by a specific letter, which represents it’s genotype; Each selected sequence (n=50) is represented by a specific number, which represents its homology to HBx dominant sequence. The dominant sequence using “Dominant” instead is marked with black box; HBx sequence in HepaAD38 is marked with black circle.

圖3 HBx優(yōu)勢序列和50條按同源性遞增隨機篩選的序列系統(tǒng)發(fā)生樹

Fig.3 Phylogenetic tree for the dominant HBx and 50 selected HBx sequences based on an increasing homology

2.3 HBx的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系

7 126條HBx氨基酸序列與優(yōu)勢氨基酸序列之間的同源性為54.5%～98.7%。其中同源性<75%有2條(同源性分別為54.5%和57.1%)；75%≤同源性<80%有95條(占1.3%)；80%≤同源性<85%有332條(占4.7%)；85%≤同源性<90%有733條(占10.3%)；90%≤同源性<95%有4 433條(占62.2%)；同源性≥95%有1 531條(占21.5%)。

通過NJ系統(tǒng)發(fā)生樹(圖3)可看出，HBx優(yōu)勢氨基酸序列、基因型C的參考序列與同源性為94%～99%的11條序列歸為一支，屬基因型C；同源性為82%～86%的6條序列與基因型F的參考序列歸為一支，屬基因型F；同源性為81%和84%的2條序列與基因型H的參考序列歸為一支，屬基因型H；同源性為76%～80%的9條序列與基因型G的參考序列歸為一支，屬基因型G；同源性為82%～94%的8條序列與基因型B的參考序列歸為一支，屬基因型B；基因型為86%～93%的7條序列和HepAD38與基因型A和D的參考序列歸為一支，分型不明確；同源性為87%和90%的2條序列介于基因型G與H之間，分型不明確；同源性為57%、64%、77%、81%和83%的5條序列離8種基因型參考序列分支均較遠，分型不明確。

3 討論

HBx相對分子質(zhì)量約為16 500，含154個氨基酸[6]。HBx是一個多功能蛋白，在HBV生活史及HCC的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。HBx具有廣泛的生物學(xué)功能，可通過與多個細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子如活化蛋白1(activator protein 1，AP-1)等作用調(diào)控基因表達，也可與多條信號通路中的關(guān)鍵因子作用而影響細胞周期、細胞凋亡和自吞噬等多個生理過程[7]。最新研究發(fā)現(xiàn)，HBx能結(jié)合Smc5/6并將其帶至溶酶體降解，從而保護病毒基因轉(zhuǎn)錄免受宿主細胞的抑制[8]。

HCC是病死率最高的癌癥之一[9-10]。HBx基因突變與HCC的發(fā)生和進程密切相關(guān)[2]。目前已報道的與HCC相關(guān)的突變位點有V5M(G1386A)、P38S(C1485T)[11]、G50R(G1521C/A)[12]、D80E(G1613A)[13]、H94Y(C1653T)[11,13]、S101P(T1674C)[14]、I127T/N/S(T1753V)[13-14]、K130M(A1762T)和V131I(G1764A)[11,13]。與HCC相關(guān)的雙突變位點有K130M/V131I(A1762T/G1764A)和L30F/S144A[12]，3個位點共突變有V5M/K130M/V131I[11]。未發(fā)現(xiàn)與HCC有明顯相關(guān)性的熱點突變位點有A23T(G1440A)[14]、G31R、G32R(G1467C)[14]、A/P36T(G/C1479A)[14]、S43P和Q87R[12]。

深入研究較多的HCC相關(guān)突變位點是K130M/V131I (A1762T/G1764A)。A1762T/G1764A位于Cp區(qū)，首先在HBV e抗原(HBV e antigen，HBeAg)陰性患者中發(fā)現(xiàn)[15]。該雙突變能抑制HBeAg表達，增強HBV復(fù)制[5]。自然發(fā)生的K130M/V131I雙突變頻率在HCC患者與HBV慢性無癥狀攜帶者(chronic asymptomatic carrier，ASC)、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者和LC患者中存在顯著差異，且隨著病情進展在ASC及CHB、LC、HCC患者中顯著增加，此雙突變可能無須進展至LC就能直接誘發(fā)HCC[5]。

除與基礎(chǔ)核心啟動子區(qū)(basal core promoter, BCP)和EnⅡ重疊外，HBx基因的5′端與聚合酶的RNase H功能域部分重疊，3′端與PreC部分重疊，但HBx基因與這兩個基因的編碼框均不同框。HBx與RNase H重疊部分長250 bp(1374～1623位核苷酸，對應(yīng)HBx的1～84位氨基酸)；與PreC重疊部分長15 bp(1814～1828位核苷酸，對應(yīng)HBx的147～154位氨基酸)。RNase H在HBV復(fù)制過程中主要起負鏈DNA合成時降解pgRNA的作用。目前對RNase H突變的臨床研究較少。細胞水平研究發(fā)現(xiàn)，基因型D的RNase H中D689、R703、E718、D737、D777和R781突變會抑制HBV DNA合成[16]。其中Asp777和Arg781落在與HBx的重疊部分，分別對應(yīng)27～28位和31～32位氨基酸。27～28位氨基酸在HBx上的突變率很低，而31～32位氨基酸在HBx上的突變率相對較高。HBx第26～52位氨基酸的突變率較高，RNase H在此區(qū)域的突變率也較高。RNase H與HBx的編碼框并不相同，在一定程度上可限制RNase H和HBx突變，但兩者可能在此區(qū)域的保守性均較低。PreC/C基因編碼的HBe與HBV建立慢性感染密切相關(guān)。影響HBeAg表達的主要原因為BCP突變(A1762T/G1764A)和基因型依賴的G1896A突變[17]。在PreC中與HBx的重疊部位為1～8位氨基酸，處于信號肽的N端，在HBeAg分泌過程中被切割[18]。HBx第147位氨基酸為脯氨酸(P，CCA)，其對應(yīng)的最后一個堿基為A，單獨A突變?yōu)?47位同義突變，對HBx無影響。HBx第148～154位氨基酸突變率較低，可能因為其與PreC重疊但不同框。

目前研究主要集中在少數(shù)熱點突變位點，尚缺乏對HBx所有位點進行系統(tǒng)的突變研究。本研究從GenBank中篩選到7 126條HBx序列，首次系統(tǒng)分析了HBx的優(yōu)勢氨基酸序列，并對HBx每個氨基酸位點的突變率進行了分析。結(jié)果顯示，熱點突變位點基本與他人研究一致，集中在26～52位氨基酸的反式激活因子區(qū)域(圖2)，主要熱點突變位點有R26C/S、V30L/F/I、S31P/A、P33S、T36A/P/D/S/G、P38S、S39P、P42S/A/L/T、S43P、A44V/I/G/L/T、P46S和A47T/S；其他熱點突變位點相對較為分散，主要有L5V/M、C6Y、A12S/T、G22S、R78C/Y、H86R/P/S、Q87R/G/H/W/L/M、V88N/I/F/S/A、H94Y、S101P/A/F、A102V/G/T、V116L、K118T/N/A、D119E、I127T/V/S/L/M、K130M、V131I/L和S144A/V。其中與HCC密切相關(guān)的K130M/V131I雙突變發(fā)生頻率為34.7%，與其他研究較為吻合[5,11,14]。

HBx第5位優(yōu)勢氨基酸是L，其出現(xiàn)頻率為68.7%，主要突變位點有L5V(24.2%)和L5M(6.9%)；但有報道為V5M突變，且V5M與HCC密切相關(guān)[11]。第30位優(yōu)勢氨基酸為V，其出現(xiàn)頻率為39.5%，主要突變位點有V30L(38.0%)、V30F(19.7%)和V30I(2.7%)；有研究報道為V/L30F突變[14]，認為V和L均為野生型。第36位優(yōu)勢氨基酸為T，其出現(xiàn)頻率為45.8%，主要突變位點有T36A(33.5%)、T36D(6.6%)、T36P(6.6%)、T36S(4.9%)和T36G(17.0%)；有研究報道為A/P36T突變[14]，認為A和P為野生型。上述3個位點中第5位和第36位優(yōu)勢氨基酸的出現(xiàn)頻率比突變頻率顯著高，表明以前認為的野生型可能要做調(diào)整。第30位優(yōu)勢氨基酸的出現(xiàn)頻率(39.5%)與主要突變頻率(38.0%)接近，可認為優(yōu)勢氨基酸有兩種。

HBx第36、42、44、87、88和127位氨基酸的多態(tài)性頻率較高，突變率>1.0%的有T36A/P/D/S/G、P42S/A/L/T、A44V/I/G/L/T、Q87R/G/H/W/L/M、V88N/I/F/S/A和I127T/V/S/L/M，尚無報道。

HBx優(yōu)勢序列及與其同源性較高(94%～99%)的序列歸于基因型C，表明提交到數(shù)據(jù)庫中的序列為基因型C的序列數(shù)量最多，這與國內(nèi)HBV主要流行型為C型和B型[19]及全球主要流行型為C型[20]一致；與HBx優(yōu)勢氨基酸序列同源性較低(76%～86%)的序列歸于流行性較低的F、G和H型。有研究報道，HBV基因型B比基因型C發(fā)生K130M/V131I雙突變的概率低，且HCC患者中HBV基因型C的K130M/V131I雙突變比例比基因型B高[5]。在母嬰垂直傳播研究中發(fā)現(xiàn)，HBV基因型C比基因型B突變更快，更易發(fā)生K130M/V131I雙突變[21]。由此可見，HBV基因型C的K130M/V131I雙突變與HCC相關(guān)性較高，也提示對HBV基因型C的ASC及CHB、LC患者檢測K130M/V131I(A1762T/G1764A)雙突變具有重要意義。

綜上所述，本研究系統(tǒng)性研究了HBx優(yōu)勢氨基酸序列和每個位點氨基酸的突變情況，確定了32個HBx熱點突變位點，首次報道了6個氨基酸多態(tài)性位點，為HBx突變研究及基于HBx突變的臨床診斷與治療奠定了基礎(chǔ)。

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s. PAN Shaokun, E-mail: span10@fudan.edu.cn；XIE Youhua, E-mail: yhxie@fudan.edu.cn

Bioinformatic determination of dominant amino acid sequence and mutation hotspots in hepatitis B virus X protein

WANG Wei1, HE Yonggang1, PU Yonglan2, PAN Shaokun1,3, XIE Youhua1

1.KeyLaboratoryofMedicalMolecularVirologyofMinistriesofEducationandHealth,SchoolofBasicMedicalSciences,FudanUniversity,Shanghai200032,China; 2.DepartmentofInfectiousDiseases,TaicangFirstPeople’sHospital,Taicang215400,China; 3.DepartmentofPreventiveDentistry,ShanghaiNinthPeople’sHospital,ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine,ShanghaiKeyLaboratoryofStomatology,Shanghai200011,China

Hepatitis B virus X protein (HBx), a 154-amino acid protein encoded by hepatitis B virus (HBV), has been implicated in the development of hepatocellular carcinoma (HCC). The aim of the present study is to establish a complete and dominant peptide sequence of HBx. A total of 13 950 HBx protein sequences were retrieved from GenBank. After excluding the non-complete ones that harbor insertions, deletions and non-methionine start amino acid, 7 126 were included in the study. Occurrence frequencies of the 20 amino acids at each position of HBx were calculated. The amino acid with the highest frequency at each position was designated as the dominant amino acid at the position and all the dominant residues constituted the complete and dominant peptide sequence of HBx. All the non-dominant amino acids were taken as the mutants. 32 hotspots with a mutation rate over 10.0% were detected. The positions 36, 42, 44, 87, 88, and 127 showed a higher polymorphism, having more than 4 kinds of mutations with a rate over 1.0%. The K130M/V131I dual mutation, regarded as a high risk factor of HBV-related HCC, showed an occurrence frequency at 34.7% in this study. The homology between the dominant sequence and each of the 7 126 HBx sequences was calculated. 50 sequences, which included 2 sequences with a homology to the dominant below 75% and 48 sequences with a homology between 76%-99%, were chosen for phylogenetic tree construction. The phylogenetic tree with the dominant HBx, 50 selected HBx and 23 reference sequences showed that the dominant HBx belonged to genotype C. This study has systematically constituted a calculated HBx peptide sequence with dominant amino acid at each position, laying the foundation for the basic and applied research on HBx.

Hepatitis B virus X protein; Mutation hotspot; Dominant sequence

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(2012CB519002)

潘少坤，謝幼華

2016-04-05)