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    精脒對SW620細胞增殖及糖酵解的影響

    2017-01-05 08:19:49張芬吳燕燕臧林泉潘雪刁王桂香
    廣東藥科大學(xué)學(xué)報 2016年6期
    關(guān)鍵詞:糖酵解乳酸結(jié)腸癌

    張芬,吳燕燕,臧林泉,潘雪刁,王桂香

    (廣東藥科大學(xué) 藥科學(xué)院,廣東 廣州 510006)

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    精脒對SW620細胞增殖及糖酵解的影響

    張芬,吳燕燕,臧林泉,潘雪刁,王桂香

    (廣東藥科大學(xué) 藥科學(xué)院,廣東 廣州 510006)

    目的 探討精脒對人結(jié)腸癌SW620細胞增殖及糖酵解的影響。方法 以SW620細胞為研究對象,用0.625~2.5 μmoL/L精脒(SPD)作用于細胞,細胞密度以104個/mL接種于96孔培養(yǎng)板,分別培養(yǎng)24 h后,MTT法檢測細胞增殖情況;同時,取6孔板培養(yǎng)24 h的細胞上清液,用試劑盒檢測SW620細胞葡萄糖消耗及乳酸水平;細胞密度以1.2×105個/mL接種于6孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng)24 h后加入不同濃度SPD,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,Western blot檢測缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)、乳酸脫氫酶(LDHA)及葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1(GLUT1)表達的變化。結(jié)果 與對照組比較,精脒各濃度組均能促進SW620細胞的增殖(P<0.01),且促進作用呈劑量依賴性;精脒各濃度組作用后SW620細胞內(nèi)葡萄糖的消耗及乳酸含量明顯增多(P<0.01),呈劑量依賴性;與對照組比較,LDHA、HIF-1及GLUT1蛋白表達水平隨著精脒濃度的升高而增加(P<0.01),且呈劑量依賴性。結(jié)論 精脒具有促進人結(jié)腸癌SW620細胞增殖及糖酵解的作用。

    精脒; SW620細胞; 細胞增殖; 糖酵解

    結(jié)腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一,在全球惡性腫瘤的發(fā)生率和死亡率中,已躋身前3位,嚴(yán)重威脅到人類的健康[1]。對于細胞來說,能量主要來源于糖代謝。正常組織中大約有90%的ATP來源于線粒體的氧化磷酸化途徑,只有10%的ATP來源于糖酵解途徑。與之相反的是,腫瘤細胞中大約有50%的ATP是通過糖酵解途徑合成的,而且即便是在有氧環(huán)境中,腫瘤細胞仍然偏好通過糖酵解途徑提供能量并生成乳酸,這被稱為瓦伯格效應(yīng)(Warburg effect)[2]。

    腫瘤組織細胞通過缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia inducible factor 1,HIF-1)表達和轉(zhuǎn)錄活性的增強對其下游基因進行調(diào)控,改變腫瘤細胞內(nèi)葡萄糖轉(zhuǎn)換、新陳代謝、血管生成和細胞壽命[3],受HIF-1調(diào)控的糖酵解相關(guān)基因包括葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1(GLUT1)、乳酸脫氫酶A(LDHA)[4]等。腫瘤細胞內(nèi)HIF-1α蛋白水平的調(diào)控除了受到環(huán)境氧濃度影響外還存在其他調(diào)控機制,如c-myc能夠促進HIF-1α蛋白表達、減少降解或激活其轉(zhuǎn)錄活性而影響糖酵解。

    多胺是哺乳動物細胞中的一類帶正電的烷基胺類小分子,包括腐胺(Putrescine,Pu)、精脒(Spermidine,SPD)和精胺(Spermine,Sm)。鳥氨酸脫羧酶(ODC)是多胺合成限速酶,同時ODC是致癌基因c-myc的靶基因,研究表明c-myc能夠通過促進ODC的表達促進細胞的增殖[5]。由于多胺促進腫瘤細胞快速增殖的過程中勢必會造成腫瘤細胞內(nèi)部缺氧,而多胺同樣受c-myc的調(diào)節(jié),多胺是否參與腫瘤細胞的糖酵解值得探討。本實驗以人結(jié)腸癌細胞SW620為模型,探討精脒對SW620細胞增殖及糖酵解的影響,為初步闡述多胺影響SW620結(jié)腸癌細胞糖酵解的機制提供依據(jù)。

    1 材料

    1.1 細胞、藥物與試劑

    SW620人結(jié)腸癌細胞(美國ATCC公司);SPD(美國Sigma,Lot:BCBK3554V);Anti-GLUT1、Anti-LDHA、Anti-HIF、ACTIN(Abcam公司);乳酸檢測試劑盒(南京建成生物工程公司);MTT(GENVIEW,Lot:3911020250);H-DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司);葡萄糖檢測試劑盒(上海榮盛生物藥業(yè)有限公司);羊抗兔二抗、羊抗小鼠二抗(杭州華安生物技術(shù)有限公司);PVDF膜(美國Millipore公司);其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.2 儀器

    3111型恒溫CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司);680型酶標(biāo)儀(美國BIO-RAD公司); TD5K-Ⅱ型臺式低速離心機(長沙東旺實驗儀器有限公司);Multiskan FC型酶標(biāo)儀、冷凍型多功能離心機(美國Thermo公司);SW-CJ-1FD型潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)。

    2 方法

    2.1 細胞株及細胞培養(yǎng)

    SW620人結(jié)腸癌細胞培養(yǎng)于含10%(φ)FBS的H-DMEM高糖培養(yǎng)基中,于37 ℃ 、5%CO2(φ)細胞培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng),細胞培養(yǎng)至12代時用于實驗。

    2.2 細胞增殖率檢測

    取對數(shù)生長期SW620細胞以104個/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板中,分為空白組(不含細胞)、對照組(Control)、SPD(0.625、1.25、2.5 μmoL/L)組,共5組,每組設(shè)5個平行孔。24 h后,棄去培養(yǎng)液,給藥組加入含不同濃度的藥物(空白組和Control加入無血清培養(yǎng)基),繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,每孔加入20 μL MTT溶液,避光,繼續(xù)放入37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h;終止培養(yǎng),小心吸棄孔內(nèi)的培養(yǎng)液,加入150 μL DMSO溶液,搖床上振蕩10 min,使結(jié)晶充分溶解;酶標(biāo)儀490 nm處測各孔吸光度A值。

    細胞增殖率=(對照組A-給藥組A)/(對照組A-空白組A)×100%

    2.3 SPD對細胞攝取葡萄糖的影響

    取對數(shù)生長期SW620細胞鋪于6孔板中,分組同“2.2”,培養(yǎng)24 h后取上清液,加入各濃度SPD,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,用葡萄糖檢測試劑盒檢測,計算各組細胞的葡萄糖消耗量。按說明書要求,將工作液混合均勻,置于37 ℃溫浴15 min,在波長505 nm 處,以空白調(diào)零,讀取標(biāo)準(zhǔn)管和樣品管的吸光值:標(biāo)準(zhǔn)品濃度為5.55 mmol/L,計算各組細胞的葡萄糖消耗量。

    葡萄糖(mmol/L)=樣品管吸光值(A)×標(biāo)準(zhǔn)液濃度/標(biāo)準(zhǔn)管吸光值(A)

    2.4 細胞乳酸含量的檢測

    取對數(shù)生長期SW620細胞鋪至6孔板中,分組同“2.2”,培養(yǎng)24 h后,加入各濃度SPD,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,用PBS清洗2次后,將培養(yǎng)板置于冰上,裂解液裂解,12 000 r/min離心10 min,取上清,用試劑盒檢測乳酸含量,以空白組調(diào)零,在530 nm處檢測吸光值(A)。

    乳酸含量(mmol/L)=(樣品A值/標(biāo)準(zhǔn)品A值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(3 mmol/L)

    2.5 HIF-1、LDHA、GLUT1蛋白表達的檢測

    取對數(shù)生長期SW620細胞以1.2×105個/mL密度接種于6孔培養(yǎng)板中,分為對照組、SPD(0.625、1.25、2.5 μmol/L)組,24 h后,棄去培養(yǎng)液,給藥組加入含不同濃度的藥物,對照組加入等量無血清培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,收集細胞,提取細胞總蛋白,BCA法進行總蛋白定量,電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,顯影及定影。用WO-9413B 型凝膠成像系統(tǒng)自帶軟件Gelpro 32分析膠片中的蛋白條帶,以各組灰度面積的乘積/內(nèi)參(β-actin)灰度面積的乘積反映相對蛋白表達豐度。

    2.6 統(tǒng)計學(xué)處理

    3 結(jié)果

    3.1 SPD對SW620細胞增殖的影響

    細胞培養(yǎng)24 h,與對照組比較,不同濃度的SPD作用于SW620細胞后,能明顯促進細胞的增殖,且隨著SPD濃度增大,其促進作用越明顯(P<0.01),呈劑量依賴性,見表1。

    表1 不同濃度SPD對SW620細胞增殖的影響

    組別劑量/(μmoL·L-1)A值細胞增殖率/%對照組-1.168±0.017-SPD0.6251.351±0.003**15.901.251.441±0.002**23.602.51.542±0.003**32.28

    與對照組比較:**P<0.01。

    3.2 SPD對SW620細胞葡萄糖消耗和乳酸含量的影響

    不同濃度SPD作用于SW620細胞24 h后,SW620細胞的葡萄糖消耗量和乳酸含量明顯增加,與對照組比較,P<0.01,且隨著SPD濃度增加,細胞產(chǎn)生的乳酸含量也越高,其促進葡萄糖消耗的作用也增強,呈劑量依賴性,見表2。

    3.3 SPD對SW620細胞糖酵解相關(guān)蛋白表達的影響

    結(jié)果見圖1,不同藥物處理24 h后,對照組HIF-1、LDHA 和GLUT1蛋白表達量明顯低于SPD各濃度組,加入不同濃度SPD后,SW620細胞中HIF-1、LDHA和GLUT1各組的條帶顏色均比對照組深(見圖1A)。對條帶的灰度值進行統(tǒng)計學(xué)分析,隨著SPD濃度增加,3種蛋白表達水平也逐漸升高,且呈劑量依賴性,其中2.5 μmoL/L的SPD作用效果最明顯,與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見圖1B~D。提示SPD可通過促進糖酵解相關(guān)基因HIF-1、LDHA 和GLUT1的蛋白表達從而促進SW620 細胞糖酵解。

    表2 不同濃度SPD對SW620細胞葡萄糖消耗及乳酸含量的影響

    組別劑量/(μmoL·L-1)葡萄糖消耗量/(mmol·L-1)乳酸含量/(mmol·L-1)對照組-5.428±0.0055.331±0.007SPD0.6255.731±0.007**6.176±0.009**1.256.915±0.007**7.215±0.012**2.57.503±0.003**7.665±0.012**

    與對照組比較:**P<0.01。

    4 討論

    多胺是調(diào)節(jié)細胞生長、發(fā)育和促進組織創(chuàng)傷愈合的細胞信號分子,是細胞生長和分化過程中不可缺少的物質(zhì),在快速增殖的組織細胞內(nèi)多伴有多胺含量的增加,其在腫瘤患者的體液及尿液中的含量明顯升高,已成為腫瘤的標(biāo)志物[6]。ODC為多胺合成的限速酶,在許多上皮組織相關(guān)癌癥如結(jié)腸癌和皮膚癌等的發(fā)生過程中,多胺濃度和多胺合成限速酶ODC表達顯著增加[7-8]。同時ODC是致癌基因c-myc的靶基因,c-myc水平增加時,ODC基因啟動子可與Myc/Max轉(zhuǎn)錄復(fù)合物結(jié)合,從而使ODC水平的增加,促進腫瘤細胞的增殖[9-10]。

    研究發(fā)現(xiàn),病理條件下如腫瘤環(huán)境中,缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)和c-myc有協(xié)同作用,c-myc在常氧和乏氧條件下都可以促進HIF-1α的蛋白表達[11]。HIF-1是缺氧條件下廣泛存在于哺乳動物和人體內(nèi)的一種轉(zhuǎn)錄因子,在大多數(shù)腫瘤組織及其轉(zhuǎn)移灶中高表達,且在缺氧誘導(dǎo)的基因表達調(diào)節(jié)中起著核心作用[12]。惡性腫瘤的最主要特征是腫瘤細胞難以控制的生長,腫瘤細胞數(shù)不斷增加導(dǎo)致細胞內(nèi)供氧不定,造成癌組織內(nèi)乏氧微環(huán)境的形成,進而導(dǎo)致HIF表達的增多。同時研究發(fā)現(xiàn)HIF-1可激活或誘導(dǎo)其下游靶基因如GLUT-1、LDHA、血管內(nèi)皮生長因子等的表達[13],以提高葡萄糖轉(zhuǎn)運、糖酵解及血管生成,使腫瘤適應(yīng)缺氧環(huán)境而繼續(xù)增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移。一方面GLUT-1是目前已知體內(nèi)分布最為廣泛的葡萄糖轉(zhuǎn)運體,是調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運的主要因子[14],HIF-1表達增加,激活葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白基因如GLUT1表達,促進糖代謝,從而滿足腫瘤生長的能量需求。另一方面,糖代謝途徑表明,一旦機體處于低氧代謝狀態(tài),其無氧酵解就相對活躍,LDHA是無氧酵解中

    A.各組條帶; B. HIF-1和β-actin 蛋白表達比值; C. LDHA和β-actin 蛋白表達比值; D. GLUT1和β-actin 蛋白表達比值。

    與對照組比較:**P<0.01。

    圖1 不同濃度SPD對SW620細胞HIF-1、LDHA和GLUT1蛋白表達的影響

    Figure 1 Effect of different concentrations of SPD on the expression of HIF-1,LDHA and GLUT1 in SW620 cells

    一個重要酶系,據(jù)報道,胃癌患者組織中的的LDHA明顯高于普通人[15],同時HIF-1能夠調(diào)控LDHA基因的表達,且致癌基因c-myc能結(jié)合并激活LDHA啟動子,導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄水平的增高和促進乳酸的形成[16-17]。

    本實驗結(jié)果表明,SPD能夠明顯促進SW620細胞的增殖及葡萄糖的消耗,隨著SPD的濃度升高,其促進作用越明顯,且呈劑量依賴性。同時,各濃度的SPD均能夠明顯增加細胞中乳酸含量,促進HIF-1、GLUT1及LDHA蛋白水平的表達,且隨著精脒濃度越高,其促進作用越明顯,呈劑量依賴性。結(jié)合c-myc可激活ODC的表達從而促進多胺的生成,而c-myc同樣可以促進HIF-1α蛋白表達的理論依據(jù),筆者認(rèn)為多胺能夠通過促進HIF-1基因的表達,從而促進糖酵解過程,加快腫瘤細胞的增殖。

    結(jié)腸癌是我國常見的消化道惡性腫瘤,其發(fā)病率呈逐年上升趨勢,本實驗通過多胺對HIF-1等糖酵解相關(guān)基因的影響的初步探討,能夠為從體外控制多胺的攝入從而控制腫瘤的發(fā)展提供了一個方向,也為結(jié)腸癌的預(yù)防及治療提供新的思路。但多胺對在c-myc水平增加誘導(dǎo)HIF-1α蛋白上調(diào)、促進糖酵解的作用機理還有待于進一步研究。

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    (責(zé)任編輯:幸建華)

    Effect of spermidine on the growth and glycolysis of SW620 cells

    ZHANG Fen,WU Yanyan,ZANG Linquan,PAN Xuediao,WANG Guixiang

    (CollegeofPharmacy,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China)

    Objective To investigate the effect of spermidine (SPD) on the growth and glycolysis of SW620 cells. Methods SW620 cells were culturedinvitroroutinely with different concentrations (0.625-2.5 μmol/L). Cell proliferation was detected by MTT. Glucose consumption and lactate concentrations were detected by test kit. The expression of HIF-1,LDHA and GLUT1 was detected by western blot. Results Compared with the control group,SPD promoted the proliferation of SW620 cells (P<0.01). SPD with different concentrations increased the glucose consumption and lactate concentrations in SW620 cells (P<0.01). Meantime,the expression of HIF-1,LDHA and GLUT1 was increased with the increased concentrations of SPD (P<0.01). Conclusion SPD could promote the proliferation and glycolysis of SW620 cells.

    SPD; SW620cell; cell proliferation; glycolysis

    2016-09-13

    國家自然科學(xué)基金項目(81302895;81102465)

    張芬(1990—),女,2014級碩士研究生,Email:1083920874@qq.com;通信作者:王桂香(1975—),女,副教授,主要從事藥理學(xué)研究,Email:wgx306 @qq.com。

    時間:2016-12-12 11:28

    http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20161212.1128.001.html

    R965

    A

    1006-8783(2016)06-0767-04

    10.16809/j.cnki.1006-8783.2016091307

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