刺五加多糖對(duì)白痢仔豬糞便大腸桿菌的抑菌效果研究

韓 杰，周子琳，許人驥

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866；2.中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè)總站，北京 100012）

刺五加多糖對(duì)白痢仔豬糞便大腸桿菌的抑菌效果研究

韓 杰1，周子琳1，許人驥2*

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866；2.中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè)總站，北京 100012）

本試驗(yàn)采用紙片試驗(yàn)法研究了刺五加多糖（ASPS）對(duì)黃白痢仔豬糞便中大腸桿菌的抑制作用。結(jié)果表明，ASPS對(duì)白痢仔豬糞便大腸桿菌有一定的抑制作用，640 mg/mL ASPS對(duì)大腸桿菌的抑制效果最明顯，最小抑菌濃度（MIC）為160 mg/mL。與氧氟沙星抑菌活性比較發(fā)現(xiàn)，160、320和640 mg/mL ASPS的抑菌能力分別約為氧氟沙星的30.65%、32.26%和35.28%。

刺五加多糖；仔豬；大腸桿菌；抑菌活性

仔豬白痢是由致病性大腸桿菌引起新生仔豬的一種急性傳染病，多發(fā)于一月齡的仔豬，發(fā)病率與死亡率相對(duì)較低，但會(huì)對(duì)仔豬的生長(zhǎng)與發(fā)育造成嚴(yán)重的影響[1]。刺五加（Acanthopanax senticosus）又名西伯利亞人參、五加參、南五加皮和刺拐棒等，主要分布于我國(guó)的東北、華北地區(qū)和俄羅斯、朝鮮、日本等地[2]。其中，刺五加多糖（ASPS）是刺五加活性成分中含量最高、作用最廣泛的功能因子之一[3]。以往研究已經(jīng)表明，刺五加多糖具有調(diào)節(jié)斷奶仔豬腸道微生物區(qū)系的作用[4]。但關(guān)于應(yīng)用ASPS對(duì)仔豬白痢的影響研究還未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)研究ASPS對(duì)白痢仔豬糞便大腸桿菌的抑制作用，為應(yīng)用ASPS預(yù)防和治療仔豬白痢提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1 白痢仔豬糞便 采自某豬場(chǎng)。

1.1.2 ASPS 采用水提醇沉法，將刺五加根置于55℃烘箱干燥、粉碎、過(guò)篩。取過(guò)篩后的刺五加根粉加蒸餾水煮沸3 h，重復(fù)提取3次，離心，合并上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至1:1，然后在濃縮液中加入等體積10%三氯乙酸，反復(fù)震蕩，離心，加入3倍體積80%乙醇加熱攪拌提取2次，每次1 h，離心，合并兩次的沉淀物用丙酮洗滌，沉淀物經(jīng)凍干后得到棕色粗ASPS。將ASPS粗品純化，用苯酚-硫酸法分析ASPS含量為92.7%。

1.1.3 鹽酸左氧氟沙星 由常州華生制藥有限公司生產(chǎn)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備 牛肉膏培養(yǎng)基：取2.5 g牛肉膏、5 g蛋白胨、2.5 g氯化鈉和10 g瓊脂，用500 mL水稀釋并加熱煮沸至瓊脂完全溶解，用10%氫氧化鈉溶液或10%鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至7.2～7.6，并于121℃高壓滅菌20 min，備用。

肉湯培養(yǎng)基：取0.5 g牛肉膏、1 g蛋白胨、0.5g氯化鈉，用100 mL水稀釋并加熱煮沸完全溶解，用10%氫氧化鈉溶液或10%鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至7.2～7.6，并于121℃高壓滅菌20 min，備用。

1.2.2 白痢仔豬糞便中大腸桿菌的分離培養(yǎng)和鑒定用滅菌棉簽沾取白痢仔豬糞便，分別放入含5 mL肉湯培養(yǎng)基的試管中，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。制作麥康凱培養(yǎng)基，將上述活化24 h后的試管取出，接種在麥康凱培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h，在麥康凱培養(yǎng)基上選出大腸桿菌菌群，接種在牛肉膏培養(yǎng)基上培養(yǎng)。之后利用糖發(fā)酵管生化試驗(yàn)鑒定大腸桿菌，將在牛肉膏培養(yǎng)基上培養(yǎng)的大腸桿菌接種在糖發(fā)酵管中培養(yǎng)24 h，如果使葡萄糖，乳糖產(chǎn)氣，并由紫色變成色，即可以鑒定為大腸桿菌。

1.2.3 刺五加多糖最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定 采用平板劃線法。在培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)細(xì)菌。配制100 mg/mL的ASPS溶液，用兩倍法稀釋ASPS溶液濃度，形成10、20、40、80、160、320、640 mg/mL等7個(gè)濃度梯度。采用濾紙片法，將浸泡于ASPS溶液中2 h的直徑為6 mm的滅菌濾紙片均勻放置于平板上，每平板放6片。然后將細(xì)菌平板置37℃培養(yǎng)24 h。

1.2.4 刺五加多糖的抑菌效果測(cè)定 采用與上述1.2.3相同的濾紙片法，測(cè)定各濃度ASPS的抑菌效果。游標(biāo)卡尺測(cè)定抑菌圈直徑的大小，重復(fù)3次。

1.2.5 左氧氟沙星溶液對(duì)各種供試菌的抑菌效果配制1 mg/mL左氧氟沙星溶液。測(cè)定左氧氟沙星對(duì)各供試細(xì)菌的抑菌效果。無(wú)菌水做參照。方法同于1.2.4。

1.3數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2003初步整理，然后利用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件中的單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”，P＜0.05時(shí)確定為差異顯著。

表1 刺五加多糖對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度Table1 Minimum inhibitory concentration of Acanthopanax senticosus polysaccharide on fecal escherichia coli

2 結(jié)果與分析

2.1刺五加多糖對(duì)大腸桿菌最小抑菌濃度（MMIICC）的測(cè)定用二倍法稀釋多糖溶液，通過(guò)對(duì)抑菌圈直徑大小的變化測(cè)定ASPS的最小抑菌濃度。抑菌圈直徑為≤6 mm、6～8 mm、8～10 mm、≥10 mm依次用“-”、“+”、“++”、“+++”表示[5]。結(jié)果顯示，ASPS對(duì)白痢仔豬大腸桿菌的MIC為160 mg/mL，640 mg/mL ASPS對(duì)大腸桿菌的抑菌效果最明顯。

2.2刺五加多糖與氧氟沙星對(duì)大腸桿菌的抑菌效果比較以抑菌圈的有無(wú)及直徑大小為ASPS抑菌效果的測(cè)定指標(biāo)，ASPS對(duì)白痢仔豬大腸桿菌的抑菌效果見(jiàn)表2。

表2 刺五加多糖與氧氟沙星對(duì)大腸桿菌的抑菌直徑（mm）Table2 Inhibitory diameter of Acanthopanax senticosus polysaccharide and levofloxacin on fecal escherichia coli

在有抑菌作用的160、320和640 mg/mL ASPS中，640 mg/mL ASPS對(duì)大腸桿菌的抑菌直徑最大，160 mg/mL ASPS對(duì)大腸桿菌的抑菌直徑最小，其抑菌效果隨著多糖濃度的升高而增強(qiáng)，即多糖濃度與抑菌效果呈正相關(guān)。

左氧氟沙星對(duì)大腸桿菌有較強(qiáng)的抑菌效果，160、320和640 mg/mL ASPS對(duì)白痢仔豬糞便大腸桿菌抑菌直徑與左氧氟沙星的抑菌直徑相比差異均不顯著（P＞0.05），但640 mg/mL ASPS的抑菌直徑比160和320 mg/mL ASPS的抑菌直徑顯著增加（P＜0.05）。將不同濃度的ASPS與1 mg/mL氧氟沙星的抑菌效果進(jìn)行比較，氧氟沙星的抑菌效果顯著高于不同濃度的ASPS的抑菌效果（P＜0.05）。160、320和640 mg/mL ASPS的抑菌效果分別為氧氟沙星的30.65%、32.26%和35.28%，說(shuō)明ASPS的抑菌效果雖不及氧氟沙星，但也具有較為明顯的抑菌效果。

3 討論

多糖類物質(zhì)是所有生命有機(jī)體的重要組成部分，是生物體內(nèi)除核酸和蛋白質(zhì)以外的又一類重要的生物大分子[6]。本試驗(yàn)中使用的ASPS是采用水提醇沉法從刺五加根中提取的活性物質(zhì)，該法能最大程度的保護(hù)ASPS結(jié)構(gòu)的完整性和活性。以往的研究表明，ASPS是具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性的刺五加水提物[7]；同時(shí)，很多研究也已經(jīng)表明刺五加水提物能調(diào)節(jié)畜禽腸道內(nèi)的微生物的種群和數(shù)量。如刺五加水提物能增加斷奶仔豬腸道乳酸桿菌、雙歧桿菌等有益微生物數(shù)量，減少大腸桿菌等有害微生物數(shù)量[8]；還能促進(jìn)犢牛消化道內(nèi)乳酸桿菌的繁殖[9]；飼料添加800 mg/kg ASPS能顯著提高斷奶仔豬糞便乳酸桿菌數(shù)量，降低大腸桿菌數(shù)量，對(duì)免疫應(yīng)激仔豬糞便的上述菌株也具有相似的影響效果[10]。有報(bào)道指出，多糖調(diào)節(jié)動(dòng)物體腸道內(nèi)微生物種群的作用可能與其作為有益菌的生長(zhǎng)的底物促進(jìn)乳酸桿菌生長(zhǎng)，從而競(jìng)爭(zhēng)性抑制大腸桿菌的增殖，進(jìn)而改善仔豬腸道微生態(tài)平衡的有關(guān)[11]。

本試驗(yàn)對(duì)ASPS在體外對(duì)白痢仔豬糞便大腸桿菌的抑菌效果進(jìn)行了研究發(fā)現(xiàn)，ASPS對(duì)白痢仔豬糞便大腸桿菌有一定的抑制作用，當(dāng)ASPS濃度為160 mg/mL即有抑菌功能，當(dāng)濃度升高至640 mg/mL時(shí)抑菌效果最好。與氧氟沙星的抑菌效果比較發(fā)現(xiàn)，640 mg/mL ASPS的抑菌功能約為氧氟沙星的1/2.9。刺五加是我國(guó)傳統(tǒng)中草藥，具有安全、無(wú)毒副作用的特點(diǎn)，與作為抗生素的氧氟沙星相比，在畜禽生產(chǎn)中使用對(duì)人體無(wú)毒副作用，不存在細(xì)菌耐藥性等問(wèn)題，本研究為ASPS在畜禽生產(chǎn)中預(yù)防和治療仔豬白痢提供了試驗(yàn)依據(jù)。

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Research on bacteriostatic efficacy of Acanthopanax senticosus polysaccharide on fecal escherichia coli in piglets with pullorum disease

Han Jie1,Zhou Zilin1,Xu Renji2*
(1.College of Animal Science&Veterinary Medicine,Shenyang Agricultural University,Liaoning Shenyang 110866; 2.National Centre of Environmental Monitoring,Beijing 100012.)

Bacteriostatic efficacy of Acanthopanax senticosus polysaccharide(ASPS)on fecal escherichia coli in piglets with pullorum disease was examined by filter experiment method.The results showed that there were certain inhibitory effect on fecal escherichia coli in piglets with pullorum disease by ASPS with the most obvious bacteriostatic efficacy of 640 mg/mL ASPS and minimum inhibitory concentration of 160 mg/mL ASPS.The bacteriostatic ability of ASPS dose in 160,320 and 640 mg/mL of were 30.65%,32.26%and 35.28%respectively compared with levofloxacin.

Acanthopanax senticosus polysaccharide;Piglet;Escherichia coli;Antimicrobial activity

S828.5 < class="emphasis_bold"> 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

B

1672-9692(2016)05-0005-04

2016-03-17

韓杰（1978-），女，講師，博士，研究方向?yàn)閯?dòng)物生理的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控。

許仁驥（1978-），副研究員，主要從事環(huán)境污染的生物調(diào)控研究。

2014遼寧省博士科研啟動(dòng)基金計(jì)劃項(xiàng)目（20141061）。