蟾毒配基脂質(zhì)-蛋白雜化納米粒的制備及評(píng)價(jià)

李晚秋，林 霞，許 航，唐 星*

（1. 沈陽藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016； 2. 上海交通大學(xué) 藥學(xué)院，上海 200240；3. 沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016）

蟾毒配基脂質(zhì)-蛋白雜化納米粒的制備及評(píng)價(jià)

李晚秋1，林 霞2，許 航3，唐 星3*

（1. 沈陽藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016； 2. 上海交通大學(xué) 藥學(xué)院，上海 200240；3. 沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016）

目的采用攪拌超聲法制備蟾毒配基脂質(zhì)-蛋白雜化納米粒，延緩藥物的體外釋放。方法以單因素考察法優(yōu)化處方及制備工藝，并應(yīng)用透射電鏡觀察制劑形態(tài)，動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)定粒徑和 ζ-電位，差示掃描量熱法和 X-射線衍射法表征藥物在制劑中的存在形式，透析法考察納米粒及溶液劑中藥物的釋放行為。結(jié)果納米粒外觀圓整均勻，平均粒徑為(82.4 ± 28.5) nm，ζ-電位為-19.44 mV，藥物在制劑中以無定形態(tài)存在，與溶液劑相比，納米粒可顯著延緩藥物釋放，其釋放行為符合Weibull模型，釋放機(jī)制以擴(kuò)散為主。結(jié)論利用攪拌超聲法，以白蛋白和卵磷脂作為載體和穩(wěn)定劑制備的脂質(zhì)-蛋白雜化納米?？娠@著延緩蟾毒配基的體外釋放。

藥劑學(xué)；脂質(zhì)-蛋白雜化納米粒；攪拌超聲法；蟾毒配基；處方優(yōu)化；制備工藝；體外釋放

蟾酥為蟾 蜍 科 動(dòng) 物 中 華 大 蟾 蜍（ Bufo bufo gargarizans Cantor.）或黑眶 蟾 蜍（Bufo melanostictus Schneide）的耳后腺及 皮 膚腺分泌 的 白色漿液 經(jīng)加工干燥而成[1-2]，在臨床上表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性，其中發(fā)揮抗腫瘤作用的主要成分是脂溶性的蟾毒配基（bufadienolides）化合物，蟾毒靈（bufalin, B）、華蟾酥毒基（cinobufagin, C）和脂蟾毒配基（resibufogenin, R）是蟾毒配基中含量較高、活性較強(qiáng)的三種主要有效成分，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。研究表明，蟾毒配基B、C和R對(duì)消化系統(tǒng)腫瘤顯示出極強(qiáng)的細(xì)胞毒性，同時(shí)還具有鎮(zhèn)痛和增強(qiáng)免疫力的作用，可改善病人生存質(zhì)量，因此其在抗腫瘤方面顯示出巨大潛力。但目前上市的蟾酥制劑有效成分純度低，臨床需要?jiǎng)┝看螅颊唔槕?yīng)性差，且給藥后在體內(nèi)分布廣泛，消除迅速，可引起嚴(yán)重的心臟毒性和神經(jīng)毒性，使其應(yīng)用受限。因此有必要開發(fā)一種作用持久、高效、低毒的蟾毒配基新劑型，以降低毒性及不良反應(yīng)，充分發(fā)揮其抗腫瘤活性。

Fig. 1 Chemical structures of bufalin (B), cinobufagin (C) and resibufogenin (R)圖1 蟾毒靈（B）、華蟾酥毒基（C）和脂蟾毒配基（R）的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

近年來，一種新型納米給藥系統(tǒng)正逐漸引起人們的關(guān)注，即脂蛋白納米粒（lipoprotein-based nanoparticle）。脂蛋白具有天然球形結(jié)構(gòu)，其中甘油三酯與膽固醇酯構(gòu)成疏水核心，外層被磷脂及載脂蛋白包裹。脂蛋白作為藥物載體有如下優(yōu)勢(shì)：（1）生物相容性好，在血液中穩(wěn)定；（2）其疏水核心可包載一定量親脂性藥物，提高其溶解度和穩(wěn)定性；（3）一些腫瘤細(xì)胞過度表達(dá)低密度脂蛋白受體（LDLR），這為脂蛋白納米粒靶向腫瘤組織提供了可能性[3-4]。但是脂蛋白難以從人血清中大量提取[5]，目前全合成的脂蛋白也無法用作納米載體，且脂蛋白納米粒難以用于高脂血癥患者，使其應(yīng)用受限。

受脂蛋白結(jié)構(gòu)的啟發(fā)，本研究以藥物作為疏水核心，以卵磷脂和白蛋白作為載體和乳化劑，制備了蟾毒配基脂質(zhì)-蛋白雜化納米粒（bufadienolides-loaded lipid protein hybridization nanoparticles, BU-LP-NPs），擬通過腫瘤細(xì)胞過度表達(dá)LDLR的特性及腫瘤組織 本身特 有的EPR效 應(yīng)，實(shí)現(xiàn)藥物的腫瘤靶向。本文采用攪拌超聲法制備了BU-LP-NPs，并通過單因素考察法優(yōu)化了處方和制備工藝，最后對(duì)制劑的理化性質(zhì)及體外釋放進(jìn)行評(píng)價(jià)，初步解決蟾毒配基半衰期短、消除迅速的問題。

1 儀器與材料

超聲細(xì)胞破碎儀（Sonics & Meterials. INC.，USA），NicompTMPSS 380動(dòng)態(tài)光散射粒度測(cè)定儀（Santa Barbara, USA），DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器（鞏義英峪予華儀器廠），VirTis凍干機(jī)（SP Industries, NY，USA），N-1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化器械株式會(huì)社），ATL-124電子分析天平、PB-10精密pH計(jì)（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），Chromaster 5000高效液相色譜儀（日本日立公司），Amicon Ultra-0.5離心超濾管（美國millpore公司），雷勃爾LG16-C離心機(jī)（北京雷勃爾離心機(jī)有限公司），JEM-2100透射電鏡（JEOL, Tokyo, Japan），DSC-60差熱分析儀、TGA 50熱重分析儀（Shimadzu Co., Kyoto, Japan)，D/Max 2400 X-射線粉末衍射儀（日本理光公司），透析袋（截留分子質(zhì)量1.4×104u，上海綠鳥科技發(fā)展有限公司）。

蟾毒配基（自制，以主要成份B、C和R含量之和計(jì)，其純度質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99%，批號(hào) 20130118），人血白蛋白（蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司），注射用蛋黃卵磷脂PL-100M、PC-98T（上海艾維特公司），注射用蛋黃卵磷脂Lipoid E80?、Lipoid S-100（德國Lipoid?公司），大豆卵磷脂（上海太偉藥業(yè)有限公司），蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇、麥芽糖（天津博迪化工有限公司），海藻糖（南寧中諾生物工程有限責(zé)任公司），吐溫-80（上海申宇醫(yī)藥化工有限公司），乙腈、甲醇（色譜純，天津康科德試劑公司），其他試劑（分析純，市售）。

2 方法與結(jié)果

2.1 納米粒的制備

采用攪拌超聲法制備BU-LP-NPs。精密稱取蟾毒配基20 mg和蛋黃卵磷脂Lipoid E80 200 mg，置于西林瓶中，加入無水乙醇4 mL，超聲混勻，作為油相；配制pH值6.5的磷酸鹽緩沖液10 mL，加熱至60 ℃，作為水相。于400 r·min-1磁力攪拌下，將油相緩緩滴入水相中，滴完后繼續(xù)攪拌10 min，旋蒸除去乙醇，向得到的混懸液中加入白蛋白溶液1.0 mL，冰水浴中探頭超聲3 min（300 W，超聲3 s，間歇1 s），將混懸液用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，分裝，凍干，即得。

2.2 產(chǎn)率及包封率的測(cè)定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：HiQsil C18柱（250 mm × 4.6 mm, 5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-5 g·L-1磷酸二氫鉀溶液（體積比45∶55，用磷酸調(diào)節(jié)水相pH值為3.2）；檢測(cè)波長：296 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 產(chǎn)率的測(cè)定

精密量取過濾后的BU-LP-NPs 1.0 mL，置于50 mL量瓶中，加適量甲醇超聲溶解并定容，搖勻，濾過。取續(xù)濾液，以HPLC法進(jìn)樣分析，測(cè)得過膜后制劑中3個(gè)蟾毒配基的含量之和（Qn），投藥量計(jì)為Q，則產(chǎn)率（Yield, %）= Qn/Q × 100%。

2.2.3 包封率的測(cè)定

包封率（Entrapment efficiency, EE）是制劑處方工藝篩選及質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，且對(duì)制劑的穩(wěn)定性具有重要影響，因此本研究采用離心超濾法測(cè)定BU-LP-NPs的包封率。具體操作如下：

藥物總含量的測(cè)定： 精密量取BU-LP-NPs溶液1.0 mL，置于50 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解并定容，搖勻，濾過。取續(xù)濾液，用HPLC法測(cè)定納米粒中3個(gè)蟾毒配基的質(zhì)量濃度。

水相中藥物含量的測(cè)定： 精密量取BU-LP-NPs溶液0.5 mL，置于超濾管中，然后放在配套接收管內(nèi)，4 000 r·min-1離心20 min，取接收管內(nèi)的濾液進(jìn)樣分析，測(cè)定水相中3個(gè)蟾毒配基的質(zhì)量濃度。

其中：ρtotal為制劑中蟾毒配基總質(zhì)量濃度，Vtotal為制劑總體積，ρwater為水相中蟾毒配基的質(zhì)量濃度，Vwater為水相體積。

由于納米粒制備過程中，有機(jī)相最終被除去，因此Vwater≈Vtotal，包封率計(jì)算公式可簡化為：。

2.3 制備工藝的考察

2.3.1 制備工藝的選擇

為了制備粒徑較小、產(chǎn)率較高的BU-LP-NPs，作者主要比較了薄膜分散法和攪拌超聲法兩種制備工藝。工藝研究階段所用磷脂為Lipoid E80，固定其用量為20 g·L-1。

薄膜分散法：將處方量的蟾毒配基、卵磷脂和乙醇混合，超聲使溶解，作為油相。將油相置于茄形瓶中，旋蒸除去乙醇，得到均勻的磷脂薄膜。向茄形瓶中加入適量蒸餾水，水化30 min，向混懸液中加入人血清白蛋白（HSA），探頭超聲3 min，即得。

攪拌超聲法：取處方量的藥物、卵磷脂和乙醇，超聲混勻，作為油相。磁力攪拌下將油相緩緩滴入磷酸鹽緩沖液中，繼續(xù)攪拌10 min，旋蒸除去乙醇，向得到的混懸液中加入白蛋白，冰水浴中探頭超聲3 min，即得。

結(jié)果表明，采用薄膜分散法制備BU-LP-Nps時(shí)，形成的磷脂薄膜不均勻，水化后仍有少量磷脂復(fù)合物團(tuán)塊存在，即使超聲也難以使其分散均勻，使制得的納米粒中存在大粒子，粒度分布很寬，且重現(xiàn)性差；而攪拌超聲法制備的BU-LP-Nps粒徑小且分布均勻，產(chǎn)率較高，穩(wěn)定性好，其操作過程較薄膜分散法簡便，因此本研究采用攪拌超聲法制備BU-LP-Nps。

2.3.2 制備溫度的考察

磷脂存在相轉(zhuǎn)化溫度（phase inversion temperature, θPI），在此溫度下，磷脂聚集在油/水界面的傾向較大，乳化能力相對(duì)較強(qiáng)[6]，因此在相轉(zhuǎn)化溫度附近（約70 ℃）制備納米粒時(shí)粒徑較小，但溫度過高不利于磷脂及藥物的穩(wěn)定性，因此將制備溫度控制在 60 ℃，旋蒸除去乙醇后迅速冷卻，再加入HSA探頭超聲，可制得粒徑較小且穩(wěn)定的納米粒。

2.3.3 油相滴入速度的考察

分別將固定體積的油相以10、1.0及0.4 mL·min-1的速度用注射器加入水相中，其他制備條件固定，制備BU-LP-Nps。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：滴加速度為10 mL·min-1時(shí)，制得的納米粒粒度分布寬，且有大粒子存在，可能是由于短時(shí)間內(nèi)加入大量油相，形成較多新生界面，乳化劑與界面結(jié)合不充分，導(dǎo)致粒子聚集，產(chǎn)生大粒子；滴加速度為1.0及0.4 mL·min-1時(shí)，形成的納米粒粒徑相近（0.4 mL·min-1滴入時(shí)粒度分布稍寬），為減少藥物及磷脂的受熱時(shí)間，將油相滴入速度控制在1.0 mL·min-1。

2.3.4 攪拌速度的考察

將油相加入水相后，需以一定的速度攪拌，使兩相充分乳化。設(shè)定攪拌速度分別為200、 300、400和500 r·min-1，其他條件固定，制備BU-LP-Nps，分別測(cè)定其粒徑，結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，隨著攪拌速度增大，粒徑及粒度分布均變小，當(dāng)攪拌速度為500 r·min-1時(shí)，粒徑降低不明顯，且攪拌速度過大易引起液體濺出，影響乳化效果及產(chǎn)率，因此，將攪拌速度控制為400 r·min-1。

Fig. 2 The effect of stirring speed on the PSD of BU-LP-NPs.圖2 攪拌速度對(duì)蟾毒配基脂質(zhì)-蛋白雜化納米粒粒徑的影響

2.3.5 攪拌時(shí)間的考察

形成初乳后應(yīng)攪拌一定的時(shí)間，使兩相充分分散。但高溫條件下攪拌時(shí)間過長，會(huì)造成磷脂氧化、水解，且不利于藥物的穩(wěn)定，因此攪拌時(shí)間不宜過長。油相滴加完畢后，分別繼續(xù)攪拌10、15 和20 min，結(jié)果表明，攪拌時(shí)間對(duì)粒徑影響不大。因此，將攪拌時(shí)間確定為10 min。

2.3.6 超聲時(shí)間及功率的考察

固定超聲功率及其他制備條件，考察不同超聲時(shí)間對(duì)BU-LP-Nps粒徑的影響。分別將超聲時(shí)間設(shè)為3、5、7 和9 min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著超聲時(shí)間延長，粒徑及粒度分布均變大，超聲3 min的樣品4 ℃下放置3 d穩(wěn)定性良好，而超聲7和9 min的樣品4 ℃放置，1 d內(nèi)即有藥物析出，因此將超聲時(shí)間定為3 min。固定超聲時(shí)間，增大超聲功率，粒徑有降低的趨勢(shì)，但超聲功率在300 W以上時(shí)，粒徑降低不明顯且粒度分布變寬，而超聲功率過大對(duì)儀器的磨損也較大，因此確定超聲功率為300 W（超聲3 s，間歇1 s）。

2.4 處方篩選

2.4.1 磷脂種類的選擇

磷脂是人體的內(nèi)源性物質(zhì)，與生物膜結(jié)構(gòu)相似，具有良好的生物相容性，因此是脂質(zhì)-蛋白雜化納米粒的首選乳化劑[7]。固定磷脂及白蛋白的質(zhì)量濃度為20 g·L-1，其他制備條件不變，分別向油相中加入蛋黃卵磷脂PL-100M、Lipoid S-100、Lipoid E80、PC-98T及大豆卵磷脂（Lipoid TW），按“2.1”條方法制備BU-LP-NPs，考察磷脂種類對(duì)制劑外觀及粒徑的影響，結(jié)果見表1。

Table 1 The effect of lecithin type on the appearance and PSD of BU-LP-NPs表1 磷脂種類對(duì)蟾毒配基脂質(zhì)-蛋白雜化納米粒外觀和粒徑的影響

由表1可見，除PC-98T外，用其余磷脂制備的BU-LP-NPs外觀均良好，粒徑均較小，但只有用Lipoid E80時(shí)粒度分布較窄。為了使BU-LP-NPs長期穩(wěn)定儲(chǔ)存，最終需要將其凍干，因此在不加凍干保護(hù)劑的條件下，將用各種磷脂制備的BU-LP-NPs冷凍干燥，考察所選磷脂的凍干穩(wěn)定性，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，磷脂種類為Lipoid E80時(shí)，凍干產(chǎn)品外觀較好，凍干前后粒徑變化最小且復(fù)溶后透光性相對(duì)較好，因此將磷脂種類確定為Lipoid E80。

Table 2 The appearance and particle size of BU-LP-NPs containing different types of lecithin after lyophilization without cryoprotectant表2 含不同種類磷脂的蟾毒配基脂質(zhì)蛋白雜化納米粒（不加凍干保護(hù)劑）凍干后的外觀和粒徑

2.4.2 藥脂質(zhì)量比的考察

固定投藥量及其他制備條件，分別加入不同比例的Lipoid E80，使藥脂質(zhì)量比分別為1∶5、 1∶8和1∶10，制備BU-LP-NPs，考察不同藥脂質(zhì)量比對(duì)制劑粒徑及包封率的影響，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，隨著藥脂質(zhì)量比增大，粒徑及粒度分布均變小，3種蟾毒配基的包封率也隨之增大，且實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)藥脂質(zhì)量比為1∶8時(shí)制得的樣品室溫放置12 h后，有藥物析出，而藥脂比為1∶10時(shí)，所制樣品在室溫下放置3 d后未見藥物析出，且粒徑增大不明顯，因此將藥脂質(zhì)量比確定為1∶10。

Table 3 The effect of drug-lecithin ratio on the PSD and EE of BU-LP-NPs (n=3)表3 藥脂比對(duì)蟾毒配基脂質(zhì)-蛋白雜化納米粒粒徑和包封率的影響（n=3）

2.4.3 白蛋白質(zhì)量濃度的選擇

固定藥脂質(zhì)量比為1∶10，油水相體積比為1∶2.5，其他制備條件不變，分別在水相中加入不同體積的HSA（200 g·L-1），使其質(zhì)量濃度分別為0、5、10和20 g·L-1，制備BU-LP-NPs，考察白蛋白質(zhì)量濃度對(duì)制劑粒徑及產(chǎn)率的影響，結(jié)果見表4。由表4可見，隨著白蛋白質(zhì)量濃度增大，納米粒的粒徑及粒度分布均降低，產(chǎn)率隨之升高，當(dāng)HSA質(zhì)量濃度為20 g·L-1時(shí)，平均粒徑為(85.9 ± 32.6) nm（＜100 nm），產(chǎn)率可達(dá)到99.2%。而不加HSA時(shí)，將制劑在透射電鏡下觀察，粒子呈不規(guī)則球形，粒度分布不均勻且有聚集，難以形成納米粒。因此，白蛋白對(duì)BU-LP-NPs具有一定的空間穩(wěn)定作用，將形成的初乳探頭超聲時(shí)，大乳滴被分散成更多的小乳滴，加入適量白蛋白可穩(wěn)定新生成的界面，使粒子不易聚集，從而使粒度分布均勻，有利于制劑的長期穩(wěn)定，且白蛋白本身的表面活性作用可進(jìn)一步降低粒徑，從而提高BU-LP-NPs的產(chǎn)率。結(jié)果表明，HSA的質(zhì)量濃度為20 g·L-1時(shí)，納米粒的粒徑和產(chǎn)率均較理想，因此確定白蛋白的質(zhì)量濃度為2.0 g·L-1。

Table 4 The effect of HSA concentration on the PSD and yield of BU-LP-NPs (n=3)表 4 白蛋白質(zhì)量濃度對(duì)蟾毒配基脂質(zhì)-蛋白雜化納米粒粒徑和產(chǎn)率的影響（n=3）

2.4.4 油水比例的考察

固定藥脂質(zhì)量比為1∶10，白蛋白質(zhì)量濃度為20 g·L-1，分別取不同體積的無水乙醇與藥物、Lipoid E80混合，作為油相，使油相與水相體積比分別為1∶1.5、1∶2、1∶2.5和1∶10，其他條件不變，制備 BU-HSA-NPs，考察不同油水比例對(duì)制劑粒徑的影響，結(jié)果見圖 3。結(jié)果表明，油相比例過大或過小時(shí)，制劑粒徑均較大。若油相比例太大（1∶1.5），滴入速度不變時(shí)，則油相加入時(shí)間過長，使得各粒子乳化時(shí)間不同，導(dǎo)致粒度分布不均勻，使粒子易于聚集，則制劑粒徑較大；若油相比例過?。?∶10），則投藥量一定時(shí)，油相中藥物濃度過高，使得單個(gè)乳滴中所含藥物較多，旋蒸除去乙醇時(shí)，單個(gè)乳滴析出的藥物也較多，從而使粒徑增大。由圖3可見，當(dāng)油水比例為1∶2時(shí)，制劑粒徑最小，但粒度分布很寬，而為1∶2.5時(shí)，粒徑及粒度分布均較小，因此將油相與水相的體積比確定為1∶2.5。

Fig. 3 The effect of oil-aqueous phase volume ratio on the PSD of BU-LP-NPs.圖3 油水相體積比對(duì)蟾毒配基脂質(zhì)-蛋白雜化納米粒粒徑的影響

2.4.5 水相pH的考察

在預(yù)實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了pH值為6.0～8.0時(shí)，可制得較為穩(wěn)定的BU-LP-NPs，其粒徑隨pH值增大而降低，pH值為8.0時(shí)粒徑最小，pH值為6.5與7.0時(shí)粒徑相差不大，但蟾毒配基在堿性條件下不穩(wěn)定，因此不考慮堿性范圍。此外，文獻(xiàn)報(bào)道，大豆卵磷脂和蛋黃卵磷脂的水解受pH值影響，在pH 值6.5的緩沖液中其水解速率常數(shù)最小，從而使體系的pH值變化較小，進(jìn)一步抑制了磷脂的水解[8]。綜合考慮，選擇pH值6.5的PBS緩沖液作為水相。

2.5 冷凍干燥工藝的考察

2.5.1 凍干工藝的考察

BU-LP-NPs在貯存期間易出現(xiàn)粒子聚集、藥物滲漏等現(xiàn)象，且磷脂易氧化水解，使制劑穩(wěn)定性降低，導(dǎo)致應(yīng)用受限。采用冷凍干燥工藝將BU-LP-NPs固化，可有效解決這一問題，從而提高制劑的長期穩(wěn)定性，采用的凍干曲線如圖4所示。

2.5.2 凍干保護(hù)劑的篩選

冷凍干燥過程不利于脂質(zhì)-蛋白雜化納米粒結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，因?yàn)閮龈蛇^程中滲透壓的改變、冰晶的形成、相轉(zhuǎn)變及相分離等因素均會(huì)破壞磷脂的雙分子膜，使其折疊、融合、破裂，導(dǎo)致藥物滲漏[7]，因此在凍干前應(yīng)加入凍干保護(hù)劑，降低冷凍干燥對(duì)制劑的破壞作用，使納米粒復(fù)溶后的粒徑和形態(tài)無顯著變化。常用的凍干保護(hù)劑有單糖、二糖和多元醇等，本研究考察了蔗糖、海藻糖、乳糖、麥芽糖、葡萄糖、氯化鈉及甘露醇的凍干保護(hù)效果，比較凍干前后的粒徑變化、凍干制劑的外觀及水化后的透光性，以確定最佳凍干保護(hù)劑的種類和用量。

具體操作如下：取BU-LP-NPs混懸液2 mL8份，分別置于10 mL西林瓶中，分別加入上述凍干保護(hù)劑適量，乳糖的質(zhì)量濃度為50 g·L-1，其余的凍干保護(hù)劑質(zhì)量濃度為100 g·L-1，其中一份不加凍干保護(hù)劑，將樣品溶液置于凍干機(jī)中，按上述工藝?yán)鋬龈稍?。以凍干制劑的外觀、復(fù)溶后的粒徑、透光性及水化時(shí)間為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察各凍干保護(hù)劑的效果，結(jié)果見表5。

結(jié)果表明：未加凍干保護(hù)劑以及加入氯化鈉、葡萄糖凍干后的制劑外觀萎縮坍塌，復(fù)溶時(shí)間均超過90 s，且復(fù)溶后可見大量固體物質(zhì)，說明BU-LP-NPs的微觀結(jié)構(gòu)已經(jīng)被破壞，粒子之間發(fā)生聚集，產(chǎn)生了脂質(zhì)團(tuán)塊；以乳糖作為保護(hù)劑，凍干后的樣品外觀較好，有少量鱗狀結(jié)晶，但復(fù)溶后溶液呈乳濁狀，復(fù)溶時(shí)間長且透光性差；以甘露醇作為保護(hù)劑，凍干產(chǎn)品外觀良好，表面平整、飽滿，呈白色餅狀，但復(fù)溶后粒徑增大2倍，粒度分布顯著變寬，出現(xiàn)了粒子聚集；以蔗糖、海藻糖、麥芽糖作為保護(hù)劑時(shí)，凍干前后粒徑變化均較小，且復(fù)溶后透光性均較好，但三者之中加入海藻糖的制劑外觀最佳，復(fù)溶時(shí)間最短且粒度分布最窄，因此以100 g·L-1的海藻糖作為凍干保護(hù)劑。

Table 5 Effect of cryoprotectants on BU-LP-NPs in the freeze-drying.表5 凍干保護(hù)劑種類對(duì)蟾毒配基脂質(zhì)-蛋白雜化納米粒凍干過程的影響

2.6 BU-LP-NPs的制劑學(xué)性質(zhì)評(píng)價(jià)

2.6.1 形態(tài)觀察

采用透射電鏡（transmission electron microscopy，TEM）觀察BU-LP-NPs的粒子形態(tài)。具體操作如下：取BU-LP-NPs樣品溶液適量，加蒸餾水稀釋至適宜濃度，取適量，滴至覆有碳膜的銅網(wǎng)上，以濾紙吸去多余液體，待完全干燥后，用體積分?jǐn)?shù)2%磷鎢酸負(fù)染1 min，自然干燥后，在透射電鏡下觀察納米粒的形態(tài)，結(jié)果如圖5。由圖5可見，BU-LP-NPs呈圓整球形或類球形，粒度分布較均勻，粒子間未出現(xiàn)聚集。

Fig. 5 Transmission electron microscope (TEM) image of BU-LP-NPs (magnification 50 000×)圖5 蟾毒配基脂質(zhì)-蛋白雜化納米粒透射電鏡圖（放大倍數(shù) 50 000×）

2.6.2 粒徑及ζ-電位的測(cè)定

采用NicompTMPSS 380粒度/電位測(cè)定儀測(cè)定BU-LP-NPs的粒徑（圖6）和ζ-電位（圖7）。制劑的平均粒徑為 (82.4 ± 28.5) nm，PI為0.120，ζ-電位為-19.44 mV。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，由透射電鏡觀察到的粒徑比動(dòng)態(tài)光散射法（dynamic light scatter，DLS）測(cè)得的粒徑略小一些，這是由于采用 DLS法測(cè)定時(shí)，粒子外圍存在親水層，該法測(cè)得的是粒子的水化徑，而TEM制備樣品時(shí)的干燥過程以及測(cè)定時(shí)的高真空條件可使粒徑大幅度減小，從而導(dǎo)致兩種方法測(cè)得粒徑具有差異。

Fig. 6 The representative diagrams of Gaussian and Nicomp distribution of BU-LP-NPs圖6 蟾毒配基脂質(zhì)-蛋白雜化納米粒粒徑的高斯分布及尼康分布圖

Fig. 7 The typical diagram of ζ-potential of BU-LP-NPs圖7 蟾毒配基脂質(zhì)-蛋白雜化納米粒ζ-電位圖

2.6.3 藥物在制劑中的存在形式

藥物在載體中的存在狀態(tài)對(duì)制劑的穩(wěn)定性具有重要影響，因此有必要確證藥物在制劑中的存在形式。本研究采用差示掃描量熱法（differential scanning calorimetry, DSC）和X-射線衍射法（X-ray diffraction, XRD）考察蟾毒配基在脂質(zhì)-蛋白雜化納米粒中的存在狀態(tài)。

2.6.3.1 DSC分析

取適量樣品粉末，置于鋁盤中，以氧化鋁作為參比物，在氮?dú)饬髦幸?0 ℃·min-1的速率升溫掃描，升溫范圍為30→300 ℃。分別測(cè)定蟾毒配基、空白脂質(zhì)-蛋白雜化納米粒、蟾毒配基脂質(zhì)-蛋白雜化納米粒（BU-LP-NPs）、蟾毒配基與空白納米粒的物理混合物及凍干后的100 g·L-1海藻糖溶液樣品的DSC圖譜，結(jié)果見圖8。由圖8可見，蟾酥分離物在95.52、217.04和248.55 ℃分別存在一個(gè)平緩的吸熱峰，可能由3種蟾毒配基分別產(chǎn)生，空白納米粒在274.95 ℃存在一個(gè)吸熱峰，物理混合物在95.56、248.83和269.40 ℃存在3個(gè)極平緩的吸熱峰，分別可與蟾毒配基和空白納米粒的吸熱峰相對(duì)應(yīng)，但其中蟾毒配基的吸熱峰強(qiáng)度極弱，可能是由于混合物中蟾毒配基的比例過低或者測(cè)定過程中隨著溫度增加，藥物與磷脂、白蛋白形成復(fù)合物所致。海藻糖在 102.63、127.17、201.35和259.22 ℃存在4個(gè)較為尖銳的吸熱峰，而BU-LP-NPs僅在274.71 ℃處具有空白納米粒的吸熱峰，峰位和峰形基本沒有變化，藥物與海藻糖的吸熱峰均消失。結(jié)果表明，蟾毒配基在脂質(zhì)-蛋白雜化納米粒中可能以無定形狀態(tài)存在。

Fig. 8 DSC of bufadienolides (a), lyophilized blank nanoparticle (b), lyophilized BU-LP-NPs with 100 g·L-1trehalose (c), physical mixture of bufadienolides and blank nanoparticle (d) and 100 g·L-1trehalose solution after lyophilization (e)圖8 蟾毒配基(a)、凍干后的空白納米粒(b)、凍干后的蟾毒配基脂質(zhì)-蛋白雜化納米粒(含100 g·L-1海藻糖) (c)、蟾毒配基和空白納米粒的物理混合物(d)及100 g·L-1海藻糖溶液凍干物(e)的DSC圖譜

2.6.3.2 XRD分析

為了進(jìn)一步考察藥物在納米粒中的存在形態(tài)，對(duì)凍干后的粉末樣品進(jìn)行X-射線粉末衍射分析。測(cè)定條件：CuKa石墨單色器，管壓40 kV，管流30 mA，掃描速度4°·min-1，掃描步長0.03°，掃描范圍（2θ）為0°～50°，測(cè)定結(jié)果見圖9。由圖9可見，蟾毒配基顯示出較弱的衍射峰，空白納米粒圖譜呈現(xiàn)出典型的無定形衍射峰，物理混合物的圖譜中同時(shí)存在蟾毒配基和空白納米粒的衍射峰，強(qiáng)度均較弱，是二者衍射圖譜的簡單疊加。BU-LP-NPs衍射圖譜中，蟾毒配基的衍射峰完全消失，而空白納米粒的衍射峰基本沒有變化，表明蟾毒配基在脂質(zhì)-蛋白雜化納米粒中以無定形狀態(tài)存在，這與DSC的測(cè)定結(jié)果是一致的。

Fig. 9 XRD diffractogram of bufadienolides (a), lyophilized blank nanoparticle (b), lyophilized BU-LP-NPs with 100 g·L-1trehalose (c) and physical mixture of bufadienolides and blank nanoparticle (d)圖9 蟾毒配基(a)、凍干后的空白納米粒(b)、凍干后的蟾毒配基脂質(zhì)-蛋白雜化納米粒 ( 含100 g·L-1海藻糖 ) (c)、蟾毒配基和空白納米粒的物理混合物(d)的X-射線衍射圖譜

2.6.4 體外釋放特性考察

納米給藥系統(tǒng)體外釋放常用的研究方法有透析法、流通池法和反向動(dòng)態(tài)透析法等[4]?？紤]到透析法操作簡便，且預(yù)試驗(yàn)已證明透析袋對(duì)蟾毒配基無吸附作用，因此采用動(dòng)態(tài)膜透析法對(duì)BU-LP-NPs及蟾毒配基的500 g·L-1乙醇溶液（BU-S）進(jìn)行體外釋放度研究。蟾毒配基為水難溶性藥物，為滿足漏槽條件，需要在釋放介質(zhì)中加入有機(jī)溶劑，但加入過多有機(jī)溶劑與人體生理環(huán)境不符，因此在pH 值7.4的PBS緩沖液中加入2 g·L-1吐溫-80作為釋放介質(zhì)。

操作方法：精密量取BU-LP-NPs和BU-S各2.0 mL，分別置透析袋（截留分子質(zhì)量1.4×104u）中，兩端用麻繩系緊，置于250 mL具塞錐形瓶中，加入100 mL釋放介質(zhì)。將錐形瓶置于(37±0.5) ℃的恒溫水浴振蕩器中，100 r·min-1振蕩，分別于0.5、1、2、4、6、8、12、24、36、48和72 h取樣100 μL，并補(bǔ)加同體積的釋放介質(zhì)，將取出的介質(zhì)用HPLC法進(jìn)樣分析，計(jì)算BU-LP-NPs和BU-S在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的累計(jì)釋藥百分比（Q），結(jié)果見圖10、11。

Fig. 10 The release profiles of B, C and R from BU-LP-NPs in pH 7.4 PBS containing 2 g·L-1tween-80圖10 納米粒中的3種蟾毒配基（B,C,R）在pH7.4值磷酸鹽緩沖液（含2 g·L-1吐溫-80）中的釋放曲線

Fig. 11 The release profiles of B, C and R from BU-S in pH7.4 PBS containing 2 g·L-1tween-80圖11 蟾毒配基溶液中的3種蟾毒配基（B,C,R）在pH值7.4磷酸鹽緩沖液（含2 g·L-1吐溫-80）中的釋放曲線

由圖10、11可見，BU-LP-NPs和BU-S在0.5 h內(nèi)藥物的釋放量均小于40%，未出現(xiàn)突釋現(xiàn)象，且2種制劑中蟾毒配基的釋放速度均為C＞B＞R。制劑中的3種蟾毒配基在24 h時(shí)釋放均已達(dá)到平臺(tái)期，基本釋放完全，而BU-S中的3種蟾毒配基在8 h時(shí)已基本釋放完全，釋放量分別為92.46%、100%和86.36%，表明BU-LP-NPs可延緩藥物的體外釋放。

將BU-LP-NPs的釋放曲線分別用一級(jí)、Higuchi、Weibull和Ritger-Peppas方程擬合，其中Weibull方程的擬合度最好，蟾毒配基B、C和R的擬合方程及相關(guān)系數(shù)見表6。結(jié)果表明，BU-LP-NPs中藥物的釋放符合Weibull釋放模型，其釋放特征為初始階段的快速釋放及后期的緩慢釋放，釋放機(jī)制以擴(kuò)散為主。

Table 6 The regression equation of B, C and R release rate from BU-LP-NPs in vitro表6 納米粒中的三種蟾毒配基（B,C,R）體外釋放曲線的回歸方程

3 討論

3.1 包封率測(cè)定方法的選擇

目前測(cè)定納米粒包封率的方法有多種，如葡聚糖凝膠柱色譜法、透析法、超速離心法、離心超濾法等，其原理都是利用一定的方法使游離藥物與被包封藥物分離，測(cè)定游離或包封藥物的濃度，計(jì)算包封率。但凝膠柱色譜法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，可導(dǎo)致納米粒的稀釋，不易觀察混濁現(xiàn)象，且使藥物濃度過低而難以檢測(cè)；透析法操作時(shí)間長且稀釋倍數(shù)大，透析過程中可能出現(xiàn)被包封藥物泄漏的現(xiàn)象；超速離心法由于其離心力巨大，納米粒易被破壞，使被包封的藥物進(jìn)入上清液，且小粒徑納米粒難以完全沉淀，使上清液中藥物濃度偏高，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確。實(shí)驗(yàn)過程中曾采用超速離心法（5×104r·min-1, 2 h）測(cè)定納米粒的包封率，但納米粒難以完成沉淀，使測(cè)得的結(jié)果偏低。離心超濾法由于超濾管的合理設(shè)計(jì)，可實(shí)現(xiàn)游離藥物與納米粒的有效分離，且操作簡便、快速、離心力較小，不會(huì)造成納米粒破碎，因此適于蟾毒配基蛋白納米粒包封率的測(cè)定。

3.2 粒徑及粒度分布的控制

當(dāng)溶液中的微粒小于1 μm時(shí)，粒子的飽和溶解度受粒徑大小影響，即大粒子溶解度小，而小粒子溶解度大，導(dǎo)致小粒子逐漸溶解同時(shí)大粒子逐漸變大，該現(xiàn)象稱為奧斯特熟化（Ostwald ripening）。為了避免該現(xiàn)象，體系的粒度分布應(yīng)較窄。作者所制備的BU-LP-NPs粒徑及粒度分布均較小，可較好的避免奧斯特熟化現(xiàn)象，這可能是由于磷脂與白蛋白均可顯著降低粒子的表面張力，在粒子表面形成牢固的乳化膜，較少藥物的滲漏，從而抑制奧斯特熟化現(xiàn)象，且白蛋白在油水界面處構(gòu)象伸展，具有一定的空間穩(wěn)定作用，抑制了粒子間的聚集[9]，從而保證BU-LP-NPs具有較好的穩(wěn)定性。

3.3 凍干保護(hù)劑的選擇

實(shí)驗(yàn)中考察的系列凍干保護(hù)劑中，海藻糖的凍干保護(hù)效果最好，可能與其結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)有關(guān)。海藻糖為非還原性二糖，可在冷凍干燥及低滲條件下保護(hù)生物膜及蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能，對(duì)蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)起到穩(wěn)定作用[10]。文獻(xiàn)報(bào)道，海藻糖為環(huán)狀結(jié)構(gòu)，可與納米粒的極性基團(tuán)結(jié)合，形成致密的保護(hù)層，與鏈狀分子相比，其空間抵抗力更大，因此可有效抑制粒子的聚集[11-12]。另外，海藻糖水溶液在凍干過程中不會(huì)析出晶體，而是形成黏度較大的玻璃態(tài)后固化，在納米粒間提供無定形基質(zhì)，其無定形態(tài)可維持囊泡的流動(dòng)狀態(tài)并降低囊泡表面張力，且可防止磷脂膜融合以及冰晶的形成對(duì)磷脂膜的機(jī)械破壞[13-14]；同時(shí)海藻糖可與磷脂的極性基團(tuán)形成氫鍵，代替水與磷脂間的氫鍵，使納米粒嵌入海藻糖基質(zhì)內(nèi)部，從而保持納米粒的形態(tài)與粒徑[15]。

3.4 藥物存在的形式

由DSC及XRD圖譜推斷，蟾毒配基在納米粒中以無定形態(tài)被磷脂及白蛋白包裹。這可能是由于在旋蒸除去乙醇的階段，溶解在乙醇中的蟾毒配基隨著乙醇的蒸發(fā)不斷析出，而磷脂的包繞作用及空間穩(wěn)定作用抑制了蟾毒配基藥物結(jié)晶的形成，從而使蟾毒配基在凍干制劑中以無定形態(tài)存在[16]，并且在長期儲(chǔ)存過程中可抑制蟾毒配基由無定形向結(jié)晶態(tài)轉(zhuǎn)化，有利于提高制劑在儲(chǔ)存過程中的穩(wěn)定性。

4 結(jié)論

作者采用攪拌超聲法制備了BU-LP-NPs，并單因素考察了處方及制備工藝，以最優(yōu)處方及工藝制備的納米粒外觀圓整、粒徑較小且分布均勻、產(chǎn)率及包封率均較高。確定了凍干工藝并以100 g·L-1海藻糖作為凍干保護(hù)劑，凍干產(chǎn)品復(fù)溶迅速，透光性好，且凍干前后粒徑無明顯變化。DSC及 X-射線結(jié)果顯示，蟾毒配基在制劑中以無定形態(tài)存在，體外釋放實(shí)驗(yàn)表明，BU-LP-NPs無突釋效應(yīng)，且可顯著延緩藥物的釋放，制劑中3種蟾毒配基的釋放均符合Weibull模型，釋放機(jī)制以擴(kuò)散為主。

[1] KRENN L, KOPP B. Bufadienolides from animal and plant sources[J]. Phytochemistry, 1998, 48(1): 1-29.

[2] STEYN P S, VAN HEERDEN F R. Bufadienolides of plant and animal origin[J]. Nat Prod Rep, 1998, 15(4): 397-413.

[3] LACKO A G, NAIR M, PROKAI L, et al. Prospects and challenges of the development of lipoprotein-based formulations for anti-cancer drugs[J]. Expert Opin Drug Deliv, 2007, 4(6): 665-675.

[4] KADER A, PATER A. Loading anticancer drugs into HDL as well as LDL has little affect on properties of complexes and enhances cytotoxicity to human carcinoma cells[J]. Journal of Controlled Release, 2002, 80(1-3): 29-44.

[5] RENSEN P C N, DE VRUEH R L A, KUIPER J, et al. Recombinant lipoproteins: lipoprotein-like lipid particles for drug targeting[J]. Advanced Drug Delivery Reviews, 2001, 47(2-3): 251-276.

[6] 蘇德森, 王思玲. 物理藥劑學(xué)[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2004：372-373.

[7] GAO H, CAO S, CHEN C, et al. Incorporation of lapatinib into lipoprotein-like nanoparticles with enhanced water solubility and anti-tumor effect in breast cancer[J]. Nanomedicine, 2013, 8(9): 1429-1442.

[8] GRIT M, UNDERBERG W J, CROMMELIN D J. Hydrolysis of saturated soybean phosphatidylcholine in aqueous liposome dispersions[J]. J Pharm Sci, 1993, 82(4): 362-366.

[9] 張輝, 霍美蓉, 周建平, 等. 伊曲康唑白蛋白納米混懸劑的制備和表征[J]. 中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 39(6): 510-514.

[10] MILLER D P, ANDERSON R E, DE PABLO J J. Stabilization of lactate dehydrogenase following freeze thawing and vacuum-drying in the presence of trehalose and borate[J]. Pharm Res, 1998, 15(8): 1215-1221.

[11] ZHANG L, LIU L, QIAN Y, et al. The effects of cryoprotectants on the freeze-drying of ibuprofen-loaded solid lipid microparticles (SLM)[J]. Eur J Pharm Biopharm, 2008, 69(2): 750-759.

[12] 李芳. 蟾毒配基靜脈注射載藥系統(tǒng)的研究[D]. 沈陽：沈陽藥科大學(xué), 2010: 25-30.

[13] MIYAJIMA K. Role of saccharides for the freeze-thawing and freeze drying of liposome[J]. Advanced Drug Delivery Reviews, 1997, 24(2/3): 151-159.

[14] CHEN C, HAN D, CAI C, et al. An overview of liposome lyophilization and its future potential[J]. Journal of Controlled Release, 2010, 142(3): 299-311.

[15] WANG D Q, HEY J M, NAIL S L. Effect of collapse on the stability of freeze-dried recombinant factor VIII and alpha-amylase [J]. J Pharm Sci, 2004, 93(5): 1253-1263.

[16] SIGFRIDSSON K, FORSSEN S, HOLLANDER P, et al. A formulation comparison, using a solution and different nanosuspensions of a poorly soluble compound[J]. Eur J Pharm Biopharm, 2007, 67(2): 540-547.

Preparation and in vitro evaluation of bufadienolides-loaded lipid protein hybridization nanoparticles

LI Wanqiu1, LIN Xia2, XU Hang3, TANG Xing3*
(1. College of traditional Chinese Materia medica, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China; 2. School of Pharmacy, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China; 3. School of Pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China)

ObjectiveThe purpose of this study was to prepare bufadienolides-loaded lipid protein hybridization nanoparticles (BU-LP-NPs) by mixing ultrasonic method and to investigate whether the nanoparticles could delay the release of bufadienolides.MethodsSingle-factor experiments were applied to optimize the formulation and preparation process. Moreover, transmission electron microscopy was used to observe the morphology of nanoparticle and dynamic light scattering (DLS) method was employed to determine particle size and ζ-potential. Besides, the dispersion state of drugs in the formulation was characterized by differential scanning calorimetry (DSC) and X-ray diffraction method. The release behavior of drugs in BU-LP-NPs and bufadienolides solution (BU-S) was evaluated by dialysis method.ResultsBU-LP-NPs was round, and uniform with mean particle size of (82.4 ± 28.5) nm and ζ-potential of -19.44 mV. Drugs in formulation existed in amorphous form. Compared with BU-S, BU-LP-NPs had a significant performance of delaying the release of bufadienolides. The in vitro release of bufadienolides in BU-LP-NPs followed Weibull model and the releasing mechanism was primarily diffusion.ConclusionsThe lipid protein hybridization nanoparticles, prepared by mixing ultrasonic method, with endogenous HSA and egg lecithin as primary carriers and stabilizing agents, can significantly delay the in vitro release of bufadienolides.

Pharmaceutics; lipid protein hybridization nanoparticles; mixing ultrasonic method; bufadienolides; formulation optimization; preparation process; in vitro release

(本篇責(zé)任編輯：趙桂芝)

R94

：A

（2016）05-0160-15

10.14146/j.cnki.cjp.2016.05.003

2015-05-22

李晚秋(1988-), 女(漢族), 河北秦皇島人, 碩士研究生,E-maillwq96@126.com；＊

唐星(1964- ), 男(漢族), 陜西商縣人, 教授, 博士, 博士生導(dǎo)師, 主要從事口服微粒緩控釋制劑和中藥現(xiàn)代化研究,Tel.024-23986343,E-mailtangpharm@sina.com。