從唾液中提取脫氧核糖核酸擴(kuò)增血紅蛋白β基因*

楊文杰，韓麗紅，秦文斌

(1.包頭醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，內(nèi)蒙古包頭 014060；2.包頭醫(yī)學(xué)院基因診斷研究所；3.包頭醫(yī)學(xué)院血紅蛋白研究室)

?

從唾液中提取脫氧核糖核酸擴(kuò)增血紅蛋白β基因*

楊文杰1，韓麗紅2,3，秦文斌2,3

(1.包頭醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，內(nèi)蒙古包頭 014060；2.包頭醫(yī)學(xué)院基因診斷研究所；3.包頭醫(yī)學(xué)院血紅蛋白研究室)

目的：探索一種對(duì)人體無(wú)害、無(wú)痛、操作簡(jiǎn)便的獲取基因組脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)的方法。方法：從唾液中提取基因組DNA，應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增血紅蛋白β基因，采用含溴乙錠的瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果：從唾液中提取基因組DNA能夠擴(kuò)增出血紅蛋白β基因。結(jié)論：唾液作為獲取基因組脫氧核糖核酸的簡(jiǎn)易來(lái)源，取樣方法簡(jiǎn)便、快捷，更適用于疾病研究中大規(guī)模群體篩查。

基因組脫氧核糖核酸；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；唾液

人的體液攜帶大量信息，其中血、尿、腦脊液已經(jīng)廣泛運(yùn)用于檢測(cè)人體的健康水平和診斷疾病。使用唾液作為檢測(cè)工具可追溯到上世紀(jì)60年代，早期檢測(cè)缺乏準(zhǔn)確性和標(biāo)準(zhǔn)性，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)及基因組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，唾液中重要成分的發(fā)現(xiàn)以及唾液收集方法的改進(jìn)，使得唾液成為疾病檢測(cè)的工具成為可能。唾液具有取樣方便且安全無(wú)創(chuàng)傷，可反復(fù)采集提取等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)疾病的早期診斷、早期治療及預(yù)后監(jiān)測(cè)具有重要的實(shí)用價(jià)值，并可方便地用于對(duì)高危人群的普查篩選[1]。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，為最常用的分子生物學(xué)技術(shù)之一。PCR能快速特異擴(kuò)增任何已知目的基因或DNA片段，并能輕易地將DNA混合物中皮克水平的目的基因大量擴(kuò)增，從而達(dá)到納克、微克、毫克級(jí)的特異性脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)片段。因此，PCR技術(shù)一經(jīng)問(wèn)世就被迅速而廣泛地用于分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。它不僅可以用于基因的分離、克隆和核苷酸序列分析，還可以用于突變體和重組體的構(gòu)建，基因表達(dá)調(diào)控的研究，基因多態(tài)性的分析，遺傳病和傳染病的診斷，腫瘤機(jī)制的探索，法醫(yī)鑒定等諸多方面。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用PCR技術(shù)從人群唾液樣本中提取基因組DNA，應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增β珠蛋白基因片段，探索一種對(duì)人體無(wú)害、無(wú)痛、操作簡(jiǎn)便的獲取基因組DNA的方法。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本的采集 囑樣本提供者在提取唾液前30 min內(nèi)，勿進(jìn)食、飲水、吸煙或嚼口香糖。在吐唾液之前，放松臉頰，輕揉30 s以產(chǎn)生唾液。向唾液樣本采集管中輕輕地吐入口腔內(nèi)分泌的唾液，收集唾液時(shí)應(yīng)注意盡量避免出現(xiàn)過(guò)多的泡沫。

1.2儀器 PCR儀、臺(tái)式高速離心機(jī)、電泳儀、電泳槽、微量移液器、紫外燈檢測(cè)儀、微波爐。

1.3試劑 裂解液(由包頭醫(yī)學(xué)院基因診斷研究所秦文斌教授提供)、10 mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH 8.3)、50 mmol/L氯化鉀、2 mmol/L氯化鎂,10 mmol/L硫酸銨、4種脫氧核糖核酸各200 μmol/L、10 mg/mL溴乙錠、電泳緩沖液、Taq DNA聚合酶、液體石臘、瓊脂糖、去離子水。

1.4方法

1.4.1從唾液中提取基因組DNA 取0.1 mL唾液加入到EP管中，2 000 轉(zhuǎn)/min離心10 min,棄上清。加入裂解液60 μL，劇烈震蕩2 min，沸水浴中煮沸10 min，12 000 轉(zhuǎn)/min離心10 min，上清液中即含有基因組DNA。

1.4.2PCR擴(kuò)增 以血紅蛋白β基因?yàn)槟０遄孕性O(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增Hbβ基因的400 bpDNA片段。引物l：5’-AAG GAG ACC AAT AGA AAC TGG GC-3’；引物2：5’-TCT CCC CTT CCT ATG ACA TGA AC-3’。向20 μL PCR反應(yīng)液中加入5 μL模板，反應(yīng)總體積為25 μL?；靹螂x心后后加入液體石臘1滴。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性2 min；35個(gè)循環(huán)(94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s)；72 ℃延伸10 min。

1.4.3擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè) 將凝膠托架兩端封閉，水平放置在工作臺(tái)上，放上梳子。用0.5×電泳緩沖液配制1.5 %瓊脂糖凝膠，加熱溶解后灌入凝膠板中。待凝膠凝固后，小心拔出梳子。將托架放入電泳槽中，加入0.5×TBE緩沖液，使之沒(méi)過(guò)膠面2 mm，拔出梳子。向PCR產(chǎn)物中加入5 μL載樣緩沖液，混勻，取10 μL加入凝膠樣品孔中。蓋上電泳槽，接通電源，樣品端接陰極，電泳15～20 min(電壓100 V)。在紫外燈(波長(zhǎng)302 nm)下觀察電泳結(jié)果。

2 結(jié)果

從唾液中提取基因組DNA，應(yīng)用PCR技術(shù)能夠擴(kuò)增出血紅蛋白β基因。見圖1。

3 討論

唾液中含有豐富的DNA，是樣品采集的優(yōu)質(zhì)來(lái)源。唾液樣本采集是一種對(duì)人體無(wú)害、無(wú)痛的獲取DNA的方法。該法不會(huì)對(duì)被收集者造成任何不適，容易被接受，因而能最大限度地?cái)U(kuò)大基因研究的取樣范圍，特別適合分子流行病學(xué)的大規(guī)模人群樣本采集。常溫下唾液樣本DNA可以保存多年，綠色環(huán)保，攜帶方便。唾液作為全身體液的一種，不僅含有多種蛋白質(zhì)，還含有核糖核酸、DNA、脂肪酸以及各種微生物等。

本實(shí)驗(yàn)中利用裂解液從唾液中提取基因組DNA，方法簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，用時(shí)短，結(jié)果好。使用唾液作為診斷體液，具有收集簡(jiǎn)便、無(wú)創(chuàng)、費(fèi)用低廉等諸多優(yōu)點(diǎn)。人的體液攜帶大量蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì)。近年來(lái)，使用血液作為診斷體液，通過(guò)高通量生物質(zhì)譜技術(shù)研究疾病蛋白質(zhì)組學(xué)、尋找疾病標(biāo)志物已經(jīng)得到廣泛研究[2]。應(yīng)用基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)新手段，對(duì)唾液中的蛋白質(zhì)、核酸、微生物進(jìn)一步進(jìn)行研究，有望找到實(shí)用的相關(guān)診斷和治療的標(biāo)志物。隨著技術(shù)的不斷創(chuàng)新和研究的繼續(xù)深入，可以預(yù)見唾液作為檢測(cè)工具與血液相比具有安全、無(wú)創(chuàng)、數(shù)量充足、可持續(xù)獲取等優(yōu)勢(shì)，適用于龐大的群體篩查[3]。

[1] 陳嘉昌,張紅宇,彭瑾瑜,等.從唾液獲取人體DNA的簡(jiǎn)易方法與應(yīng)用[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)科學(xué)版),2006,27(S2):171-173.

[2] 陳婷,吳補(bǔ)領(lǐng),高杰,等.口腔微生物宏基因組學(xué)總DNA制備的方法學(xué)初探[J].臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志,2011,27(3):144-147.

[3] Loo JA,Yan W,Ramachandran P,et al.Comparative human salivary and plasma proteomes[J].J Dent Res,2010,89(10):1016-1023.

投 稿 須 知

本刊為方便作者及稿件處理，歡迎通過(guò)本刊電子郵箱投稿。為加快稿件處理速度，請(qǐng)作者在

稿件中注明聯(lián)系電話及電子郵箱。投稿前請(qǐng)先致電垂詢，切勿輕信虛假網(wǎng)站信息。

稿件文檔格式及聯(lián)系方式：

格式：采用Word文檔電子文稿格式

電話：0472-7167860 15124800067 (張老師)

電子郵箱：1596888637@qq.com

Amplification of hemoglobin β gene by DNA extracted from saliva

YANG Wenjie1, HAN Lihong2,3, QIN Wenbin2,3

(1.BiochemistryTeachingandResearchSectionofBaotouMedicalCollege,Baotou014040,China;2.GeneticDiagnosisInstituteofBaotouMedicalCollege,Baotou014040,China; 3.HemoglobinLaboratoryofBaotouMedicalCollege,Baotou014040,China)

Objective:To explore a harmless, painless and easily-operated method for genomic deoxyribonucleic acid (DNA). Methods:Genomic DNA was extracted from saliva. Polymerase chain reaction (PCR) was applied to amplify hemoglobin β gene, and the amplification products were identified by agarose gel electrophoresis containing ethidium bromide. Results:The genomic DNA extracted from saliva can amplify the hemoglobin β gene. Conclusion:Saliva is a simple source of genomic DNA. The method is simple and fast, and may be used for screening on a large scale.

Genome deoxyribonucleic acid (DNA); Polymerase chain reaction; Saliva

包頭市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015S2004-8),包頭醫(yī)學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(BSJJ201605)

秦文斌

2016-06-15)